The human body is home for millions of bacteria. The largest microbial community is located in the gastro-intestinal (GI) tract, including the oral cavity with >700 identified taxa. Lactobacillus, which is normal inhabitant of the GI tract, contributes to health by possible biofilm and immune modulation. Breast milk is a claimed source for transmittance of Lactobacillus to infants’ GI tract, but there is limited information if breastfeeding affects lactobacilli in the oral cavity. The objectives of Papers I and II of this dissertation were to compare infant oral microbiota by feeding mode, and to characterize oral lactobacilli including potential probiotic properties of the dominant Lactobacillus species. Two cohorts with a total of 340 healthy 3- to 4-month-old infants were investigated. Saliva and oral mucosal swab samples were collected. Bacteria were characterized by culture-dependent and -independent methods, including 16S rRNA genes sequencing, quantitative PCR, and the Human Microbe Identification Microarray (HOMIM). Inhibition of growth and adhesion were also tested. Multivariate modeling of HOMIM-detected oral bacteria clustered breastfed infants separately from formula-fed infants, and linked breastfed infants to a more health-associated flora. Lactobacilli were essentially detected in breastfed infants only. Lactobacillus gasseri was most prevalent out of six identified Lactobacillus species. Infant isolates of L. gasseri bound to saliva gp340 and MUC7 and adhered to gingival epithelial cells. Infant isolates also inhibited adhesion of Streptococcus mutans to saliva-coated hydroxyapatite, and inhibited growth of S. mutans, Streptococcus sobrinus, Actinomyces naeslundii, Actinomyces oris, Candida albicans and Fusobacterium nucleatum in a concentration-dependent fashion. Papers III and IV aimed to assess persistence of probiotic Lactobacillus reuteri, if persistence is necessary for a regrowth of mutans streptococci (MS), and if L. reuteri intake affects oral microbiota composition. Two well-documented L. reuteri strains (DSM 17938 and PTA 5289) were used in two double-blind, randomized controlled trials. In the first, 62 subjects (test=32, placebo=30) with high counts of MS were exposed to L. reuteri for 6 weeks. Exposure followed full-mouth disinfection with chlorhexidine. In the second study, 44 healthy subjects (test=22, placebo=22) consumed the L. reuteri for 12 weeks. Saliva and biofilm samples were collected before, during and up to 6 months after exposure. Analyses included culture, strain-specific PCR and 454-pyrosequencing targeting the hypervariable region V3-V4 of the 16S rRNA gene. L. reuteri test strains were detected in the mouth of approximately two thirds of test participants during intake. However, their presence decreased gradually when consumption stopped. Subjects with detectable L. reuteri had slower regrowth of MS compared to non-carriers. Pyrosequencing yielded a total of 812,547 high-quality sequencing reads. Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes, Fusobacteria and Actinobacteria were the major bacterial phyla recovered. Exposure to L. reuteri strains did not affect overall phylotype abundance, but multivariate modeling clustered 12-week-treated test subjects separately from those who received placebo. Exposure to the test strains was strongly associated with presence and increased levels of F. nucleatum and Streptococcus spp. In conclusion, the oral microbiota differed by feeding mode in infants. One third of breastfed infants had lactobacilli in the mouth, while only single formula-fed infant had it. L. gasseri, predominant in infants, displayed probiotic characteristics in vitro. Retention of probiotic L. reuteri was a prerequisite for delay of MS regrowth after disinfection. However, probiotic bacteria may not be beneficial for all, since L. reuteri DSM 17938 and PTA 5289 were retained in only 2 of 3 consumers. Finally, the altered microbiota after 12 weeks consumption of L. reuteri indicates that intake of probiotic bacteria, or at least L reuteri, has an impact on oral ecology. However, this finding needs further investigation. / Vår kropp består av fler mikroorganismer än egna celler.  De miljontals bakterier som finns på ut - och insidan av kroppen är som regel harmlösa och vissa är till och med till nytta för oss. Magtarmkanalen, som startar med munnen, är den kroppsdel som härbärgerar flest bakterier. Till exempel har man bara i munnen identifierat totalt mer än 700 olika arter. En av dessa är Lactobacillus, en bakterieart som finns i normalfloran och som har probiotiska egenskaper. Hos spädbarn anses bröstmjölk vara en källa för Lactobacillus i tarmen, men hur amning påverkar laktobacillförekomst i munnen är oklart. Den första delen i denna avhandling syftar till att jämföra mikrofloran i munnen hos spädbarn som ammas kontra de som får ersättning, att karakterisera vilka laktobaciller som finns i munnen hos respektive grupp och undersöka om dessa har probiotiska egenskaper. Totalt studerades saliv och prov från munslemhinnan från 340 friska 3-4 månader gamla spädbarn. Proven karakteriserades med odling, sekvensering, kvantitativ PCR och en microarraymetod (Human Microbe Identification Microarray, HOMIM), och isolerade laktobacillers effekt på växt och vidhäftning av andra munbakterier studerades. Ammade barn hade en mer hälsoassocierad mikroflora i munnen. Laktobaciller fanns bara hos ammade barn, men bara hos vart 3:e ammat barn. Av totalt sex identifierade laktobacillarter var Lactobacillus gasseri den i särklass mest förekommande arten. L. gasseri isolerade från spädbarnen band till salivproteinerna gp-340 och MUC7 samt till orala epitelceller. L. gasseri kunde även förhindra adhesion av Streptococcus mutans till konstgjord tandemalj och hämma växt av S. mutans, Streptococcus sobrinus, Actinomyces naeslundii, Actinomyces oris, Candida albicans och Fusobacterium nucleatum. Laktobaciller förekommer i många hälsoprodukter med påstådd probiotisk effekt. Andra delen av denna avhandling syftade till att bedöma om intag av tabletter med den probiotiska arten Lactobacillus reuteri påverkar ekologin i mikrofloran i munnen, om arten etablerar sig hos alla vid exponering, och om etablering är nödvändig för probiotisk effekt (mätt som hämmad återväxt av kariesassocierade mutansstreptokocker efter antimikrobiell behandling). Två stammar L. reuteri (DSM 17938 and PTA 5289) användes i två dubbelblinda, randomiserade studier. I båda studierna intog deltagarna i testgruppen tabletter med L. reuteri-stammarna och de i kontrollgruppen identiska tabletter utan bakterier. I den första studien deltog 62 deltagare (32 test, 30 kontroll) i 6 veckor och i den andra 44 personer (22 test, 22 placebo) under 12 veckor. Saliv och biofilmsprover samlades in vid studiestart, under och upp till 6 månader efter avslutad testperiod. Proverna analyserades med odling, PCR och 454-pyrosekvensering. L. reuteri etablerade sig hos 2/3 av testpersonerna under testperioden men mängden minskade gradvis efter avslutat intag. Bland de som fick L. reuteri hade deltagarna med påvisbara teststammar fördröjd återväxt av mutansstreptokocker jämfört med de som inte hade det. Pyrosekvensering visade att totalantalet phylotyper inte skiljde sig mellan de som fick aktiva kontra placebotabletter, men att ekologin i bakteriefilmerna hos de som ätit de aktiva tabletterna ändrades. Att exponeras för L. reuteri var starkt associerat med förhöjda nivåer av F. nucleatum and Streptococcus spp. Sammanfattningsvis visar dessa studier att amning är associerad med att ha probiotiska laktobaciller i munnen men bara vissa etablerar arten i munnen. Hos vuxna försenade L. reuteri återkolonisation av mutansstreptokocker efter antibakteriell behandling, och påverkade ekologin i bakteriefilmerna i munnen. Även hos vuxna ledde exponering till etablering bara hos vissa individer.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A aplicaÃÃo da nanotecnologia na Odontologia pode promover a otimizaÃÃo de caracterÃsticas estÃticas e mecÃnicas de materiais odontolÃgicos bem como propiciar uma aÃÃo anticÃrie pelo menor acÃmulo de biofilme oral sobre estes materiais e liberaÃÃo de compostos antimicrobianos ou remineralizantes. Os objetivos de cada capÃtulo sÃo: 1) revisar a literatura concernente ao uso de nanopartÃculas em materiais odontolÃgicos com implicaÃÃes diretas ou indiretas no controle de lesÃes de cÃrie (capÃtulo 1); 2) investigar in vitro a liberaÃÃo de flÃor e o potencial inibitÃrio de cimento ortodÃntico nanoparticulado fluoretado na desmineralizaÃÃo do esmalte (capÃtulo 2); 3) estudar o efeito in situ de resina composta fluoretada contendo nanopartÃculas na liberaÃÃo de flÃor e na capacidade inibitÃria da desmineralizaÃÃo em esmalte (capÃtulo 3); 4) avaliar o efeito da incorporaÃÃo de nanopartÃculas de prata (NAg) e fosfato de cÃlcio amorfo (NACP) em sistema adesivo comercial (capÃtulo 4); 5) avaliar o efeito da incorporaÃÃo de monÃmero associado a quaternÃrio de amÃnio (QADM), NAg e NACP em sistema adesivo experimental (capÃtulo 5) e 6) estudar o efeito in situ de resina composta contendo NACP no biofilme oral e em lesÃes de cÃries em esmalte (capÃtulo 6). Como abordagens metodolÃgicas foram realizadas: uma revisÃo de literatura, 3 estudos in vitro com induÃÃo de cÃrie por modelo microbiolÃgico e 2 estudos in situ relacionados aos objetivos citados. Como resultados, o desenvolvimento de materiais nanomÃtricos anticÃrie ainda necessita de um melhor conhecimento dos mecanismos de aÃÃo, seguranÃa e eficÃcia das nanopartÃculas (capÃtulo 1). A liberaÃÃo de flÃor e o potencial inibitÃrio na desmineralizaÃÃo do esmalte de cimento ortodÃntico nanoparticulado fluoretado foi inferior ao apresentado por cimento de ionÃmero de vidro modificado por resina (capÃtulo 2). Resina composta nanoparticulada apresentou pequena atividade anticÃrie in situ sem detrimento de sua lisura de superfÃcie (capÃtulo 3). A inclusÃo de NAg e NACP em sistema adesivo apresentou significativo efeito antimicrobiano in vitro sem diminuiÃÃo da resistÃncia de uniÃo quando comparado ao controle (capÃtulo 4). A atividade metabÃlica, produÃÃo de Ãcido lÃtico e nÃmero de unidades formadoras de colÃnias foram menores em biofilmes formados sobre sistemas adesivos experimentais contendo QADM, NAg e NACP sem diminuiÃÃo da resistÃncia de uniÃo quando comparado ao controle (capÃtulo 5). CompÃsito com NACP liberou mais cÃlcio e fÃsforo em biofilme cariogÃnico formado in situ e propiciou menores lesÃes de cÃrie em esmalte ao redor das restauraÃÃes que o compÃsito controle (capÃtulo 6). Em resumo, a presenÃa de nanopartÃculas de carga na composiÃÃo bÃsica de materiais odontolÃgicos nÃo garante por si sà uma atividade anticÃrie efetiva. A incorporaÃÃo de QADM, NAg e NACP em materiais odontolÃgicos pode permitir a promoÃÃo de um efeito anticÃrie, apresentando-se como uma promissora abordagem no desenvolvimento de materiais restauradores diretos. / The application of nanotechnology in dentistry can promote the optimization of aesthetic and mechanical characteristics of dental materials as well as provide an anticaries action due to the lowest oral biofilm accumulation on these materials and release of antimicrobial or remineralizing compounds. The objectives of each chapter are: 1) to review the literature concerning the use of nanoparticles in dental materials with direct or indirect implications for the control of caries lesions (chapter 1), 2) to investigate in vitro the fluoride release and the inhibitory potential of nanoparticulated fluoridated orthodontic cement on demineralization of enamel (chapter 2), 3) to study the in situ effect of nanoparticle composite containing fluoride on fluoride release and the inhibition of enamel demineralization (chapter 3) 4) to evaluate the effect of incorporation of silver nanoparticles (NAg) and amorphous calcium phosphate (NACP) in commercial adhesive system (chapter 4), 5) to evaluate the effect of incorporation monomer associated with quaternary ammonium (QADM), NAg and NACP in experimental adhesive system (chapter 5) and 6) to study the in situ effect of composite resin containing NACP on the oral biofilm and enamel caries lesions (chapter 6). As methodology approaches a literature review, 3 in vitro studies with microbiological caries model and 2 in situ studies were performed according to the cited objectives. As results, the developing anticaries nanomaterials still need a better understanding of the action mechanisms, safety and efficacy of nanoparticles (chapter 1). Fluoride release and the enamel demineralization inhibition of the nanoparticulated fluoridated orthodontic cement were lower than that shown by resin-modified glass ionomer cement (chapter 2). Nanoparticle-containing composite showed little in situ anticaries activity without prejudice to its surface roughness (chapter 3). The inclusion of NAG and NACP in adhesive system showed significant in vitro antimicrobial effect without decreasing bond strength when compared to control (chapter 4). Metabolic activity, lactic acid production and number of colony forming units were lower in biofilms formed on experimental adhesive systems containing QADM, Nag and NACP without decreased bond strength when compared to control (chapter 5). NACP composite released more calcium and phosphorus in cariogenic biofilm formed in situ and caused shallow caries lesions on enamel around the restorations that the control composite (chapter 6). In summary, the presence of nanoparticles fillers as basic composition of dental materials does not assure effective anticaries activity. Incorporating QADM, Nag and NACP in dental materials can promote anticaries effect, and showing as a promising approach in dental materials development.

Les levures du genre Candida provoquent 70 à 90% des infections fongiques invasives chez l’Homme. Candida albicans est l’espèce de levure la plus souvent isolée et la plus pathogène au niveau de la cavité orale. Cette levure présente des facteurs de virulence multiples, notamment une capacité à modifier sa morphologie (dimorphisme), des adhésines servant à la reconnaissance de l’hôte, la sécrétion de phospholipases et d’aspartyl protéases et une capacité à former des biofilms. L’augmentation constante des infections fongiques et des résistances aux antifongiques, des effets secondaires et du coût des traitements, justifie la recherche de nouvelles molécules actives contre les biofilms impliquant des levures. Après une revue de la littérature sur les modèles de biofilms oraux, nous avons étudié l’effet d’un extrait végétal de Solidago virgaurea sur C. albicans. Une première étude a montré que l’extrait, par ailleurs dépourvu d’effet antibactérien, pouvait agir sur le champignon en : 1) empêchant la conversion de levures en hyphes, 2) inhibant la formation de biofilm, et 3) en dissociant le biofilm déjà formé. La deuxième étude visait à comprendre le mode d’action de cet extrait. Elle a montré que l’extrait de S. virgaurea inhibait l’expression de protéines impliquées dans l’adhésion et la filamentation. Par ailleurs, il exerce un effet synergique sur l’élimination du biofilm lorsqu’il est combiné à des antifongiques. L’ensemble de ces résultats positionne l’extrait de S. virgaurea en candidat prometteur pour une approche innovante du traitement topique des candidoses cutanéomuqueuses. / Candida yeast cause 70 to 90 % of human invasive fungal infections. In the oral cavity, Candida albicans is the most frequently isolated the most pathogenic species. This yeast has multiple virulence factors, including the capacity to alter its morphology (dimorphism), adhesins for host-recognition, the secretion of phospholipases and aspartyl proteases, and the ability to form biofilms. The search for new anti-biofilms drugs and, in particular, those targeting biofilm involving yeast is justified by the constantly increasing incidence of fungal infections and antifungal resistance, treatments side effects and costs. We first reviewed the literature regarding oral biofilm models. Then, we studied the effect of a Solidago virgaurea extract against C. albicans. A first study showed that this extract, which has no antibacterial effect, could act on the fungus in several ways, including: 1) inhibiting yeast-to-hypha transition, 2) inhibiting biofilm formation, and 3) disrupting existing biofilm. The second study aimed to understand the mode of action of this extract. It showed that it might act via the down-regulation of proteins involved in yeast adhesion and filamentation. Furthermore, it acted in synergy with antifungals to eliminate biofilm. Overall, these findings indicate that this S. virgaurea extract is a promising candidate for an innovative approach of superficial candidiasis topical therapy.

SyfteSyftet med denna laborativa pilotstudie in vitro var att undersöka hur den mikrobiella sammansättningen och pH i den orala biofilmen påverkades vid upprepad exponering för Stevia (steviosid och rebaudiosid A), sackaros eller en kombination av reb A och sackaros. Ett ytterligare syfte var att studera om isolat av orala bakterier kunde metabolisera reb A i buljongkultur. Material och metodBiofilmer från tre personer blev exponerade för 0,025 % steviosid, 0,025 % reb A eller 10 % Todd Hewitt (TH) under 15 minuter tre gånger dagligen i fyra dagar. Artbestämning gjordes i början och slutet av försöken. Biofilmerna exponerades för 0,025 % reb A och 10 % sackaros eller en kombination av dessa varefter pH-värdet mättes. Vidare studerades 23 bakteriestammar avseende förmåga att metabolisera 0,025% respektive 0,5% reb A. ResultatStreptokocker dominerade i samtliga biofilmer vid försökets slut oavsett om de exponerats för steviosid, reb A eller enbart TH. En pH-sänkning kunde ses hos biofilmerna som enbart blivit exponerade för sackaros eller för en kombination av sackaros och reb A. Däremot kunde endast en marginell pH-sänkning observeras efter exponering för enbart reb A. Ingen av de enskilda bakteriestammar som studerades kunde metabolisera reb A.SlutsatsIngen större skillnad i biofilmens bakteriesammansättning kunde ses efter upprepad exponering för steviosid eller reb A i förhållande till TH.Upprepade exponeringar av reb A i kombination med sackaros gav en liknande pH-sänkning som enbart sackaros, dock sågs ingen pH-sänkning efter exponering för enbart reb A. Enskilda bakteriestammar kunde inte metabolisera reb A. / AimsIn this in vitro laboratory pilot study, the effect on the microbial composition and pH of the oral biofilms after repeated exposure to Stevia (stevioside and rebaudioside A), saccarose or a combination, was investigated. Another aim was to study whether isolate of oral bacteria were able to metabolise reb A in broth bacteria culture.Material and MethodBiofilms from three adult individuals were repeatedly exposed to 0,025% stevioside, 0,025% reb A or 10% Todd Hewitt (TH). Samples were taken at the beginning and at the end of the experiment for cultivation and bacterial identification.Biofilms were exposed to 0,025% reb A and 10% saccharose, either separately or combined, followed by a pH-measurement. Furthermore, 23 bacterial species were studied in regards to ability to metabolize reb A. ResultsAll biofilms were dominated by Streptococcus regardless of whether they were exposed to stevioside, reb A, or TH. A pH-decrease was seen in biofilms exposed to saccharose or a combination of saccharose and reb A. However, only minor changes were noted after exposure to reb A.None of the species studied were able to metabolize reb A.ConclusionNo major differences in the bacterial composition of the biofilms were seen after repeated exposure to stevioside or reb A compared to TH.No pH-decrease after repeated exposure to reb A was noted. Exposure to reb A combined with saccharose resulted in a pH-decrease similar to exposure to saccharose. The bacterial species tested in this study were not able to metabolise reb A.

Einleitung Die ständige Suche nach effektiveren und/oder weiteren botanischen Antibiotika im weiten Feld der geographischen Artenvielfalt macht den Stand der Forschung sehr unübersichtlich. Ziel dieser Arbeit ist es, durch Literaturrecherche eine Übersicht antimikrobiell wirksamer Pflanzen, Zubereitungen und Extrakte auf ausgewählte Bakterien der Mundhöhle aufzuzeigen. Material und Methoden Die Literaturrecherche erfolgte weltweit durch englische Schlüsselwörter in den elektronischen Datenbanken Cochrane Library, Pubmed / Medline, Embase und Google scholar für den Zeitraum bis einschließlich Dezember 2012. Ergebnisse Es wurden Veröffentlichungen über 735 Pflanzen gefunden, die auf ihre antimikrobielle Wirkung gegen folgende Mikroorganismen getestet wurden: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Tannerella forsythia, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Campylobacter rectus, Streptococcus mutans, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis, Streptococcus sanguinis, Streptococcus gordonii. Gute antimikrobielle Wirkung zeigten Extrakte von 149 Pflanzen. In 87 klinischen Studien wurden Extrakte und Mixturen von ingesamt 61 Pflanzen untersucht, wovon nur 4 Studien keinen Effekt auf die klinischen Parameter hatten. Schlussfolgerung für die Klinik Pflanzenextrakte als neue potenzielle antimikrobielle Wirkstoffe in Prävention und Therapie von oralen Erkrankungen erforden noch weitere kontrollierte Studien in definierten Verfahren. / Introduction The constant search for more effective and / or other botanical antibiotics in the vast field of geographic diversity makes the state of research very confusing. The aim of this work is to show an overview of antimicrobial plants, preparations and extracts on selected bacteria of the oral cavity through literature. Material and Methods The literature search was carried worldwide by English keywords in the electronic databases Cochrane Library, PubMed / Medline, Embase and Google scholar for the period up to and including December 2012. Results Publications were found about 735 plants. They were tested for antimicrobial activity against the following microorganisms: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Tannerella forsythia, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Campylobacter rectus, Streptococcus mutans, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis, Streptococcus sanguinis, Streptococcus gordonii. Extracts of 149 plants showed good antimicrobial effect. In 87 clinical studies, extracts and mixtures of a total of 61 plants were examined, of which only 4 studies had no effect on clinical parameters Conclusion for the clinic Require new potential plant extracts as antimicrobial agents in the prevention and treatment of oral diseases, further controlled studies in defined procedures

A técnica de fluorescência óptica tem sido aplicada em diversas áreas médicas, como no acompanhamento da degradação de drogas e na detecção de câncer, por apresentar alta sensibilidade, simplicidade e rapidez na obtenção de dados. A avaliação não-invasiva e não-destrutiva é um grande atrativo que esta técnica oferece para o diagnóstico clínico. Assim, o objetivo deste projeto consistiu no desenvolvimento de um sistema de fluorescência óptica por imagem de campo amplo e avaliação do sistema no monitoramento da fotodegradação da Protoporfirina XI, utilizada na Terapia Fotodinâmica (TFD), e na visualização da presença de microrganismos presentes na microbiota bucal. O sistema desenvolvido é constituído de um sistema óptico, mecânico, eletrônico e de detecção. O sistema óptico é composto por LEDs de alta intensidade, com emissão centrada em 405nm e 450nm e 3 filtros ópticos: 1. passa-banda: utilizado na excitação; 2. dicróico; e 3. passa-alta: utilizados para excitação e emissão da fluorescência. O sistema mecânico foi desenvolvido em alumínio, possuindo as funções de dissipação de calor do sistema de iluminação e estrutural. O sistema eletrônico possui a função de controle e fornecimento de energia ao sistema de iluminação. O sistema de detecção é composto por uma câmera CCD e fotográfica, acoplada ao sistema de fluorescência desenvolvido. Um dos principais fatores para obtenção de bons sinais de fluorescência é a potência óptica obtida no sistema de iluminação, que neste caso foi de 200 mW. Outro fator é o comprimento de onda da iluminação; neste sistema foi obtida uma banda de iluminação muito eficaz entre 390 nm e 460 nm. O sistema de filtros proporcionou um sinal de fluorescência bastante satisfatório, bem como um bom contraste na visualização das imagens de fluorescência. Com este sistema foi possível acompanhar a fotodegradação da Protoporfirina IX, em função do tempo de iluminação durante a TFD. Proporcionou-se, assim, uma nova ferramenta para o avanço na avaliação da dosimetria da TFD, podendo otimizar e personalizar a TFD para cada paciente, já que o sistema desenvolvido permite a visualização da presença do agente fotossensível na terapia. Outra contribuição relevante do trabalho alcançada foi a visualização da presença de microrganismos da microbiota bucal, já que estes são os grandes responsáveis pelas doenças bucais como é o caso da cárie dental. Desta forma, conclui-se que foi possível desenvolver um sistema para auxílio da dosimetria na TFD e na visualização de microrganismos presentes na microbiota bucal. O sistema desenvolvido se mostrou compacto, agregando iluminação e visualização, tornando-o num protótipo com interface para uso clínico. O protótipo foi testado em pacientes para a visualização da microbiota bucal, tratamento de pré-câncer de pele e de vulva. / Optical fluorescence has been applied to several medical areas, as to monitor drug degradation and cancer detection, due to its high sensitivity, simplicity and fast response. Non-invasive and non-destructive assessment of tissues using this technique is very attractive for clinical diagnosis. Hence, the aim of was the development of an optical fluorescence wide-field imaging system, and the evaluation of its performance on monitoring protoporphyrin IX (PpIX) during Photodynamic Therapy (PDT), and one visualization of microrganisms present in oral microbiota. The developed device is composed by optical, mechanical, electronic, and detection systems. Optical system is composed by high-intensity light-emitting diodes (LED), with emission centered at 405 nm and 450 nm, and 3 optical filters: a bandpass filter for excitation; and set of dichroic and long wave pass filter, for fluorescence excitation and emission. The mechanical system was built in aluminum for structural and ilumination systems heat dissipation. The electronic system provides the control of the illumination system. The detection system is composed by a CCD and a conventional didgital camera, coupled to the developed device. One of the main factors for good fluorescence signals is the achieved optical power - in our case, it was of 200 mW. Another factor is excitation wavelength; for this system, a very efficient illumination band was achieved between 390-460 nm. The optical filters allowed a very satisfying fluorescence signal, with good contrast for fluorescence images visualization. The developed system enabled the monitoring of PpIX photobleaching as a function of illumination time during PDT. Therefore, a new tool to improve PDT dosimetry is offered by the use this system, allowing a more customized dosimetry each patient, since the device allows visualization of the photosensitive agent during the therapy. Visualization of oral microrganisms was also achieved, which was another relevant contribution of the developed instrumentation because they are the main cause of oral diseases such as caries. Thus the development of a system to both improve PDT dosimetry and oral microrganisms visualization was achieved as a compact device, joining illumination and visualization. These characteristics shows a good interface for clinical use. The prototype was tested in patients for oral microbiota visualization, and skin/vulva pre-cancer lesions treatment.

A técnica de fluorescência óptica tem sido aplicada em diversas áreas médicas, como no acompanhamento da degradação de drogas e na detecção de câncer, por apresentar alta sensibilidade, simplicidade e rapidez na obtenção de dados. A avaliação não-invasiva e não-destrutiva é um grande atrativo que esta técnica oferece para o diagnóstico clínico. Assim, o objetivo deste projeto consistiu no desenvolvimento de um sistema de fluorescência óptica por imagem de campo amplo e avaliação do sistema no monitoramento da fotodegradação da Protoporfirina XI, utilizada na Terapia Fotodinâmica (TFD), e na visualização da presença de microrganismos presentes na microbiota bucal. O sistema desenvolvido é constituído de um sistema óptico, mecânico, eletrônico e de detecção. O sistema óptico é composto por LEDs de alta intensidade, com emissão centrada em 405nm e 450nm e 3 filtros ópticos: 1. passa-banda: utilizado na excitação; 2. dicróico; e 3. passa-alta: utilizados para excitação e emissão da fluorescência. O sistema mecânico foi desenvolvido em alumínio, possuindo as funções de dissipação de calor do sistema de iluminação e estrutural. O sistema eletrônico possui a função de controle e fornecimento de energia ao sistema de iluminação. O sistema de detecção é composto por uma câmera CCD e fotográfica, acoplada ao sistema de fluorescência desenvolvido. Um dos principais fatores para obtenção de bons sinais de fluorescência é a potência óptica obtida no sistema de iluminação, que neste caso foi de 200 mW. Outro fator é o comprimento de onda da iluminação; neste sistema foi obtida uma banda de iluminação muito eficaz entre 390 nm e 460 nm. O sistema de filtros proporcionou um sinal de fluorescência bastante satisfatório, bem como um bom contraste na visualização das imagens de fluorescência. Com este sistema foi possível acompanhar a fotodegradação da Protoporfirina IX, em função do tempo de iluminação durante a TFD. Proporcionou-se, assim, uma nova ferramenta para o avanço na avaliação da dosimetria da TFD, podendo otimizar e personalizar a TFD para cada paciente, já que o sistema desenvolvido permite a visualização da presença do agente fotossensível na terapia. Outra contribuição relevante do trabalho alcançada foi a visualização da presença de microrganismos da microbiota bucal, já que estes são os grandes responsáveis pelas doenças bucais como é o caso da cárie dental. Desta forma, conclui-se que foi possível desenvolver um sistema para auxílio da dosimetria na TFD e na visualização de microrganismos presentes na microbiota bucal. O sistema desenvolvido se mostrou compacto, agregando iluminação e visualização, tornando-o num protótipo com interface para uso clínico. O protótipo foi testado em pacientes para a visualização da microbiota bucal, tratamento de pré-câncer de pele e de vulva. / Optical fluorescence has been applied to several medical areas, as to monitor drug degradation and cancer detection, due to its high sensitivity, simplicity and fast response. Non-invasive and non-destructive assessment of tissues using this technique is very attractive for clinical diagnosis. Hence, the aim of was the development of an optical fluorescence wide-field imaging system, and the evaluation of its performance on monitoring protoporphyrin IX (PpIX) during Photodynamic Therapy (PDT), and one visualization of microrganisms present in oral microbiota. The developed device is composed by optical, mechanical, electronic, and detection systems. Optical system is composed by high-intensity light-emitting diodes (LED), with emission centered at 405 nm and 450 nm, and 3 optical filters: a bandpass filter for excitation; and set of dichroic and long wave pass filter, for fluorescence excitation and emission. The mechanical system was built in aluminum for structural and ilumination systems heat dissipation. The electronic system provides the control of the illumination system. The detection system is composed by a CCD and a conventional didgital camera, coupled to the developed device. One of the main factors for good fluorescence signals is the achieved optical power - in our case, it was of 200 mW. Another factor is excitation wavelength; for this system, a very efficient illumination band was achieved between 390-460 nm. The optical filters allowed a very satisfying fluorescence signal, with good contrast for fluorescence images visualization. The developed system enabled the monitoring of PpIX photobleaching as a function of illumination time during PDT. Therefore, a new tool to improve PDT dosimetry is offered by the use this system, allowing a more customized dosimetry each patient, since the device allows visualization of the photosensitive agent during the therapy. Visualization of oral microrganisms was also achieved, which was another relevant contribution of the developed instrumentation because they are the main cause of oral diseases such as caries. Thus the development of a system to both improve PDT dosimetry and oral microrganisms visualization was achieved as a compact device, joining illumination and visualization. These characteristics shows a good interface for clinical use. The prototype was tested in patients for oral microbiota visualization, and skin/vulva pre-cancer lesions treatment.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / O tratamento das doenÃas ocasionadas por biofilmes orais envolve basicamente a remoÃÃo mecÃnica e o uso de antibiÃticos e agentes anti-sÃpticos os quais podem originar cepas resistentes aos antimicrobianos tradicionais. A Terapia FotodinÃmica Antimicrobiana (TFDA) apresenta-se como uma opÃÃo alternativa ao tratamento clÃssico, promovendo a morte bacteriana por meio da fotossensibilizaÃÃo dos componentes microbianos. Este estudo verificou a aÃÃo antimicrobiana da terapia fotodinÃmica sobre biofilmes orais produzidos in vitro e in situ utilizando um diodo emissor de luz (LED) associado ao fotossensibilizador azul de orto-toluidina (TBO). No estudo in vitro, biofilmes de Streptococcus mutans UA159, foram formados sobre discos de hidroxiapatita utilizando um modelo de banhos de cultura e submetidos à TFDA apÃs 5 dias. Para o estudo in situ, vinte e um voluntÃrios foram previamente selecionados para utilizar dispositivos intra-orais palatinos contendo 8 blocos de dentina humana durante 7 dias. SoluÃÃo de sacarose 10% foi gotejada sobre os blocos dentais 8 vezes ao dia. O biofilme formado em um dos lados do dispositivo recebeu tratamento da TFDA, e o lado oposto serviu como grupo controle. O material coletado passou por um processo de disrupÃÃo para a dispersÃo das cÃlulas e diluiÃÃo em sÃrie decimal de 10-1 a 10-4. Em ambos os experimentos, meios de cultura especÃficos para o crescimento de estreptococos totais e estreptococos do grupo mutans foram inoculados e incubados em condiÃÃes ideais para o crescimento desses microrganismos. ReduÃÃes significativas acima de 99,99% (p<0.05) foram observadas na viabilidade das colÃnias de S. mutans UA159 quando expostos ao TBO e LED no estudo in vitro. Entretanto, nos biofilmes formados in situ e submetidos Ãs mesmas condiÃÃes experimentais, nÃo foram verificadas diferenÃas estatisticamente significantes (p&#8805;0.05) da contagem microbiana quando comparadas ao grupo controle. Portanto, podemos concluir que a TFDA foi efetiva na reduÃÃo microbiolÃgica de S. mutans UA159 crescidos em modelo de formaÃÃo de biofilme in vitro, mas, pouco efetiva sobre biofilmes de estreptococos orais formados in situ. / The treatment of diseases caused by oral biofilms involves mechanical removal and use of antibiotics and antiseptics which can lead to problems of bacterial resistance. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT) represents an alternative option to conventional treatment, promoting bacterial killing by photo-sensitization of microbial components. This study assessed the antimicrobial action of photodynamic therapy on oral biofilms produced in vitro and in situ using a light emitting diode (LED) associated with the photosensitizer toluidine blue O (TBO). Biofilms of Streptococcus mutans UA159 were grown on hydroxyapatite discs immersed in bathing culture and submitted to PACT after 5 days. For the in situ study, twenty-one volunteers were previously selected to use intra-oral palatal appliances containing eight blocks of human dentin during 7 days. Sucrose solution (10%) was dripped onto the dental blocks 8 times a day. The biofilm formed on one side of the device received treatment (PACT), and the opposite side acted as control. The collected material has gone through a process of disruption to the dispersion of cells and diluted in decimal series (10-1 to 10-4). In both experiments, specific culture media for the growth of total streptococci and mutans streptococci were inoculated and incubated under optimal conditions for growth of these microorganisms. Significant reductions in excess of 99.99% (p<0.05) were observed in the viability of colonies of S. mutans UA159 when exposed to TBO and LED on in vitro study. However, the biofilms formed in situ and subjected to the same experimental conditions showed no statistically significant differences (p&#8805;0.05) in the microbiological counting when compared with control group. Therefore, we conclude that PACT was effective in microbiological reduction of S. mutans UA159 grown in an in vitro biofilm model, but very little effective on oral streptococci biofilms produced in situ.

Submitted by Izabel Franco (izabel-franco@ufscar.br) on 2016-09-14T14:14:33Z No. of bitstreams: 1 TeseVHP.pdf: 3273273 bytes, checksum: afe82ad5c25bb61d489c9fcaec24a835 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-16T19:20:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseVHP.pdf: 3273273 bytes, checksum: afe82ad5c25bb61d489c9fcaec24a835 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-16T19:20:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseVHP.pdf: 3273273 bytes, checksum: afe82ad5c25bb61d489c9fcaec24a835 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-16T19:20:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseVHP.pdf: 3273273 bytes, checksum: afe82ad5c25bb61d489c9fcaec24a835 (MD5) Previous issue date: 2015-05-07 / Não recebi financiamento / Demineralization and caries are often present in patients with orthodontic braces due to the increased accumulation of dental biofilm containing Streptococcus mutans, which produces acids that attack the tooth surface. The Antimicrobial Photodynamic Therapy (APDT) has been shown as an alternative in microbial inactivation in dentistry. This work, carried out both in vitro and in vivo, aims to evaluate the antimicrobial effect of APDT on Streptococcus mutans present in the dental biofilm accumulated on the metal surface of orthodontic appliances and in patients undergoing orthodontic treatment. The in vitro study evaluated the susceptibility of biofilm formed by S. mutans on the metal surface under the application of orthodontic appliances APDT induced Curcumin diluted surfactant (SDS) and blue light-emitting diode (LED). The samples were treated with the photosensitizer (PS) at a concentration of 1 g/L, 0.1% surfactant and exposed to LED light (455 ± 10 nm, 46mW/cm²), fluence of 30 J/cm². The experimental groups studied were: control group (P-L-S-); light (P-L+S-), surfactant (P-L-S+) and photosensitizer (P+L-S-) groups; surfactant-light (P-L+S+), photosensitizer-surfactant (P+L-S+) and PDT (P+L+S-) groups; and the PDT-surfactant (P+L+S+) group. Each group was named accordingly to the addiction or not of the photosensitizer (P+ or P-), surfactant (S+ or S-) and application or not of light (L+ or L-), respectively. The colonies grown on plates of brain heart infusion (BHI) were counted (CFU / mL) and the results were analyzed by ANOVA and the post hoc Tukey test (p <0.05). The results showed that in this research protocol, the group P+L+S+ was able to promote significant decrease (p<0.001) on the population of S. mutans of 99.999% compared to the control group. In the in vivo study, 24 volunteers were randomly selected in order to evaluate the clinical utility of APDT and the APDT association with the surfactant (SDS) as oral decontamination agents in orthodontic patients. The selected patients (n = 24) were randomly divided into seven groups: G1 - Negative control, G2 - Curcumin mouthwash, G3 - Curcumin mouthwash+SDS, G4 - light irradiation, G5 - APDT, G6 - APDT+SDS and G7 - Positive Control (chlorhexidine 0.12% moutwash). Saliva samples were collected from unstimulated way of each patient in three steps (S) as follows: S1 - initial condition S2 - Treatment with rinsing (water, curcumin or chlorhexidine) and S3 - After APDT. The photosensitiser used was curcumin with concentration of 1 g/L. Two types of blue LED light source emitting in 450±10nm were used in the present study: one emitting with an intensity of 33.54 mW/cm² and other with 212 mW/cm². Evaluation of microbial reduction, and survival fraction in each of the studied levels, was performed using the Kruskal-Wallis ANOVA test. Statistical analysis showed that only G6 and G7 presented results of bacterial inactivation that showed statistically significant differences (p<0.05) compared to those observed in G1. These results indicated that APDT, when combined with SDS surfactant, may be used as an adjunct agent for convenient oral decontamination promoter in vivo. / Desmineralizações e cáries dentais estão comumente presentes em indivíduos portadores de aparelho fixo ortodôntico, isto ocorre devido ao aumento de acúmulo de biofilme dental contendo Streptococcus mutans, os quais produzem ácidos que atacam a superfície dental. A terapia fotodinâmica antimicrobial (TFDA) tem sido mostrada como alternativa em inativação microbiana na Odontologia. Este trabalho, realizado in vitro e in vivo, tem o objetivo de avaliar o efeito antimicrobiano da TFDA sobre Streptococcus mutans em biofilme dental sobre superfície metálica de acessórios ortodônticos e em indivíduos sob tratamento ortodôntico. O estudo in vitro avaliou a susceptilidade de biofilme formado por S. mutans sobre superfície metálica de acessórios ortodônticos sob aplicação de TFDA induzida por Curcumina diluída em surfactante (SDS) e por diodo emissor de luz azul (LED). Nas amostras obtidas de lâminas de bandas ortodônticas foram formados biofilmes e tratadas com fotossensibilizador (FS) com concentração de 1g/L, surfactante a 0,1% e exposto a luz LED (455±10 nm, 46mW/cm²), com fluência de30J/cm2. Os grupos experimentais estudados foram: C- (somente lavagem com solução fisiológica); L+ (aplicação apenas de luz); S+L- (aplicação de surfactante); S+L+ (aplicação de surfactante e luz); F+L- (aplicação de fotossensibilizador sem luz); F+L+ (aplicação de fotossensibilizador e luz); F+L-S+ (aplicação de fotossensibilizador sem luz + surfactante) e F+L+S+ (aplicação de fotossensibilizador e luz + surfactante). As colônias cultivadas em placas com Brain Heart Infusion (BHI) foram contadas (UFC/mL) e os resultados foram analisados por ANOVA e teste Tukey post hoc (p<0.05). Os resultados obtidos demonstraram que no protocolo deste estudo o grupo F+S+L+ foi capaz de promover diminuição significativa(p<0,001) da população de S. mutans em 99,999% comparado ao grupo controle. No estudo in vivo, 24 voluntários foram selecionados aleatoriamente, com o objetivo de avaliar a eficiência clínica da TFDA e da associação da TFDA com o surfactante SDS como agentes de descontaminação bucal em indivíduos ortodônticos. Os indivíduos selecionados foram distribuídos aleatoriamente em sete grupos experimentais: G1 - controle negativo, G2 - bochechos com curcumina, G3 – bochechos com curcumina + SDS, G4 - irradiação com luz apenas, G5 - TFDA, G6 - TFDA + SDS e G7 - Controle Positivo (clorexidina 0,12%). Amostras de saliva foram coletadas de maneira não estimulada de cada um dos indivíduos em três etapas (s), como segue: S1 - Condição inicial, S2 - Tratamento com bochechos (água, clorexidina ou curcumina) e S3 - Após TFDA. O fotossensibilizador usado foi a Curcumina em concentração de 1g/L. Foi utilizado no estudo dois tipos de equipamentos de luz com LED azul (450 ± 10nm, 33.54 mW/cm2 e 212 mW/cm2). A avaliação da redução microbiana, e da fração de sobrevivência em cada um dos níveis estudados, foi realizada utilizando-se o teste ANOVA Kruskal-Wallis. A análise estatística mostrou que apenas os grupos 6 e 7 apresentaram resultados de inativação bacteriana que apresentavam diferenças estatisticamente significantes (p <0,05) em relação aos resultados observados no grupo 1. Estes resultados indicam que a TFDA associada com o surfactante SDS pode ser utilizado como agente auxiliar conveniente para promover a descontaminação bucal.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:30:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_Adaue_banca.pdf: 296840 bytes, checksum: 0cd98d8b2ca7a1306c82e4b8319d9e71 (MD5) Previous issue date: 2012-06-01 / The use of orthodontic devices has been associated with an increase in dental biofilm retention. In this study, the effect of hydrophobic coatings, based on (fluorinated or not) organo-silanes, on the reduction of the contact angle and early biofilm retention in orthodontic devices was tested. Two different types of hydrophobic were tested: hydrophobic solution 1 (SH1), obtained by dilution of 2.5% of hexadecyl-triethoxy-silane in ethanol, and hydrophobic solution 2 (SH2), composed of 2.5% of perfluorodecyl-triethoxy-silane diluted in dimethyl sulfoxide. The solutions were applied in ceramic and stainless steel substrates and, via sol-gel process and crosslinking, siloxane networks were formed on the surface of the devices. The effect of the coatings was evaluated in two stages. In the first stage, aiming the characterization of the surface, the water contact angle was analyzed. Stainless steel and polycrystalline alumina plates were prepared, previously applying or not alumina sandblasting as surface treatment. A significant increase in contact angle was observed with the application of both hydrophobic solutions in both substrates, with the sandblasting allowing formation of super-hydrophobic surface in the ceramic substrate (contact angle up to 155o), while hydrophobic surfaces were obtained in the steel substrate (contact angle up to 123o). In the second phase, the effect of the hydrophobic coating on the biofilm retention in orthodontic brackets was evaluated using a microscosm model. Orthodontic brackets were previously prepared according to the surface treatments that showed the best results in the phase 1 (SH1 for steel, SH2 for ceramic). The effect of the coatings on the biofilm formation was evaluated in periods of 12h and 24h (controls: uncoated substrates and sandblasted substrates). The results showed that the hydrophobic coatings did not result in significant effect in biofilm retention for the time 12h, whereas all coating treatments significantly reduced the biofilm retention in the metal and ceramic brackets compared with the control groups. A significant exponential reduction in biofilm retention at 24h was associated with the increase in contact angle. It can be concluded that application of (super)-hydrophobic crosslinked coatings via sol-gel process on the surface of orthodontic metal and ceramic brackets reduced the surface wetting of the surfaces in contact with water and had a significant effect on the retention of dental biofilm after 24h / O uso de dispositivos ortodônticos tem sido associado ao aumento da retenção de biofilme dentário. Neste estudo, foi testado o efeito de coberturas hidrófobas,baseadas em organo-silanos (flourados ou não), no aumento do ângulo de contato e redução de acúmulo de biofilme inicial em dispositivos ortodônticos. Dois tipos diferentes de soluções hidrófobas foram testadas: solução hidrófoba 1 (SH1), obtida pela diluição de 2,5% de hexadecil-trietóxi-silano em etanol, e solução hidrófoba 2 (SH2), composta por 2,5% de perfluorodecil-trietóxi-silano diluído em dimetilsulfóxido. As soluções foram aplicadas em substratos cerâmico e de aço inox e, via processo sol-gel e reticulação, foram formadas redes siloxanas na superfície dos dispositivos. O efeito das coberturas foi avaliado em duas etapas. Na primeira etapa, buscando a caracterização da superfície, foi analisado o ângulo de contato com água. Placas de aço inox e alumina policristalina foram preparadas, aplicando ou não jateamento prévio das superfícies com partículas de alumina. Foi observado aumento significativo do ângulo de contato com a aplicação das duas soluções hidrófobas em ambos substratos, sendo que o jateamento do substrato propiciou a formação de superfície superhidrófoba no substrato cerâmico (ângulo de contato de até 155o), enquanto superfícies hidrófobas foram obtidas no substrato aço (ângulo de contato até 123o). Na segunda fase do trabalho, avaliou-se o efeito da cobertura no acúmulo de biofilme em braquetes ortodônticos, através de modelo de microcosmos. Braquetes ortodônticos foram previamente preparados conforme os tratamentos de superfície que apresentaram melhores resultados na primeira fase (SH1 para aço, SH2 para cerâmica). Foi avaliado o efeito da cobertura na formação de biofilme em períodos de 12h e 24h (controles: substratos não-recobertos e substratos jateados). Os resultados mostraram que as coberturas hidrófobas não resultaram em efeito significativo no acúmulo de biofilme no tempo 12h, entretanto todos os tratamentos de cobertura reduziram de forma significativa o acúmulo de biofilme sobre os braquetes metálicos e cerâmicos comparados aos grupos controle no período 24h. Foi observada relação de redução exponencial significativa entre ângulo de contato e acúmulo de biofilme para o tempo 24h. Dessa forma, conclui-se que a aplicação de coberturas (super)-hidrófobas reticuladas via processo sol-gel na superfície de dispositivos ortodônticos metálicos e cerâmicos reduziu o molhamento das superfícies em contato com a água e teve efeito significativo na retenção de biofilme bucal sobre esses dispositivos após 24h