Würzburg, Univ., Diss., 2008. / Zsfassung in engl. Sprache.

Universiẗat, Diss., 2005--Würzburg.

Im Mittelpunkt dieser Arbeit stehen Untersuchungen zur Bildung des Pigments Neuromelanin, das die Ursache für die dunkle Farbgebung der humanen Substantia nigra pars compacta ist. Eine Beteiligung von Neuromelanin an den pathobiochemischen Ereignissen bei Parkinson-Krankheit erklärt das klinische Interesse an Neuromelanin. Die Untersuchungsmöglichkeiten von Neuromelanin sind limitiert: einerseits ist eine chemische Strukturaufklärung aufgrund der Unlöslichkeit dieses amorphen Polymers kaum zu bewerkstelligen, andererseits wird mangels geeigneter biologischer Testsysteme ein Einblick in die Biogenese von Neuromelanin verwehrt. Zurzeit wird die Bildung von Neuromelanin anhand der beiden konkurrierenden Hypothesen als Autoxidation von Dopamin oder durch Beteiligung eines Enzyms („Tyrosinase-Konzept“) erklärt. In dieser Arbeit wurden beide hypothetischen Ansätze bearbeitet, wobei einer enzymatischen Biogenese von Neuromelanin die Präferenz gegeben wird. Zur globalen Untersuchung von Neuromelanin-Granula wurde nun erstmals eine Isolierung der Pigment-haltigen Organelle vorgestellt, die die Basis für eine umfassende Proteomanalyse mittels 1-D-SDS-PAGE und ESI-Tandem-Massenspektrometrie bildete. Mit diesem methodischen Ansatz wurden ingesamt 73 Proteinen identifiziert. Diese waren vor allem lysosomalen Proteinen zuordenbar, z.B. charakteristischen Membranproteinen (LAMP-1), sämtlichen Proteasen, Proteinen des Metabolismus von (Glyco-)Lipiden und Glycoproteinen, aber auch Proteinen des Cytosols und des vesikulären Verkehrs. Entscheidend war die Anwesenheit von Proteinen des Endoplasmatischen Reticulums (ER); Calnexin gilt als ein melanogenes Chaperon, das nicht in Lysosomen vorkommt, dagegen aber in Lysosomen-verwandten Organellen. Im Vergleich mit bereits existierenden Proteinprofilen von Lysosomen und Lysosomen-verwandten Organellen zeigten die in Neuromelanin-Granula identifizierten lysosomalen Proteine und Proteine des ER, dass diese Organellen der humanen Substantia nigra keine konventionellen Lysosomen sind, sondern mit hoher Wahrscheinlichkeit der Gruppe der Lysosomen-verwandten Organellen zuzuordnen sind. / This work focusses on the formation of the polyphenolic pigment neuromelanin, which accounts for the dark colour of the human substantia pars compacta. A contribution of neuromelanin to the patho-biochemical events in Parkinson’s disease is suggested, which is the reason for the clinical interest in this pigment. The analytical approaches to investigate neuromelanin are limited: on the one hand, an elucidation of the chemical structure is hardly possible to accomplish due to the insolubility of this amorphous polymer, on the other hand, the lack of appropriate biological test systems prevents insight into the biogenesis of neuromelanin. Currently the formation of neuromelanin is addressed by two competing hypotheses either by autoxidation of dopamine (“autoxidative concept”), or by contribution of an enzyme (“tyrosinase concept”). This work covered both hypothetical approaches, but the concept of an enzymatic biogenesis of neuromelanin is preferred. Aiming at a global analysis of these pigmented organelles, the isolation of neuromelanin granules was introduced for the first time, which formed the basis for an extensive proteomic analysis by 1-D SDS-PAGE and ESI tandem mass spectrometry. Subsequently, the analyses by mass spectrometry facilitated the identification of 73 proteins, most of which were attributable to lysosomal proteins, e.g. characterisitcal membrane proteins (LAMP-1), various proteases, proteins engaged in the metabolism og (glycol)-lipids and glycoproteins, but also cytosolic proteins and proteins involved in vesicular traffic. Intriguingly, there were proteins identified which originate form the endoplasmic reticulum (ER), most notably calnexin, a melanogenic chaperone, which is not found in lysosomes but in lysosome-related organelles. By comparison of yet existing protein profiles of lysosomes and lysosome-related organelles it became clear that neuromelanin granules from the human substatia nigra are no conventional lysosomes, but should rather be attributed to the group of lysosome-related organelles.

<p><em>Panax ginseng</em> is a traditional herb that has been used for over 2000 years to promote health and longevity. Active components of ginseng include ginsenosides, polysaccharides, flavonoids, polyacetylenes, peptides, vitamins, phenols and enzymes, of which the ginsenosides are considered to be the major bioactive constituents. Although widely used, the exact mechanisms of ginseng and its compounds remain unclear. In this thesis we use melanophores from <em>Xenopus laevis</em> to investigate the effects of <em>Panax ginseng</em> extract G115 and its constituents on organelle transport and signalling. Due to coordinated bidirectional movement of their pigmented granules (melanosomes), in response to defined chemical signals, melanophores are capable of fast colour changes and provide a great model for the study of intracellular transport. The movement is regulated by alterations in cyclic adenosine 3’:5’-monophosphate (cAMP) concentration, where a high or low level induce anterograde (dispersion) or retrograde (aggregation) transport respectively, resulting in a dark or light cell. Here we demonstrate that <em>Panax ginseng</em> and its constituents ginsenoside Rc and Rd and flavonoid quercetin induce a concentration-dependent anterograde transport of melanosomes. The effect of ginseng is shown to be independent of cAMP changes and protein kinase A activation. Upon incubation of melanophores with a combination of Rc or Rd and quercetin, a synergistic increase in anterograde movement was seen, indicating cooperation between the ginsenoside and flavonoid parts of ginseng. Protein kinase C (PKC) inhibitor Myristoylated EGF-R Fragment 651-658 decreased the anterograde movement stimulated by ginseng and ginsenoside Rc and Rd. Moreover, ginseng, but not ginsenosides or quercetin, stimulated an activation of 44/42-mitogen activated protein kinase (MAPK), previously shown to be involved in both aggregation and dispersion of melanosomes. PKC-inhibition did not affect the MAPK-activation, suggesting a role for PKC in the ginseng- and ginsenoside-induced dispersion but not as an upstream activator of MAPK.</p> / <p><em>Panax ginseng </em>är ett av de vanligaste naturläkemedlen i världen och används traditionellt för att öka kroppens uthållighet, motståndskraft och styrka. Ginseng är ett komplext ämne bestående av ett antal olika substanser, inklusive ginsenosider, flavonoider, vitaminer och enzymer, av vilka de steroidlika ginsenosiderna anses vara de mest aktiva beståndsdelarna. Flavonoider (som finns i till exempel frukt och grönsaker) och ginseng har genom forskning visat sig motverka bland annat hjärt-och kärlsjukdomar, diabetes, cancer och demens. Trots den omfattande användningen är dock mekanismen för hur ginseng verkar fortfarande oklar. I den här studien har vi använt pigmentinnehållande celler, melanoforer, från afrikansk klogroda för att undersöka effekterna av <em>Panax ginseng</em> på pigment-transport och dess maskineri. Melanoforer har förmågan att snabbt ändra färg genom samordnad förflyttning av pigmentkorn fram och tillbaka i cellen, och utgör en utmärkt modell för studier av intracellulär transport. Förflyttningen regleras av förändringar i halten av cykliskt adenosin-monofosfat (cAMP) i cellen, där en hög eller låg koncentration medför spridning av pigment över hela cellen (dispergering) eller en ansamling i mitten (aggregering), vilket resulterar i mörka respektive ljusa celler. Här visar vi att <em>Panax ginseng</em>, ginsenosiderna Rc och Rd samt flavonoiden quercetin stimulerar en dispergering av pigmentkornen. När melanoforerna inkuberades med en kombination av ginsenosid Rc eller Rd och quercetin, kunde en synergistisk ökning av dispergeringen ses, vilket tyder på en samverkan mellan ginsenosid- och flavonoid-delarna av ginseng. Ett protein som tidigare visats vara viktigt för pigmenttransporten är mitogen-aktiverat protein kinas (MAPK), och här visar vi att också melanoforer stimulerade med ginseng, men dock inte med ginsenosider eller quercetin, innehåller aktiverat MAPK. Genom att blockera enzymet protein kinas C (PKC) (känd aktivator av dispergering), minskade den ginseng- och ginsenosid-inducerade dispergeringen, medan aktiveringen av MAPK inte påverkades alls. Detta pekar på en roll för PKC i pigment-transporten men inte som en aktivator av MAPK.</p>

Panax ginseng is a traditional herb that has been used for over 2000 years to promote health and longevity. Active components of ginseng include ginsenosides, polysaccharides, flavonoids, polyacetylenes, peptides, vitamins, phenols and enzymes, of which the ginsenosides are considered to be the major bioactive constituents. Although widely used, the exact mechanisms of ginseng and its compounds remain unclear. In this thesis we use melanophores from Xenopus laevis to investigate the effects of Panax ginseng extract G115 and its constituents on organelle transport and signalling. Due to coordinated bidirectional movement of their pigmented granules (melanosomes), in response to defined chemical signals, melanophores are capable of fast colour changes and provide a great model for the study of intracellular transport. The movement is regulated by alterations in cyclic adenosine 3’:5’-monophosphate (cAMP) concentration, where a high or low level induce anterograde (dispersion) or retrograde (aggregation) transport respectively, resulting in a dark or light cell. Here we demonstrate that Panax ginseng and its constituents ginsenoside Rc and Rd and flavonoid quercetin induce a concentration-dependent anterograde transport of melanosomes. The effect of ginseng is shown to be independent of cAMP changes and protein kinase A activation. Upon incubation of melanophores with a combination of Rc or Rd and quercetin, a synergistic increase in anterograde movement was seen, indicating cooperation between the ginsenoside and flavonoid parts of ginseng. Protein kinase C (PKC) inhibitor Myristoylated EGF-R Fragment 651-658 decreased the anterograde movement stimulated by ginseng and ginsenoside Rc and Rd. Moreover, ginseng, but not ginsenosides or quercetin, stimulated an activation of 44/42-mitogen activated protein kinase (MAPK), previously shown to be involved in both aggregation and dispersion of melanosomes. PKC-inhibition did not affect the MAPK-activation, suggesting a role for PKC in the ginseng- and ginsenoside-induced dispersion but not as an upstream activator of MAPK. / Panax ginseng är ett av de vanligaste naturläkemedlen i världen och används traditionellt för att öka kroppens uthållighet, motståndskraft och styrka. Ginseng är ett komplext ämne bestående av ett antal olika substanser, inklusive ginsenosider, flavonoider, vitaminer och enzymer, av vilka de steroidlika ginsenosiderna anses vara de mest aktiva beståndsdelarna. Flavonoider (som finns i till exempel frukt och grönsaker) och ginseng har genom forskning visat sig motverka bland annat hjärt-och kärlsjukdomar, diabetes, cancer och demens. Trots den omfattande användningen är dock mekanismen för hur ginseng verkar fortfarande oklar. I den här studien har vi använt pigmentinnehållande celler, melanoforer, från afrikansk klogroda för att undersöka effekterna av Panax ginseng på pigment-transport och dess maskineri. Melanoforer har förmågan att snabbt ändra färg genom samordnad förflyttning av pigmentkorn fram och tillbaka i cellen, och utgör en utmärkt modell för studier av intracellulär transport. Förflyttningen regleras av förändringar i halten av cykliskt adenosin-monofosfat (cAMP) i cellen, där en hög eller låg koncentration medför spridning av pigment över hela cellen (dispergering) eller en ansamling i mitten (aggregering), vilket resulterar i mörka respektive ljusa celler. Här visar vi att Panax ginseng, ginsenosiderna Rc och Rd samt flavonoiden quercetin stimulerar en dispergering av pigmentkornen. När melanoforerna inkuberades med en kombination av ginsenosid Rc eller Rd och quercetin, kunde en synergistisk ökning av dispergeringen ses, vilket tyder på en samverkan mellan ginsenosid- och flavonoid-delarna av ginseng. Ett protein som tidigare visats vara viktigt för pigmenttransporten är mitogen-aktiverat protein kinas (MAPK), och här visar vi att också melanoforer stimulerade med ginseng, men dock inte med ginsenosider eller quercetin, innehåller aktiverat MAPK. Genom att blockera enzymet protein kinas C (PKC) (känd aktivator av dispergering), minskade den ginseng- och ginsenosid-inducerade dispergeringen, medan aktiveringen av MAPK inte påverkades alls. Detta pekar på en roll för PKC i pigment-transporten men inte som en aktivator av MAPK.