L’ochratoxine A (OTA) est une mycotoxine issue du métabolisme secondaire des champignons filamenteux appartenant aux genres Penicillium et Aspergillus. Cependant, Aspergillus carbonarius est le majeur producteur de l’OTA sur les raisins. L’OTA a été retrouvée dans différents types de denrées alimentaires ainsi que lesurs produits dérivés. Le profil toxicologique de l’OTA due aux effets néfastes qu’elle présente sur la santé humaine et animale (effets hépatotoxiques, immunotoxiques, génotoxiques, tératogènes et cancérogènes) a conféré à cette mycotoxine une attention majeure auprès des instances internationales afin de limiter son occurrence. Ce projet est dédié pour trouver un moyen de lutte biologique, pouvant réduire l’OTA produite par A. carbonarius d’une part, et détoxifier les matrices alimentaires non conformes aux normes d’une autre part. La première stratégie était d’employer des huiles essentielles (cardamome, céleri, cannelle, taramira, origan, feuille de laurier, cumin, fenugrec, mélisse, menthe, sauge, anis, camomille, fenouil, romarin, romarin et thym) ainsi que des composés phénoliques extraits de plantes médicinales (feuille de laurier, cumin, fenugrec, mélisse, menthe, sauge, anis, camomille, fenouil, romarin et thym) afin d’évaluer leur effet sur la production de l’OTA dans le milieu SGM. Cette approche a été complétée par une étude moléculaire dans le but d’évaluer l’expression des gènes de biosynthèse de l’OTA (acpks, acOTApks et acOTAnrps) ainsi que les gènes de régulation (veA et laeA) chez A. carbonarius. Les résultats ont décelé que les huiles essentielles ont une activité fongicide plus élevée que celle des extraits phénoliques. Effectivement, les huiles essentielles du thym, de l’origan, du taramira, et de la cannelle ont bloqué complètement la croissance d’A. carbonarius. Cependant, les huiles essentielles du fenouil, de la cardamome, de l’anise, de la camomille, du céleri et du romarin ont réduit l’OTA sans autant affecter la croissance fongique. Le mode d’action de ces dernières a été mis en évidence en suivant l’expression des gènes acpks, acOTApks, acOTAnrps, veA et laeA, impliqués dans la biosynthèse de l’OTA chez A. carbonarius. Le gène acpks a été réprimée le plus (99.2%) quand A. carbonarius a été mis en culture avec 5 µL/mL du fenouil, entrainant ainsi une réduction de 88.9% de l’OTA. La deuxième stratégie était de développer un moyen de lutte biologique pouvant détoxifier les matrices alimentaires contaminées. Cette méthodologie a été développée suite à l’utilisation de sept souches d’actinobactéries (AT10, AT8, SN7, MS1, ML5, G10 et PT1), en évaluant leur capacité à métaboliser l’OTA, adhérer cette toxine à leur paroi membranaire ainsi que leur effet sur l’expression des gènes impliqués dans la biosynthèse de l’OTA chez A. carbonarius (acpks, acOTApks, acOTAnrps, veA et laeA). Les résultats ont montré que toutes les souches possèdent la capacité d’adhérer l’OTA à leur surface, notamment la souche SN7 qui a réduit 33% de l’OTA après 60 minutes d’incubation dans une solution PBS (Phosphate Buffer Solution) non nutritive. Les souches AT10 et SN7 ont métabolisé 51.94 et 52.68% de l’OTA ajoutée au milieu ISP2 (International Streptomyces Project-2) après 5 jours de culture à 28 °C. Cependant, les souches MS1, ML5 et G10 étaient les seules à avoir un effet sur l’expression des gènes de biosynthèse de l’OTA chez A. carbonarius. Effectivement les gènes acpks, acOTApks et acOTAnrps ont été réprimé respectivement de 37.1, 23.9 et 21% par MS1, de 39, 23 et 11.1% par ML5 et de 39, 18.3 et 11.1% par la souche G10. Ce projet a mis en valeur la capacité des extraits naturels (composés phénoliques et huiles essentielles) et des actinobactéries à prévenir d’une part la production de l’OTA et d’autre part réduire ses taux, sans pourtant affecter l’équilibre naturel ni engendrer l’apparition des débris toxiques dans les aliments traités.

La détection rapide et sensible des agents pathogènes est d’une très grande importance pour la biosécurité. Les biopuces sont bien adaptées à cet effet, car elles permettent la détection multiplexe des cibles. Une limitation cruciale des biopuces est leur manque de fiabilité et de sensibilité. L’objectif de cette thèse est de développer une architecture reproductible de biopuces à base de couche mince de silicium amorphe carboné (a-SiC:H) déposée sur un réflecteur en aluminium pour une détection fiable et sensible des pathogènes. Nous avons choisi comme système modèle l’interaction de la toxine alimentaire ochratoxine A (OTA) avec son aptamère AntiOTA de longueur 36mer. Les aptamères (simples brins d’ADN) sont de plus en plus utilisés comme sondes en raison de leur grande spécificité et affinité vis-à-vis d’une large gamme de cibles (i.e. protéines, bactéries…). La stratégie de fabrication consiste en un greffage de monocouches organiques d’acides carboxyliques via des liaisons Si-C robustes, suivi de l’accrochage covalent des aptamères par un couplage peptidique. Les processus de greffage ont été mis au point sur silicium cristallin permettant la quantification des couches greffées par spectroscopie infrarouge en mode ATR (Attenuated total reflexion). La quantification IR des interactions OTA – AntiOTA a été montrée pour la première fois sur des surfaces par IR-ATR. La spécificité de l’aptamère a été démontrée en utilisant une molécule chimiquement similaire (warfarin), pour laquelle l’AntiOTA ne montre aucune affinité. Ces protocoles bien contrôlés ont été transférés sur l’architecture de la biopuce a-SiC:H. Les aptamères immobilisés sont hybridés avec des brins complémentaires marqués avec des fluorophores. En présence de l’OTA une déshybridation des brins complémentaires est attendue, conduisant à une diminution du signal fluorescent. Différentes longueurs de brins complémentaires ont été comparées, montrant jusqu’à 13% de diminution due à l’interaction de l’OTA. / Rapid and sensitive detection of pathogenic targets play a crucial role in biosecurity. Biochips are ideal for this, as they allow easy and multiplex detection of targets. A crucial limitation in biochips is that they often suffer from low reliability and sensitivity. The goal of this thesis is to develop a stable and reproducible architecture for biochips based on an amorphous silicon carbon alloy (a-SiC:H) deposited on an aluminium back-reflector for reliable and sensitive detection of pathogens. On these biochips we introduced the interaction of the food and feed toxin ochratoxin A (OTA) with its 36mer aptamer AntiOTA as a model system. Aptamers (single strands of DNA) are ideal as probes for biochips as they display high specificity and affinity towards a wide range of targets (i.e. proteins, bacteria…). The well-controlled multi-step fabrication process consists of the reliable photochemical grafting of acid-terminated organic monolayers on silicon surfaces by robust Si C bonds, which in turn were functionalized with aptamers by stable peptide coupling. Carrying out this process on crystalline silicon allowed monitoring and quantification of every step by infrared spectroscopy (IR-ATR). The interaction OTA – AntiOTA was shown for the first time on surfaces by IR, and an IR in situ calibration allowed the quantification of OTA which was bound by the aptamers on the surface. The specificity of AntiOTA towards OTA was demonstrated by using a chemically similar molecule (warfarin), for which AntiOTA shows no affinity. The well-controlled protocols were transferred to the a-SiC:H biochip. The immobilized aptamers were hybridized with complementary and fluorescent-labeled DNA-strands. In presence of OTA, dehybridization of the complementary strands is expected, resulting in a decrease of fluorescent signal. Different lengths of complementary strands were compared, exhibiting up to 13% signal decrease due to OTA.

Au cours du stockage et sous de mauvaises conditions de conservation, les grains de blé peuvent subir diverses altérations causées par le développement fongique. Les moisissures peuvent produire des toxines pouvant avoir un impact sur la santé du consommateur. L’évaluation de la diversité fongique sur blé de stockage produit localement dans les régions céréalières du Nord de la Tunisie durant deux années successives (2010-2011 et 2011-2012) a montré une dominance du genre Alternaria. L’étude de la cinétique d’évolution de cette mycoflore au cours du stockage s’est caractérisée par un profil particulier dépendant des paramètres géographiques et temporels et des conditions écophysiologiques. L’évaluation du pouvoir toxinogène a révélé un faible pourcentage d’isolats ochratoxinogènes. L’évaluation de la présence de l’OTA dans le blé ont montré des taux de contaminations largement inférieurs aux normes européennes. L’étude sur la physiologie de sporulation et la production d’OTA en Fermentation en Milieu Solide par A. carbonarius à montré une amplification de la production des conidiospores et de l’OTA par aération humide forcée. L’évaluation de l'activité antifongique de 15 bactéries lactiques isolées du blé de stockage à l’égard de 8 moisissures post-récolte a montré une bonne aptitude de Lb. plantarum à inhiber la croissance de ces moisissures. L’étude du pouvoir anti-ochratoxinogène de Lb. plantarum LabN10, Lb. graminis LabN11 and P. Pentosaceus LabN12 ont montré un effet significatif de la température, du pH et de la biomasse bactérienne sur l’inhibition de la biomasse fongique ainsi que sur la réduction d’OTA. / During storage and under bad storage conditions, wheat grains can undergo various alterations caused by fungal growth. Molds can produce toxins that can have an impact on consumer health. Assessment of fungal diversity on wheat storage locally produced cereal in northern Tunisia during two successive years (2010-2011 and 2011-2012) showed a dominance of the genus Alternaria. Study of kinetics evolution of mycoflora during storage is characterized by a particular pattern depending on geographic and temporal parameters and ecophysiological conditions. Evaluation of toxigenic fungal revealed a low percentage of ochratoxinogenic isolates. Occurence of OTA in wheat showed contamination levels under European standards. The study on sporulation physiology and production of OTA by Solid State Fermentation by A. carbonarius shown amplification and production of conidiospores OTA wet forced by aeration. The evaluation of the antifungal activity of lactic acid bacteria (LAB) isolated from the 15 wheat storage against 8 post-harvest molds showed good ability of Lb. plantarum to inhibit the growth of these fungi. The study of anti-ochratoxinogène activity Lb. LabN10 plantarum, Lb. and P. graminis LabN11 LabN12 pentosaceus showed a significant effect of temperature, pH and the bacterial biomass on the inhibition of the fungal biomass and on the reduction of OTA.

L’ochratoxine A (OTA) est une mycotoxine issue du métabolisme secondaire des champignons filamenteux appartenant aux genres Penicillium et Aspergillus. Cependant, Aspergillus carbonarius est le majeur producteur de l’OTA sur les raisins. L’OTA a été retrouvée dans différents types de denrées alimentaires ainsi que lesurs produits dérivés. Le profil toxicologique de l’OTA due aux effets néfastes qu’elle présente sur la santé humaine et animale (effets hépatotoxiques, immunotoxiques, génotoxiques, tératogènes et cancérogènes) a conféré à cette mycotoxine une attention majeure auprès des instances internationales afin de limiter son occurrence. Ce projet est dédié pour trouver un moyen de lutte biologique, pouvant réduire l’OTA produite par A. carbonarius d’une part, et détoxifier les matrices alimentaires non conformes aux normes d’une autre part. La première stratégie était d’employer des huiles essentielles (cardamome, céleri, cannelle, taramira, origan, feuille de laurier, cumin, fenugrec, mélisse, menthe, sauge, anis, camomille, fenouil, romarin, romarin et thym) ainsi que des composés phénoliques extraits de plantes médicinales (feuille de laurier, cumin, fenugrec, mélisse, menthe, sauge, anis, camomille, fenouil, romarin et thym) afin d’évaluer leur effet sur la production de l’OTA dans le milieu SGM. Cette approche a été complétée par une étude moléculaire dans le but d’évaluer l’expression des gènes de biosynthèse de l’OTA (acpks, acOTApks et acOTAnrps) ainsi que les gènes de régulation (veA et laeA) chez A. carbonarius. Les résultats ont décelé que les huiles essentielles ont une activité fongicide plus élevée que celle des extraits phénoliques. Effectivement, les huiles essentielles du thym, de l’origan, du taramira, et de la cannelle ont bloqué complètement la croissance d’A. carbonarius. Cependant, les huiles essentielles du fenouil, de la cardamome, de l’anise, de la camomille, du céleri et du romarin ont réduit l’OTA sans autant affecter la croissance fongique. Le mode d’action de ces dernières a été mis en évidence en suivant l’expression des gènes acpks, acOTApks, acOTAnrps, veA et laeA, impliqués dans la biosynthèse de l’OTA chez A. carbonarius. Le gène acpks a été réprimée le plus (99.2%) quand A. carbonarius a été mis en culture avec 5 µL/mL du fenouil, entrainant ainsi une réduction de 88.9% de l’OTA. La deuxième stratégie était de développer un moyen de lutte biologique pouvant détoxifier les matrices alimentaires contaminées. Cette méthodologie a été développée suite à l’utilisation de sept souches d’actinobactéries (AT10, AT8, SN7, MS1, ML5, G10 et PT1), en évaluant leur capacité à métaboliser l’OTA, adhérer cette toxine à leur paroi membranaire ainsi que leur effet sur l’expression des gènes impliqués dans la biosynthèse de l’OTA chez A. carbonarius (acpks, acOTApks, acOTAnrps, veA et laeA). Les résultats ont montré que toutes les souches possèdent la capacité d’adhérer l’OTA à leur surface, notamment la souche SN7 qui a réduit 33% de l’OTA après 60 minutes d’incubation dans une solution PBS (Phosphate Buffer Solution) non nutritive. Les souches AT10 et SN7 ont métabolisé 51.94 et 52.68% de l’OTA ajoutée au milieu ISP2 (International Streptomyces Project-2) après 5 jours de culture à 28 °C. Cependant, les souches MS1, ML5 et G10 étaient les seules à avoir un effet sur l’expression des gènes de biosynthèse de l’OTA chez A. carbonarius. Effectivement les gènes acpks, acOTApks et acOTAnrps ont été réprimé respectivement de 37.1, 23.9 et 21% par MS1, de 39, 23 et 11.1% par ML5 et de 39, 18.3 et 11.1% par la souche G10. Ce projet a mis en valeur la capacité des extraits naturels (composés phénoliques et huiles essentielles) et des actinobactéries à prévenir d’une part la production de l’OTA et d’autre part réduire ses taux, sans pourtant affecter l’équilibre naturel ni engendrer l’apparition des débris toxiques dans les aliments traités. / Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin derived from the secondary metabolism of filamentous fungi belonging to the Penicillium and Aspergillus genera. However, Aspergillus carbonarius is the major producer of OTA on grapes. OTA has been detected in different types of foodstuffs as well as several products derived from these commodities. The toxicological profile of OTA and its adverse effects on human and animal health (hepatotoxic, immunotoxic, genotoxic, teratogenic and carcinogenic effects) has given this mycotoxin a major attention of international committees in order to limit its occurrence. The aim of this project was to develop biological techniques that can reduce OTA produced by A. carbonarius and detoxify non-compliant food matrices. The first strategy was achieved by using essential oils (cardamom, celery, cinnamon, taramira, oregano, bay leaf, cumin, fenugreek, melissa, mint, sage, anise, chamomile, fennel, rosemary and thyme) and phenolic compounds extracted from medicinal plants (bay leaf, cumin, fenugreek, melissa, mint, sage, anise, chamomile, fennel, rosemary, and thyme) to evaluate their effect on OTA production in SGM medium. This approach was complemented by a molecular study to evaluate the expression of the OTA biosynthesis genes (acpks, acOTApks and acOTAnrps) as well as the regulatory genes (veA and laeA) in A. carbonarius. The results revealed that essential oils had more significant fungicidal activity than phenolic extracts. Indeed, the essential oils of thyme, oregano, taramira, and cinnamon completely blocked the growth of A. carbonarius. However, essential oils of fennel, cardamom, anise, chamomile, celery and rosemary reduced OTA without affecting fungal growth. The mode of action of these essential oils has been demonstrated by evaluating the expression of acpks, acOTApks, acOTAnrps, veA and laeA genes in A. carbonarius. The expression of acpks was repressed the most (up to 99.2%) when A. carbonarius was cultured with 5 L / mL of fennel essential oil, resulting in a 88.9% of reduction in the OTA produced by this fungus. The second strategy was developed in order to detoxify contaminated food matrices. This methodology was achieved by using seven strains of actinobacteria (AT10, AT8, SN7, MS1, ML5, G10 and PT1), and evaluating their ability to metabolize OTA, adhere this toxin to their membrane walls and their effect on the expression of the genes involved in the biosynthesis of OTA in A. carbonarius (acpks, acOTApks, acOTAnrps, veA and laeA). The results showed that all strains were able to bind OTA to their surfaces, specially the SN7 strain which reduced 33% of OTA after incubation for 60 minutes in PBS (Phosphate Buffer Solution). The strains AT10 and SN7 metabolized 51.94 and 52.68% of the OTA added to the ISP2 medium (International Streptomyces Project-2) after 5 days of culture at 28° C. However, MS1, ML5 and G10 were the only strains to have an effect on the expression of the OTA biosynthesis genes in A. carbonarius. Indeed, acpks, acOTApks and acOTAnrps genes were repressed respectively by 37.1, 23.9 and 21% by MS1, 39, 23 and 11.1% by ML5 and 39, 18.3 and 11.1% by the strain G10. This project highlighted the power of natural extracts (phenolic compounds and essential oils) as well as strains of actinobacteria to prevent OTA production on one hand and to detoxify contaminated commodities on the other hand without altering the natural microbial balance.

Le travail réalisé au cours de cette thèse a porté sur le développement de biocapteurs électrochimiques d’affinité, sensibles et sélectifs, pour la détection de l’ochratoxine A (OTA) et l’aflatoxine M1 (AFM1). Les biocapteurs développés reposent sur l’association de différents nanomatériaux pour une meilleure performance analytique. Pour construire notre transducteur, nous avons associé le polypyrrole à des dendrimères poly(amido-amine) PAMAM, ce qui a permis d’avoir de très bon rendements grâce au propriétés électriques du polypyrrole et à l’augmentation de la surface active due à la structure tridimensionnelle des dendrimères. L’utilisation d’aptamères spécifiques pour la détection des différentes mycotoxines a permis leur détection et quantification à des concentrations de l’ordre des nM, ainsi que l’élargissement des gammes dynamiques. Nous avons pu démontrer grâce à l’utilisation de dendrimères de différentes tailles que la sensibilité des biocapteurs ne provient pas uniquement de l’affinité qui existe entre les biorécepteurs et leurs molécules cibles, mais aussi des propriétés physico-chimiques du biocapteur. / This aim of this work is to develop ultrasensitive electrochemical biosensors with high affinity toward ochratoxine (OTA) and aflatoxine M1 (AFM1). In order to obtain the best analytical performances, we associated nano-materials in the transducer construction: conducting polypyrrole polymer and poly(amido-amine) dendrimères. Thanks to this association, we benefited from the conducting material’s electrical properties, and the large active detection surface dendrimers. For the bimolecular sensing part, we used specific DNA aptamers which allowed us to quantify mycotoxines at nM concentrations. In addition, the different aptamer based biosensors present a very large dynamic ranges. We also demonstrated through the use of different sizes of dendrimers, that the sensitivity depend not only in the affinity between bioreceptors and their target molecules, but also in the physico-chemical properties of the biosensor.

L'ochratoxine A (OTA), principalement produite dans le café par les moisissures A. ochraceus et A. westerdijkiae, suscite une attention particulière pour ses effets néphrotoxiques, immunotoxiques, tératogènes et cancérigènes. La présence d'OTA dans les fèves de café peut être mise en relation avec les conditions de récolte, les conditions de traitement post-récolte et les conditions de stockage et de transport. Dans certains pays producteurs, les dommages causés sur les grains de café par des espèces fongiques sont liés à des teneurs élevées en OTA. La dynamique et la biodiversité des populations microbiennes (bactéries, levures, moisissures) lors des traitements post-récolte du café a été étudiée par une méthode d'analyse moléculaire globale des flores, la PCR-DGGE. Il a été observé une évolution et une diversité des flores microbiennes en fonction du type et des étapes des traitements utilisés, spécifiques des lieux de production. La région génomique ciblée et la proximité phylogénétique sont un obstacle à l'identification des souches ochratoxinogènes par l'approche globale utilisée. De plus, une méthode simple et rapide de différenciation moléculaire d'Aspergillus westerdijkiae et d'Aspergillus ochraceus a été mise au point et couplée avec l'analyse d'image pour permettre la « quantification » d'Aspergillus westerdijkiae. Des phénomènes de compétition/inhibition de la croissance et production d'OTA (supérieurs à 90%) ont été mis en évidence pour des souches d'Aspergillus niger et d'Aspergillus ochraceus faiblement productrices d'OTA vis-à-vis d'Aspergillus westerdijkiae qui est l'une des espèces les plus fortement productrices de la mycotoxine sur café. Les résultats obtenus au cours de ce travail sont importants pour l'amélioration des connaissances sur la dynamique des populations microbiennes au cours des procédés de transformation du café ainsi que pour de possibles applications en prévention et maîtrise de la contamination du café par l'OTA. / Ochratoxin A (OTA) is mainly produced on coffee beans by fungal species Aspergillus ochraceus and Aspergillus westerdijkiae, and is known for its impact on human health through nephrotoxic, immunotox, teratogenic and oncogenic effects.The OTA content in coffee was shown to be closely linked to harvesting conditions, post-harvest processing conditions and especially dry processing, storage and transportation conditions. In some producing countries, damaged caused on beans by fungal communities undoubtedly lead to high OTA contents in coffee. In order to understand the OTA contamination process, the dynamics and biodiversity of microbial populations (bacteria, yeast and moulds) was analyzed during post-harvest treatment by use of a global microbial ecology approach at the molecular level, so-called PCR-DGGE. Specific variations in evolution and diversity of microbial flora were observed as a function of the step and type of treatment, which were specific of the location of production. The genomic region targeted by the global approach and the genetic proximity of ochratoxigenic fungal strains made their study and identification difficult using the the global approach. In addition, a simple and rapid method for the molecular differentiation of A. westerdijkiae and A. ochraceus was established and, coupled with image analysis, allowed the quantification of A. westerdijkiae.Moreover, competition and inhibition effects on growth and OTA production (>90%) could be observed for low OTA producers A. niger and A. ochraceus species towards the high OTA producer A. westerdijkiae species. Results obtained during this study are of importance for understanding microbial population dynamics during coffee transformation processes. Moreover, it provides possible clues for prevention and control of coffee contamination by OTA.

Tout au long de la chaîne alimentaire, des moisissures peuvent se développer et produire des mycotoxines. Ce sont des composés toxiques naturels issus du métabolisme secondaire des moisissures, susceptibles de contaminer l'alimentation animale et humaine, provoquant de nombreuses pathologies (hépatotoxicité, néphrotoxicité, neurotoxicité, mutagénicité, tératogénicité, cancérogénicité,…). La première étape de ce travail était d'évaluer la présence simultanée de l'ochratoxine A (OTA), de la citrinine (CIT), des aflatoxines (AFs), de la zéaralénone (ZEA), de la fumonisine (FB) et des trichothécènes dans des aliments destinés aux humaines (céréales, lait, café, jambon) et aux animaux (croquettes de chat et chien, foins). En général plusieurs mycotoxines coexistaient. Certains échantillons pour les humains dépassaient les limites autorisées en mycotoxines dans l'Union Européenne. Suite à l'étude de simulation d'apport en mycotoxines dans une ration quotidienne, nous avons constaté que les doses journalières admissibles (DJA) peuvent être dépassées. La deuxième phase consistait à étudier l'impact des mycotoxines seules ou en combinaison sur la viabilité cellulaire et la génotoxicité sur des modèles cellulaires (cellules rénales d'opossum (OK), cellules rénales humaines (HK2), cellules humaines de glandes mammaires (MCF7)) et chez des animaux (porc, rat). Nous avons montré que la CIT, la FB1 et la ZEA agissent en synergie sur la génotoxicité de l'OTA. Chez les animaux, nous avons montré qu'à des doses (5 ng d'OTA/kg poids corporel/ jour et de 200ng FB1/kg pc/j) correspondantes aux DJA, il y avait des effets génotoxiques (formation d'adduits à l'ADN). Nous avons mis en évidence l'implication des mycotoxines dans l'alimentation animale sur la baisse de fertilité et la tératogénicité chez les chats, ainsi que sur la mort des chevaux. Au cours de la troisième partie de cette étude, nous avons testé sur des cultures cellulaires (HK2 et MCF7) et in vivo (poulet) l'effet protecteur du glutathion (GSH) et de la sélénométhionine (SeMet) contre l'OTA responsable de cancers de voie urinaire et la ZEA responsable de baisse de fertilité. Le GSH est un puisant antioxydant et le sélénium est un oligoélément indispensable qui intervient comme co-facteur de nombreuses enzymes ayant des propriétés antioxydantes, comme les glutathion peroxydases. D'une manière générale, au niveau des cellules rénales, le GSH seul et la levure correspondante ont un effet bénéfique vis-à-vis de la génotoxicité de l'OTA ; par contre la sélénométhionine et la levure séléniée augmentent la génotoxicité de l'OTA et de la ZEA. Dans les cellules des glandes mammaires, il y a une nette amélioration vis-à-vis de la génotoxicité des deux mycotoxines lorsque les cellules sont exposées à une seule mycotoxine simultanément au GSH, à la sélénométhionine et aux levures enrichies. Chez les poulets, la diminution de la génotoxicité n'est pas exclusivement corrélée à la capacité des parois de levure ou des levures à adsorber l'OTA. Ces dérivés de levure ont gardé la propriété de partiellement métaboliser l'OTA dans l'intestin. Les parois de levures et les levures enrichies en GSH ont un meilleur pouvoir protecteur que celles enrichies en SeMet / Throughout the food chain, mold can grow and produce mycotoxins. These are toxic compounds "natural" from the secondary metabolism of molds that may contaminate the feed and food, causing many diseases (hepatotoxicity, nephrotoxicity, neurotoxicity, mutagenicity, teratogenicity, carcinogenicity, ...). The first stage of this work was to assess the level of multi-contamination by mycotoxins (OTA, CIT, Afs, ZEA, FB, DON) in food (cereals, milk, coffee, ham) and feed (pet food). Some samples analyzed exceeded the limits of mycotoxins in the European Union. Through the simulation study of mycotoxin intake in a daily diet, we found that the acceptable daily intake (ADI) may be exceeded. The second phase was to study the impact of mycotoxins alone or in combination on cell proliferation, genotoxicity in cellular models (OK, HK2, and MCF7) and animal (pig, rat). We have demonstrated genotoxic effects (formation of DNA adducts) at doses (5 ng OTA / kg bw / day and 200 ng FB1/kg bw / day) considered safe (ADI). We have shown that the CIT, FB1 and ZEA act synergistically on the genotoxicity of OTA. We pointed to the involvement of mycotoxins in animal feed on declining fertility and teratogenicity in cats, as well as the death of horses. In the third part of this study, we tested in cell cultures (HK2 and MCF7) and in vivo (chicken) the protective effect of glutathione (GSH) and selenomethionine (SeMet) against OTA responsible for urinary tract cancers and ZEA reducing fertility. GSH is considered as a potent antioxidant and selenium is a trace essential element that acts as a cofactor of enzymes such glutathione peroxidase. In summary, in kidney cells, GSH and GSH enriched yeast decrease OTA genotoxicity whereas SeMet and SeMet enriched yeast increase genotoxicity of OTA and ZEA. In mammary cells, whatever the compounds gentoxicty of OTA and ZEA significantly decrease. Decrease of OTA genotoxicity in chicken kidney cannot be exclusively explained by adsorption of OTA on yeast by products. The yeast products retain their ability to metabolize the OTA. GSH enriched yeast and yeast cell wells are more efficient than SeMet enriched yeast

Un appareil de mesure de la fluorescence, à faible coût et portable a été développé pour quantifier les concentrations d’Ochratoxine A (OTA) dans des échantillons réels. Le système est basé sur l’excitation par une UV-LED à 365 nm et un photo détecteur contrôlé par une interface dans LabVIEW. Aussi, une image capteur, CMOS, contrôlée par une interface conçue dans MATLAB. L’OTA est une molécule naturellement fluorescente. Après excitation par une UV-, l’image de la fluorescence émise est captée par une caméra et traitée en vue de la mesure de la concentration de l’OTA. Le système d’analyse a été basé sur les 3 composants rouge, vert et bleu (RGB, selon l'acronyme anglais). La gamme est linéaire entre de 2-40 µg/L. L’extraction de l’OTA est réalisée par des colonnes d'immuno affinité (IAC, selon l'acronymeanglais) et les colonnes à empreinte moléculaire (MIP, selon l'acronyme anglais) pour les échantillons de cacao, de la bière et du vin. Les résultats obtenus ont été validés par la méthode chromatographique (HPLC). L'appareil conçu est facile à utiliser, économique et portable. En outre, l'utilisation des nouvelles technologies a été inclus tels que l'emploi du smartphone pour détecter l'OTA et la création d'un APP. Des données d'image de fluorescence provenant de la caméra du smartphone et sont analysées par un ordinateur personnel et présentés dans les composantes RGB, où l'image est envoyée à l'ordinateur par WIFI et le téléphone intelligent est utilisé comme source d'énergie trop. Enfin, une APP pour le système Android a été créé pour capturer l'image et fournit les valeurs RGB. Enfin l'utilisation du traitement de l'image a été utilisée pour quantifier l'OTA dans les échantillons réels sans colonnes IAC ou MIP, employée pour extraire la mycotoxine. L’analyse a été réalisée par des techniques colorimétriques et d’analyse de la couleur. / A portable and low cost fluorescence set-up to quantify the concentrations of Ochratoxin A(OTA) in real samples was developed. The detection through the device consist of anultraviolet light at 365 nm and an photo detector or a CMOS sensor controlled by anexecutable interface designed in LabVIEW or MATLAB. It has been reported that OTA is naturally fluorescent, so it allows the user to get a UV LED to excite the sample, get a value involtage when a photodetector is employed or a photograph of the OTA under excitationconditions, and process that image in order to predict the concentrations of the sample. Tocapture and process the image, in an automatically manner, the system was completely basedon the Red, Green and Blue (RGB) components. The linearity for OTA obtained in the rangeof concentrations corresponds to 2-40 µg/L. Immunoaffinity columns (IAC) and molecularimprinted polymer columns (MIP) were used with cocoa, beer and wine samples. Theobtained results were cross-validated using chromatographic method such as HPLC and theFluoroskan equipment. The developed setup is easy to use, economical and portable. Besides,the use of new tendencies was included such as employ the smartphone to detect OTA and thecreation of an APP. Fluorescence image data from the smartphone camera are analyzed by apersonal computer and presented in RGB components, where the image is sent to thecomputer by WIFI and the smartphone is used as a power source too. Finally, an APP forandroid system was created to capture the image and provides the RGB values. At the end, theuse of image processing to quantify the OTA in real samples without incorporated IAC or MIPcolumns to extract the mycotoxin from a complex solution, employing colorimetric techniquesand color analysis.

L'objectif de cette thèse est de contribuer à déterminer les régions possibles de croissance Aspergillus Ochraceus (O.A.) lors du séchage du café. Il est admis que ce champignon qui produit une toxine (Ochratoxine A), se développe pour une activité de l'eau supérieure à 0,8. La structure interne du grain de café est étudiée par microscopie, stéréoscopie et RMN. Ces observations mettent en évidence une grande hétérogénéité de structure à l'échelle du grain et à l'échelle cellulaire. Les isothermes de désorption pour cinq parties du grain sont établies. Mis à part la parche qui présente une structure ligneuse, il n'a pas été mis en évidence de différences notables des isothermes dans les autres parties du grain. L'étude des transferts d'eau est focalisée à la surface du grain, site privilégié de la croissance d'O.A. où trois structures présentent une résistance au transfert d'eau : l'endosperme, la couche argentée, la parche. Dans l'endosperme, le transport est décrit par une loi de diffusion. Pour des teneurs en eau supérieures à 65%, un coefficient de diffusion constant décrit bien la cinétique d'un grain entier. Au dessous de cette teneur en eau, le coefficient de diffusion décroit avec la teneur en eau. Ceci est dû, d'une part, à la réduction de l'espace poral occupé par l'eau et, d'autre part, à l'augmentation de la liaison entre l'eau et le squelette solide lorsque la teneur en eau diminue. Les essais de diffusion avec et sans la couche argentée montrent que la contribution de cette dernière est de l'ordre de 10%. Le flux d'eau dans la parche est supposé proportionnel à la différence d'activité de part et d'autre de celle-ci. Une technique expérimentale originale est proposée pour mesurer la résistance au transfert d'eau de la parche. Les résultats expérimentaux sont utilisés dans un modèle simple décrivant la cinétique et le profil d'activité de l'eau à la surface du grain. En fonction des conditions de séchage imposées, il devrait permettre de juger si l'environnement à la surface du grain est favorable ou non à la contamination du café.

L'industrie viti-vinicole est affectée par la présence d’Ochratoxine A (OTA) dans ses produits en raison de la contamination des raisins par des souches fongiques d'Aspergillus section Nigri, notamment A. carbonarius. Le vin et le jus de raisin sont considérés comme les deuxièmes contributeurs en Europe à l'ingestion par les consommateurs de cette mycotoxine ayant des effets néphrotoxiques, neurotoxiques et tératogènes. L'objectif principal de ce travail est de proposer des méthodes alternatives aux traitements phytosanitaires chimiques pour prévenir la contamination en OTA dans les raisins et le vin, dans le respect de l'environnement et de la santé des producteurs et consommateurs. Différents traitements ont été comparés en station expérimentale après contamination artificielle du cépage Mourvèdre par une souche d’A. carbonarius fortement productrice d’OTA (CP-OTA) isolée de raisin : un fongicide chimique (Scala®) servant de témoin conventionnel et 3 traitements alternatifs, un extrait de plante agissant comme éliciteur (Stifénia®), et Saccharomyces cerevisiae et Trichoderma atroviride utilisés comme agents biologiques antagonistes. Deux parcelles non traitées ont servi de témoins non traités, l'une a été artificiellement contaminée. Une réduction significative de la teneur en OTA dans les jus (de 38 à 42 %) a été observée pour les traitements avec le fongicide chimique, la levure en tant qu’agent biologique et l’éliciteur Stifenia permettant une amélioration notable de la qualité sanitaire des jus et une réduction en dessus de la norme à 2 g/Kg. Les dénombrements microbiologiques et la Q-PCR utilisant des amorces spécifiques d’A. carbonarius ont montré les plus fortes réductions de son occurrence dans les jus de raisin et les rafles après traitement avec l’éliciteur. L’analyse des résultats de PCR-DGGE a permis de bien de discriminer les différents traitements par rapport à des modifications d’écosystèmes. Des espèces des genres Penicillium et Fusarium non productrices d’OTA ont été isolée des baies traitées par le Stifénia® alors qu’elles n’ont pas été mises en évidence sur les autres parcelles. Les deux traitements biologiques et le traitement par éliciteur ont considérablement augmenté l'épaisseur des peaux de baies (quantités de cire et de cuticule et épaisseur de la peau de la baie). Ceci pourrait être due à des mécanismes de résistance des baies de raisin à certains agents pathogènes et pourraient expliquer simultanément la réduction d’OTA ainsi que l'amélioration de la qualité globale du jus de raisin, qui présentent notamment des teneurs en polyphénols augmentées. Le trans-6-nonenal et trans-2-octenal, rencontrés à plus haute concentration dans les feuilles traitées au Stifénia® lors de l’analyse des profils des composés organiques volatils (COV) des feuilles ont montré une activité antifongique sur la croissance et toxinogenèse du CP-OTA alors qu’aucune activité antifongique de la poudre Stifénia® n’a pu être mesurée. Cela pourrait expliquer en partie le mode d'action de défense de la plante suite au traitement éliciteur par production au niveau des feuilles des COV induisant des modifications métaboliques sur le CP-OTA et engendrant les teneurs d’OTA réduites dans les raisins. Suite aux modifications d’écosystème obtenus, l’autre possibilité envisagée de défense induite par le Stifénia serait la promotion de souches microbiennes antagonistes des souches fongiques mycotoxinogènes. Lors de test d’antagonisme, certaines souches des genres Penicillium et Fusarium, isolées sur parcelles traitées au Stifenia, ont eu un effet positif de réduction de la croissance et toxinogenèse du CP-OTA. C'est notamment le cas pour Penicillium adametzioides qui présente la meilleure réduction de toxinogenèse du CP-OTA. Le traitement par éliciteur présente donc de très bonnes alternatives aux traitements phytosanitaires chimiques pour lutter contre les champignons toxinogènes ainsi que des potentialités de nouveaux agents biologiques. / The grape and wine industry is affected by the presence of Ochratoxin A (OTA) in its products because of contamination of grapes by strains of Aspergillus section Nigri. Grapes and wine are considered as the second contributors in Europe to the ingestion of this mycotoxin with nephrotoxic, neurotoxic and teratogenic effects. The main objective of this work is to provide non-chemical alternative methods to control OTA contamination in grapes and wine, in respect with environment and health of producers and consumers. Different treatments were compared in experimental vineyard PECH-ROUGE of INRA and IFV, Narbonne, France on near parcels after artificial contamination of the Mourvèdre grape cultivar by A. carbonarius: (OTA producing fungus; OTA-PF) a chemical fungicide (Scala®); Saccharomyces cerevisiae and Trichoderma atroviride as antagonists; and a plant extract as elicitor (Stifénia®). Two untreated parcels served as controls, one was artificially contaminated. A significant reduction (38 - 42%) was observed in the OTA juice content by the chemical, yeast bioagent and elicitor treatments with juice safety improvement under the standard at 2 g/Kg. The microbiological enumeration and Q-PCR using universal and specific primers for A. carbonarius had shown the highest reduction of its occurrence on grapes and stems from elictor treatment. The DGGE gave an overview on their effect on the fungal ecosystem, that showed higher similarity between the non-contaminated and elicitor treatment (76%) followed by yeast one and the lowest treatment was the contaminated one. The results obtained from traditional methods of isolation showed that the elicitor treatment had a higher proportion of fungal species from Penicillium and Fusarium genera not isolated in the other treatments. The two biological treatments and one elicitor treatment significantly increased the thickness of the berry skins in general (wax, cuticle layers and skin thickness), which could be related to the enhancement of the disease resistance of the grape berries to certain pathogens and could also simultaneously explain the OTA reduction and the grape juice quality improvement whith particular increasment of polyphenol contents. Further study was conducted in order to understand the Stifénia® mode of action because the reduction effect of the black aspergilli incidence and the OTA contamination while the isolated strains still have the high ability of producing OTA. Trans-6-nonenal and trans-2-octenal, which recognized in Stifénia® treatment leaves with the highest significant concentration regarding to their concentration with the chemical treatment during volatile organic compound (VOC) analyses, have antifungal activity against the OTA-PF growth and OTA production with low concentrations. No antifungal activity of the Stifénia® powder against the OTA-PF mycelial growth or toxigenesis were measured. That may partially explain the mode of action of plant defence by producing leaf VOCs that induce positive changes on the OTA-PF and its OTA contents in grapes. Due to ecosystem changes observed, an other potential effect of the induced defense with Stifénia treatment could be to promote fungal strains with antagonistic effect on A. carbonarius. In vitro antagonistic test was performed with Stifénia® non-Aspergillus isolates from Penicillium and Fusarium genera. Certain strains had a positive effect on mycelial growth reduction on OTA-PF and have also an effect on OTA production of OTA-PF. Penicillium adametzioides showed the highest reduction of toxigenesis of OPT-PF. This could be accomplished by applying as the elicitor one of the tested fungi with an antagonistic effect on OTA production, such as P. adametzioides. The Elicitor treatment therefore offers very good alternatives to chemical treatments to fight against toxigenic fungi directly or by giving new potential biological agents.