Kurzreferat Unter mismatch repair-Defizienz (MMR-D) akkumulieren Mutationen durch die Fehlfunktion eines betroffenen MMR-Gens in Abhängigkeit von der Zeit und können zum Auftreten von kolorektalen Karzinomen (CRC) führen. Diese Mutationen sind beispielsweise unter MSH2-Defizienz als Mikrosatelliteninstabilität (MSI) in nicht codierenden Genomabschnitten im intestinalen Gewebe detektierbar. Die Analyse der Entwicklung der MSI im intestinalen Gewebe unter MMR-D ist im Menschen schwierig und ethisch nicht vertretbar. Eine Option der Analyse stellen Organoidkulturen, als Miniaturausgabe des intestinalen Gewebes ex vivo, dar. Ziel der Arbeit ist es, die Häufigkeit von Mutationen in Mikrosatelliten von Organoiden unter Msh2-Defizienz aus normalem Darm, Tumorvorläuferzellen und Tumoren in Abhängigkeit vom Alter der Maus, der Dauer und den Bedingungen der Organoidkultur zu quantifizieren. Dazu wurde der Mikrosatellitenstatus einzelner Organoide mit dem dazugehörigen Wachstumsmuster korreliert.   Folgende Fragen sollten beantwortet werden: Ab welchem Mausalter tritt MSI auf? Ist sie altersabhängig? Korreliert sie mit dem dazugehörigen Wachstumsmuster? Sind Tumorvorläuferzellen (Adenome) in makroskopisch normalem Gewebe vorhanden? Haben Kultivierungsdauer und -faktoren Einfluss auf die MSI und das Wachstumsmuster der Organoide? Material und Methodik Altersidentische Msh2+/+-, Msh2+/--, und Msh2-/-- Mäuse und daraus generierte Organoide wurde als Triplets generell parallel analysiert. Die Organoidkultivierung erfolgte durch Isolierung von Darmkrypten aus makroskopischem Normal- und Tumorgewebe. Das Wachstum wurde mittels life imaging aller 8 h über 144 h für jedes Organoid aufgezeichnet. Wachstumskurven wurden errechnet und das Wachstumsmuster eines Organoids wurde zu jedem Zeitpunkt klassifiziert. Die Organoide wurden nach dem life imaging gepickt und mithilfe der Mikrosatellitenmarker A27, A33, GA29 in einer Multiplex-PCR auf Alterationen analysiert. Hieraus konnte ein MSI Score, ein ∆bp Score und dazugehörige heatmaps, die die qualitativen Änderungen der Marker visuell widerspiegeln, ermittelt werden. Ergebnisse MSI ist in ISC-Organoiden von Msh2-/--Mäusen vor dem Auftreten solider Tumoren in einem Alter von 12 Monaten nachweisbar und steigt über die Lebenszeit an. Bereits in einem Alter von 5 Monaten ist der maximale MSI Score, der lediglich die Anzahl veränderter Mikrosatelliten aufzeigt, erreicht. Der ∆bp Score zeigt, dass die Längenveränderungen im Bereich der Mikrosatelliten weiter kontinuierlich zunimmt und ein mit fortschreitendem Alter progressiver Nukleotidverlust auftritt. Die Wachstumsraten und -muster der Organoide von Msh2-/--Mäusen werden mit zunehmendem Alter heterogen. Bis zu einem Mausalter von 8 Monaten zeigen die Organoide aus dem Normalgewebe der Mäuse ein homogenes, verzweigtes Wachstum. Im Alter von 12 Monaten wachsen jedoch etwa 10 % der Organoide initial zystisch, ähnlich Organoiden aus Tumorgewebe. Dieses inhomogene Wachstumsmuster ist unabhängig vom ermittelten MSI Score. Tumorvorläuferzellen akkumulieren in normalem Epithel von Msh2-/--Mäusen weit vor dem Auftreten solider Tumoren. Organoide, die ohne den Zusatz von Noggin und R-Spondin aus enzymatisch verdauten Normalgewebe anwachsen, stammen von Tumorvorläuferzellen ab. Sie können aus 8 und 12 Monate alten Msh2-/--, jedoch nicht Msh2+/-- und Msh2+/+-Mäusen isoliert werden, und weisen ein zystisches, tumorähnliches Wachstum auf. Die Wachstumsrate sowie der ∆bp Score der Organoide ist im Vergleich zu Organoiden aus Normalgewebe erhöht. Alterationen in ISC nehmen unter Langzeitkultivierung zu und akkumulieren in vitro schneller als in vivo. Organoide 8 Monate alter Mäuse wurden für weitere 18 Wochen in vitro kultiviert. Es konnte gezeigt werden, dass nach dieser Zeit im Vergleich zu 12 Monate alten Organoiden vermehrt zystisch-ähnliches Wachstum auftritt. Der ∆bp Score steigt in vítro schneller als in vivo. Acetylsalicylsäure (ASS) vermindert das Auftreten und die Länge von zystisch-ähnlichem Wachstum, verändert jedoch nicht den ∆bp Score. Nach Langzeitkultur mit ASS über 18 weitere Wochen wachsen Organoide 8 Monate alter Mäuse aller drei Genotypen seltener zystisch-ähnlich. ASS vermindert die Anwachsrate von Msh2-/--Organoiden. Der ∆bp Score ändert sich unter Substitution von ASS nicht. Fazit Organoidkulturen MMR-defizienter Mäuse geben Einblick in die gewebsspezifische Akkumulation von Mutationen in Abhängigkeit vom Alter der Tiere und den Kultivierungsbedingungen der Organoide. Sie lösen dabei ethische und gesetzliche Probleme im Umgang mit fetalen Stammzellen und stehen durch die Darstellung physiologischer und pathologischer Mechanismen, beispielsweise bei zystischer Fibrose, oralen Plattenepithelkarzinomen oder CRC im Mittelpunkt von Betrachtungen verschiedener medizinischer Fachrichtungen. Durch diese Arbeit wurden Methoden zur Quantifizierung genetischer Alterationen in ISC-Organoiden unter Msh2-Defizienz etabliert sowie Kultivierungsbedingungen zur Beeinflussung einer in vitro-Langzeitkultivierung von ISC-Organoiden charakterisiert, die als Grundlagen zur weiteren Forschung im Hinblick auf die Behandlung von HNPCC-Patienten als auch anderen Erkrankungen dienen können.:Abkürzungsverzeichnis 1. Einführung 1.1. Häufigkeit und Einteilung von kolorektalen Karzinomen 1.1.1. Genetik des HNPCC 1.1.2. Diagnosestellung und Klinik des HNPCC 1.1.3. Acetylsalicylsäure als mögliches Präventivum bei HNPCC 1.2. Mausmodelle zur Darstellung der in vivo-Situation 1.3. Organoidkultur aus intestinalen Stammzellen 2. Aufgabenstellung 3. Materialien und Methodik 3.1. Generierung der Zielmäuse 3.2. Organoidkultivierung 3.3. Analyse der Mikrosatelliteninstabilität 3.4. Analyse des Wachstumsverhaltens der Organoide 4. Ergebnisse 4.1. Korrelation der MSI von Organoiden aus Normalgewebe mit dem Alter und dem Genotyp der Mäuse 4.2. Korrelation des Wachstumsmusters der Organoide aus Normalgewebe mit dem bp Score 4.3. Korrelation der Wachstumsgeschwindigkeit der Organoide aus Normalgewebe mit dem bp Score 4.4. Nachweis von Tumorvorläuferzellen in makroskopischem Normalgewebe 4.5. Vergleich der MSI zwischen in vitro- und in vivo-gealterten Organoiden aus Normalgewebe 4.6. Auswirkung von ASS als zusätzlicher Kultivierungsfaktor auf die MSI von in vitro-gealterten Organoiden 5. Diskussion 6. Zusammenfassung 7. Literaturverzeichnis 8. Publikation - Different in vivo and in vitro transformation of intestinal stem cells in mismatch repair deficiency Tabellenverzeichnis Abbildungsverzeichnis Selbstständigkeitserklärung Lebenslauf Publikationen/Vortragsthemen Danksagung

Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen wie Colitis ulcerosa (CU) sind Risikofaktoren für die Erkrankung an Kolorektalkarzinomen (KRK) (Eaden, Abrams et al. 2001, Lutgens, Vleggaar et al. 2008). Sowohl in CU (Hussain, Amstad et al. 2000, Takaku, Ajioka et al. 2001, Leedham, Graham et al. 2009, Kakiuchi, Yoshida et al. 2020) als auch in Colitis-assoziierten KRK (CA-KRK) (Yin, Harpaz et al. 1993, Brentnall, Crispin et al. 1994, Galandiuk, Rodriguez–Justo et al. 2012, Kobayashi, Tomita et al. 2017, Baker, Cross et al. 2019) treten vermehrt epitheliale Zellklone auf, die einen Verlust an physiologischem Tumorsupressor P53 Signaling haben. Diese Klone treiben vermutlich die Karzinogenese voran (Petitjean, Achatz et al. 2007). Bislang ist jedoch nicht verstanden, durch welchen Mechanismus diese Klone Wildtypzellen verdrängen könnten, um in der Mucosa fixiert zu werden. In der vorliegenden Studie nutze ich induzierbare Trp53 Knock-Out (KO) Mäuse, mithilfe derer ich die Auswirkungen eines Verlusts von P53 im Darmepithel im Colitis-Kontext sowohl in vivo als auch in vitro untersuchen kann. Ich zeige, dass während Trp53 für die Aufrechterhaltung der epithelialen Homöstase im Colon verzichtbar ist, es nötig ist, damit Epithelzellen nach der Schädigung durch eine chemische Colitis wieder in die Homöstase zurückkehren können. Epithel, dem P53 fehlt, verharrt nach der Schädigung in einem fetalen, regenerativen Status („locked regenerative state“), welcher durch eine andauernde Aktivierung des YAP-Signalweges charakterisiert ist. Alles in allem offenbart diese Arbeit die kontextabhängige Bedeutung des P53 Signalings im Kolonepithel im regenerativen Status nach colitis-assoziierter Schädigung und gibt erste Erklärungen für die erhöhte Häufigkeit von Zellklonen mit verringertem P53 Signaling in CU und CA-KRK. / Chronic inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis (UC) are risk factors for colorectal cancer (CRC) (Eaden, Abrams et al. 2001, Lutgens, Vleggaar et al. 2008). Both in UC (Hussain, Amstad et al. 2000, Takaku, Ajioka et al. 2001, Leedham, Graham et al. 2009, Kakiuchi, Yoshida et al. 2020) and UC-associated colorectal cancer (UC-CRC) (Yin, Harpaz et al. 1993, Brentnall, Crispin et al. 1994, Galandiuk, Rodriguez–Justo et al. 2012, Kobayashi, Tomita et al. 2017, Baker, Cross et al. 2019). Cell clones that lack tumor suppressor 53 (P53) signaling are observed at high frequency and are considered drivers of carcinogenesis (Petitjean, Achatz et al. 2007). The fixation of those clones could be due to a selective advantage of mutated cells specifically in the inflammatory context (Vermeulen, Morrissey et al. 2013), however mechanistic insights why and how mutant cells could outcompete wild type (WT) cells are lacking. In the present study, I have used inducible Trp53 knock-out (KO) mice through which I investigate the impact of loss of P53 signaling in colonic epithelium in the context of colitis, both in vivo and in vitro. I show that while Trp53 is dispensable for maintenance of epithelial homeostasis in the colon, it has a crucial function in epithelial cells to make them return to homeostasis after colitis-associated injury. Integrating proteome and transcriptome data, I discover that the colonic epithelium of Trp53 KO mice fails to reestablish the homeostatic crypt architecture and is locked in a “fetal-like” regenerative state that is characterized by activated Yes-associated protein 1 (YAP) signaling. This work discloses the context-dependent relevance of P53 signaling in the injury-induced regenerative state during colitis and gives reason for the higher abundance of clones lacking P53 signaling in UC and UC-CRC. It also demonstrates, how loss of P53 could contribute to chronification of the disease and a carcinogenic trajectory in affected epithelium.

Human senses are specifically designed to recognize and understand the world that surrounds us. Even though we have five senses, vision alone is responsible for at least 30 % of the sensory input to our brain. The visual process is initiated in a highly specialized cell type, the photoreceptors. These are light-sensitive cells located in the retina, a layered nervous tissue situated at the back of the eye. Retinal degeneration diseases are a highly heterogeneous group of conditions that include mutations affecting the survival, maintenance and proper functioning of photoreceptors or the adjacent retinal pigment epithelium (RPE). Such mutations, alone or in combination with environmental factors, cause the loss of the affected cells, and therefore, impairment of the visual sense. Retinitis Pigmentosa and Age-related Macular Degeneration are typical examples of retinal degenerative diseases eventually leading to blindness. In the first one, rod photoreceptors degenerate and consequently also cone photoreceptors are lost. The second is characterized by malfunction and loss of both, RPE and photoreceptor cells. Many current therapeutic approaches for the treatment of retinal degenerative diseases focus on slowing down the progression of the disease, rather than restoring the visual function. Currently, new therapies with the potential to recover the visual signal are under development. Some of these therapeutic strategies have already reached clinical stages, including gene therapy or retinal prosthesis. However, gene therapy approaches require the presence of remaining photoreceptors and, furthermore, particular targeting of disease-related genes. Retinal prosthesis still require improvement in terms of long-term biocompatibility and relevant visual function recovery. An alternative strategy for vision restoration is cell replacement of the lost photoreceptors, which is potentially suitable for targeting late stages of retinal degeneration diseases, independently of the inherent cause of the disease. Human vision relies primarily on cone photoreceptors, which are the cells responsible for color and high acuity vision under daylight conditions. However, cones represent a minority of the photoreceptors within the retina, and so, due to the low availability of these cells, cone photoreceptor transplantation studies lag behind rod transplantation studies. Consequently, in this study, strategies to increase the numbers of cone photoreceptors within mouse embryonic stem cells (mESC)-derived retinal organoids, which represent a potential cell source for transplantation studies, were explored. In this regard, I manipulated developmental pathways known to be involved in retinal development, such as Notch signaling, through the addition of various compounds in the retinal organoid maturation media. However, early cone markers have not yet been definitively identified, complicating the detection and isolation of cone photoreceptor precursors within the organoids. Therefore, a new early cone-reporter mESC line was generated in the course of this study as a valuable tool with the potential to facilitate the development of novel cone photoreceptor replacement therapies. Equally important in the field of photoreceptor cell replacement is the understanding of how the transplanted donor cells interact with the host retina. Previous studies have shown that visual function improvement is possible after transplanting rod or cone-like photoreceptor precursors into the sub-retinal space of mouse models for retinal degeneration. For many years it has been assumed that the underlying mechanism for the observed vision improvement was the migration and structural integration of donor cells into the host outer nuclear layer, where they mature and establish synaptic connections with the host retinal circuitry. However, experiments performed in this study demonstrate, for the first time, that upon transplantation donor and host photoreceptors exchange cytoplasmic material rather than structurally integrate into the host outer nuclear layer. Furthermore, insights into the transferred cytoplasmic content are given, i.e. that mRNA, but not mitochondria are exchanged by donor and host photoreceptors. This novel way of photoreceptor-photoreceptor communication led to a paradigm change in the field of retinal transplantation, requiring a re-interpretation of former transplantation studies. In addition, the discovery of the material transfer phenomenon might serve as a starting point for the development of novel therapeutic strategies based on cell-cell support for the treatment of retinal degenerative diseases. This study generated new knowledge in two important topics related to the development of cell therapies for retinal degeneration diseases, including the development of tools for cone transplantation studies as well as elucidating the interaction between donor and host cells upon transplantation.

Gastric cancer is the second leading cause of cancer related deaths and the fifth most common malignancy worldwide. The prognosis of gastric cancer is often poor. Frequently, the lack of clinical signs lead to a delayed diagnosis with three quarters of patients presenting with non-curable advanced disease. The only curative option is surgery, supported in recent years by perioperative chemotherapy. However, known molecular alterations represent possibilities for targeted therapies to improve overall survival. Nevertheless, biomarkers to predict therapy response are missing, resulting in several failed clinical trials for targeted drugs. Organoids are a recently developed three-dimensional culture system derived from different sources, i.e. adult tissue stem cells, embryonic stem cells (ESC) or induced pluripotent stem cells (iPSC). While in ESC or iPSC derived organoids a functional niche is present that maintains stem cells, this niche is missing in adult stem cell derived organoids and needs to be replaced by a definite medium containing the relevant growth factors. Organoids have the ability of proliferation, self-renewal and self-organization. They show a comparable functionality of the organs they are derived from. In sum, organoids are valuable tools to study diseases on a patient level. In this work, we focused on the characterization of gastric cancer by using human and mouse cancer organoids. Firstly, a human gastric cancer organoid biobank was established. The patient derived organoid lines were characterized concerning their molecular profile, treated with classical chemotherapeutics and mutation specific targeting was performed. The generated human cancer organoids showed a high similarity to the tissue they were derived from and allowed a detailed analysis of observed alterations for each individual patient. However, the high number of mutations effected targeted therapies and needed to be interpreted in the whole mutation spectrum of each specific organoid line. In order to establish organoids with defined mutations for in depth analysis of pathway interference, we decided to combine inducible alleles of frequently altered signaling pathways in gastric cancer in mice and derived organoids of the stomach. These organoid lines were further analyzed by their morphology, functionality and drug response. Successful interference with activated pathways demonstrated their potential usefulness as living biomarkers for therapy response testing. In order to analyze gastric cancer in vivo a stomach specific mouse model was established. Intensive literature and database research resulted in the identification of Annexin10 (Anxa10) as potential stomach specific gene which at the same time is expressed in all different cell types of the stomach epithelium. We therefore generated an inducible Cre recombinase mouse line under the Anxa10 promotor. The Anxa10 CreERT2 line showed only stomach specific recombination events and no restriction to a specific cell type. Nevertheless, activation of Cre resulted in a patchy recombination pattern throughout the whole gland and not a uniform recombination in all cells. Due to this patchy expression, the mouse line is an optimal tool for cancer models, where a complete transformation of an organ is not desired. On the other side it is not useful, if a complete knock-out of a certain floxed allele is needed. This new stomach specific mouse line was then used to model gastric cancer subtypes in vivo. Frequently altered pathways and hotspot mutations of each gastric cancer subtype were defined based on the TCGA database. Alterations were mainly found in the following pathways: RTK/RAS, PI3K/AKT, WNT, TGF β, cell adhesion and chromatin remodelling. We generated and analyzed three different mouse models: one for the chromosomal instability (CIN) subtype and two for the genomically stable (GS) subtype. The different models mimicked very closely the histology of known human gastric cancer subtypes. The intestinal CIN model with mutations in Kras, Smad4 and Tp53 developed tumors with glandular and tubular structures showing morphologies to human intestinal type gastric cancer. The first GS model with alterations in Kras, Cdh1 and Smad4 showed cancers with a diffuse tumor cell morphology with the presence of typical signet ring cells. The second GS model with Kras, Cdh1 and Apc alterations showed similarities to the adenomatous tooth like gastric cancer subtype. Taken together, this study demonstrates that gastric cancer organoids might serve as living biomarkers to predict therapy response and resistance in individual patients. Additionally, the generated gastric cancer mouse model is to our knowledge the first model initiating tumor formation exclusively in the stomach with similar characteristics as described for human gastric cancer. This mouse represents a prime tool for further gastric cancer research.

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Das Protozoon Giardia duodenalis ist eine der Hauptursachen für infektiöse Magen-Darm-Erkrankungen. Die zugrundeliegenden Pathomechanismen sind jedoch nach wie vor unklar. Um die Pathogenität G. duodenalis‘ untersuchen zu können, wird ein Modellsystem benötigt, dass die Komplexität des Darmepithels widerspiegelt. Diese Arbeit zeigt die Etablierung eines Zellkultursystems auf der Basis von organoid-abgeleiteten Epithelien unter Verwendung von filter-basierten Zellkultureinsätzen. Wir haben Protokolle für die Etablierung von organoid-basierten Zellkulturen (ODMs) vier verschiedener Wirte zoonotischer Protozoen unter Verwendung eines einzigen Protokolls erstellt. Die Charakterisierung zeigte, dass das Modellsystem erfolgreich die Polarisierung des Darmepithels nachahmt, aus mehreren Zelltypen besteht und eine Infektion ermöglicht. Der Schwerpunkt der Arbeit lag auf der Analyse der durch G. duodenalis induzierten Barrierestörung in ODMs auf Transkriptions-, Protein- und Funktionsebene. Die Infektion von humanen duodenalen Zellen führte zu einem Verlust der epithelialen Barrierefunktion. Mit Hilfe des transepithelialen elektrischen Widerstandes und Dextran Flux wurde eine Erhöhung der Barrieredurchlässigkeit beobachtet. Die Hemmung von zuvor in immortalisierten Zellmodellen beschriebenen Reaktionswegen konnte die Barrierefunktion nicht wiederherstellen. Stattdessen konnten Veränderungen der Ionenhomöostase sowie den Zusammenbruch der zonula occludens nachgewiesen werden. Der beobachtete Phänotyp konnte auf die Aktivierung des cAMP/PKA/CREB-Signalwegs, als einen von mehreren kausalen Faktoren, zurückgeführt werden. Hier zeigen wir die Etablierung eines aus Organoiden abgeleiteten Modells, das die Untersuchung von G. duodenalis Infektionen in vitro ermöglicht. Mit unserem Modell konnten wir eine neue Reihenfolge von Ereignissen entschlüsseln, die einen der Faktoren während symptomatischer Giardiasis darstellt. / The protozoan Giardia duodenalis is a one of the major causes of gastrointestinal illness. Underlying pathomechanisms remain unclear. An in vitro model system that also mimics the complexity of intestinal epithelium is needed to allow pathogenicity studies. This thesis shows the establishment of a cell culture system based on organoid-derived epithelia using permeable cell culture inserts. We have provided guidelines on the establishment of organoid-derived monolayers (ODMs) of four different hosts of zoonotic protozoa using a single protocol. Characterization showed that the model system successfully mimics intestinal polarization, is composed of multiple cell types and allows for infection with multiple protozoan parasites. As the main focus of the thesis, analysis of G. duodenalis-induced barrier breakdown in ODMs was performed on transcriptional, protein and functional level. Infection of human duodenal, organoid-derived monolayers resulted in a time- and dose-dependent breakdown of epithelial barrier function. Barrier permeability increases were observed ranging from ions to macromolecules as measured by transepithelial electrical resistance and Dextran flux. Inhibition of previously proposed key pathogen-induced pathways observed in immortalized cell models did not rescue barrier dysfunction. We could instead show changes in ion homeostasis, and tight junctional breakdown. While none of the previously proposed effector pathways appeared to be responsible, we could pin-point the observed phenotype to activation of the cAMP/PKA/CREB signaling pathway, as one of the factors of the multifactorial barrier breakdown. The establishment of an organoid-derived infection model is shown, allowing the study of in vitro Giardia duodenalis infections. Using this model, we could decipher a new series of events that may be one of the factors causing the intestinal barrier breakdown observed in symptomatic Giardiasis.

Gastric cancer ranks the fifth most common and third leading cause of cancer‐related deaths worldwide. Alterations in the RTK/MAPK, WNT, cell adhesion, TP53, TGFβ, NOTCH, and NFκB signaling pathways could be identified as main oncogenic drivers. A combination of altered pathways can be associated with molecular subtypes of gastric cancer. In order to generate model systems to study the impact of different pathway alterations in a defined genetic background, we generated three murine organoid models: a RAS‐activated (KrasG12D, Tp53R172H), a WNT‐activated (Apcfl/fl, Tp53R172H), and a diffuse (Cdh1fl/fl, Apcfl/fl) model. These organoid models were morphologically and phenotypically diverse, differed in proteome expression signatures and possessed individual drug sensitivities. A differential vulnerability to RTK/MAPK pathway interference based on the different mitogenic drivers and according to the level of dependence on the pathway could be uncovered. Furthermore, an association between RTK/MAPK pathway activity and susceptibility to HDAC inhibition was observed. This finding was further validated in patient‐derived organoids from gastric adenocarcinoma, thus identifying a novel treatment approach for RTK/MAPK pathway altered gastric cancer patients.

Darmkrebs ist ein weit verbreitetes Leiden, das durch erworbene, überwiegend sequenzielle Mutationen in einer kleinen Zahl Onkogene verursacht wird. Diese beeinflussen die zelluläre Signalübertragung. Um Auftreten und Progression kolorektaler Karzinome zu verstehen, müssen daher Transkriptome, Phosphoproteome und phänotypische Proteinmarker individueller Zellen berücksichtigt werden. Die Einzelzell-RNS-Sequenzierung bietet die erste dieser Fähigkeiten, während Techniken zur Messung von Proteinen auf Einzelzellebene noch wenig verbreitet sind. Hauptziel meiner Forschung war es, Massenzytometrie für Darmkrebsmodelle anzupassen und so Studien intrazellulärer Signalnetzwerke zu ermöglichen. Auf Basis etablierter Protokolle habe ich eine Methodologie entwickelt, mit der sich epitheliale Zellkulturen untersuchen lassen. Außerdem habe ich Best Practices für die Analyse von Massenzytometriedaten aufgestellt. So konnte ich zeigen, dass die Aktivierung des ERK-Signalwegs in KRAS-aktivierten Dünndarmorganoiden transgener Mäuse graduell unterschiedlich ist. Bei Aktivierung von BRAF, dem direkten Aktivierungsziel von KRAS, geht diese Eigenschaft verloren. Ich habe Statistik angewendet, um Zelltypeigenschaften aus dem Massenzytometrie-Datensatz zu extrahieren. So konnte ich zeigen, dass onkogenes KRAS zwar nicht den ERK-Signalweg signifikant aktiviert, aber die gesamte Zellpopulation in Richtung eines Stammzellphänotyps verschiebt. Mithilfe einer Serie von sequenziell CRISPR-mutierten humanen Kolonorganoiden untersuchte ich anschließend, wie sich Signalaktivität und Zellphänotypen in Abhängigkeit einzelner Onkogene der Darmkrebsentwicklung verändern. Auf Basis des intestinalen Kryptenmarkers EphB2 definierte ich dafür eine Pseudo-Differenzierungsachse. Meine Ergebnisse zeigen, dass sich die gesamte Zellpopulation während der Darmkrebsentstehung zwar in Richtung Stammzelligkeit verschiebt, diese Progression jedoch nicht durch jedes Onkogen gleichermaßen vorangetrieben wird. / Colorectal cancer (CRC) is a widespread disease caused by acquired, predominantly sequential, mutations in a limited set of oncogenes. They in turn influence cellular signalling and enable clonal advantages of tumour cells over their surrounding stroma. To understand the emergence and progression of CRC it is therefore crucial to assess transcriptomes, phospho-proteomes, and phenotype protein markers of individual cells. Single-cell RNA sequencing already enables the foremost of these capabilities while single-cell (phospho)-proteomic techniques are not yet widely established. Primary goal of my research was adapting mass cytometry (MC) for 2D and 3D CRC model systems and characterising cell signalling as well as phenotype changes in intestinal 3D organoids during CRC progression. Based on established MC protocols I devised a methodology suited for measuring epithelial cell cultures and also best practices for data analysis. With this set of tools I could show that ERK signalling is graded in KRAS-activated mouse small intestinal organoids, but not when KRAS downstream target BRAF is mutated active. I used principal component analysis (PCA) and k-means clustering to extract cell-type information from the MC dataset and could show that while oncogenic KRAS does not significantly change downstream ERK signalling, it globally shifts cells towards a crypt-like phenotype. Using a series of sequentially CRISPR-mutated human colon organoids I then investigated how signalling and cell phenotypes change in response to each newly acquired oncogene of the canonical CRC progression. Based on intestinal crypt-to-villus marker EphB2, I defined a pseudo-differentiation axis. My findings showed that, although cells generally shift towards a stem-like cell phenotype during CRC progression, this shift is not continuous.

Hintergrund: Das Baraitser-Winter-Zerebro-Fronto-Faziale-Syndrom (BWCFF-S) gehört mit einer Prävalenz von 1:1.000.000 zu den sehr seltenen genetischen Krankheiten und wird durch Missense-Mutationen in den Genen ACTB und ACTG1, die die zytoplasmatischen Aktin-Isoformen βCYA und γCYA kodieren, verursacht. Neben multiplen fazialen Dysmorphien und Skelettfehlbildungen weisen bis zu 70 % der Patient*innen kortikale Malformationen wie Mikrozephalie und Lissenzephalie auf, deren ursächlichen Pathomechanismen bisher noch nicht erforscht wurden. Ebenso wenig ist über das Expressionsmuster von βCYA und γCYA im humanen Gehirn während der embryonalen Entwicklung bekannt. Die Generierung von zerebralen Organoiden durch Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen (induced pluripotent stem cells, iPS-Zellen), die aus primären Zellen von Patient*innen reprogrammiert werden können, eröffnet neue Möglichkeiten, die Neurogenese und Kortikogenese zu studieren sowie zelluläre Krankheitsmodelle zu entwickeln. Material und Methoden: Das Expressionsmuster von βCYA und γCYA wurde mittels Immunfluoreszenz in humanem fetalem Gehirngewebe sowie zerebralen Organoiden charakterisiert. Aus den iPS-Zelllinien der BWCFF-S-Patientinnen mit Mutationen in jeweils einem Aktin-Gen (ACTB p.Thr120Ile und ACTG1 p.Thr203Met) sowie gesunden Kontrollen wurden unter der Verwendung von zwei Protokollen nach gerichteter und ungerichteter Differenzierung zerebrale Organoide generiert und diese charakterisiert. Mithilfe des CRISPR/Cas9-Systems wurden die gleichen Mutationen in ACTB und ACTG1 in iPS-Zellen der Kontroll-Zelllinien CRTDi011-A und SC102A-1 editiert. Zerebrale Organoide, die nach dem ungerichteten Protokoll differenziert wurden, wurden durch Immunfluoreszenz- und TEM-Analysen hinsichtlich ihrer Zytoarchitektur, Zelltypen und Aktin-Verteilung untersucht. Außerdem wurden Apoptose, Proliferation und Ausrichtung der Zellteilungsebenen der apikalen Progenitorzellen analysiert. Unter Verwendung der RNA-Einzelzell-Sequenzierung wurden die Zellpopulationen von zerebralen BWCFF-S- und Kontroll-Organoiden an zwei unterschiedlichen Kultivierungs-Zeitpunkten analysiert. Zudem wurden Kontroll-iPS-Zellen in neurale Progenitorzellen (neural progenitor cells, NPCs) differenziert, um die intrazelluläre Lokalisierung der Aktin-Isoformen mit Immunfluoreszenz-Analysen zu bestimmen. Unter Durchführung von Migrationsassays mit Neurospäroiden und zerebralen Organoiden wurden die Migrationseigenschaften der neuralen BWCFF-S-Zellen untersucht. Ergebnisse: In dieser Arbeit wurde das Expressionsmuster der Aktin-Isoformen βCYA und γCYA im humanen fetalen Gewebe, in zerebralen Organoiden sowie in NPCs und Neuronen analysiert. Im humanen fetalen Gewebe und in den zerebralen Organoiden zeigte sich ein überlappendes Expressionsmuster von beiden Isoformen in allen Schichten des Neokortex. Im Gegensatz dazu wiesen Immunfluoreszenz-Färbungen in kultivierten NPCs und Neuronen eine Isoform-spezifische Lokalisierung von βCYA und γCYA auf, mit einer Anreicherung von βCYA im Zellkortex und in den Zellfortsätzen der NPCs, wohingegen γCYA im Zytosol angereichert war. In Neuronen wurde eine stärkere Lokalisierung von βCYA im Wachstumskegel und von γCYA in den Neuriten festgestellt. Zudem wurde die Kultur zerebraler Organoide für die Modellierung des BWCFF-S erfolgreich etabliert. BWCFF-S-Organoide waren im Vergleich zur Kontrolle in ihrer Gesamtgröße signifikant reduziert und zeigten auch kleinere ventrikulären Zonen (VZs) in den Ventrikel-ähnlichen Strukturen. Als Ursache für diese Größenunterschiede konnte die veränderte Ausrichtung der Teilungsebene der apikalen Progenitorzellen (APs) in der Anaphase von vertikal zu horizontal und damit der Wechsel von symmetrischer zu asymmetrischer Teilung festgestellt werden, im Zusammenspiel mit einer abnormalen Anreicherung von Mikrotubuli an der ventrikulären Oberfläche in den Ventrikel-ähnlichen Strukturen. Die RNA-Einzelzell-Sequenzierung der zerebralen Kontroll- und BWCFF-S-Organoide zeigte eine Veränderung der Zellpopulation mit einer reduzierten Anzahl von radialen Gliazellen (RGs) und Neuronen in den BWCFF-S-Organoiden. Die BWCFF-S-ähnlichen Organoide mit der Mutation ACTB p.Thr120Ile, die durch Gen-Editierung der Kontroll-Zelllinie CRTDi011-A generiert wurden, zeigten nahezu in allen Analysen vergleichbare Ergebnisse wie die Patientinnen-eigenen BWCFF-S-Organoide mit derselben Mutation und belegten somit, dass sich durch Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems isogene Kontrollen herstellen lassen. Durch Migrationsassays mit Neurosphäroiden und Organoiden konnte eine gravierend veränderte Migration der neuralen BWCFF-S-Zellen mit der Mutation ACTB p.Thr120Ile festgestellt werden. Schlussfolgerung: Die Modellierung des BWCFF-S in den zerebralen Organoiden entschlüsselte den zellulären Pathomechanismus der mikrozephalen kortikalen Malformation. Die Veränderung der Ausrichtung der mitotischen Spindel in den APs und dem dadurch entstehenden Wechsel von symmetrischer zu asymmetrischer Teilung führt zu einer Reduktion des Progenitorzellpools und einer verfrühten Neurogenese. Die verringerte Anzahl der Progenitorzellen in der VZ der zerebralen Organoide spiegelt sich in der verminderten Größe der VZs wider. Beide BWCFF-S-assoziierten Mutationen in den Genen ACTB und ACTG1 führten zu einer veränderten Ausrichtung der Teilungsebene in den APs. Die deutliche Einschränkung der neuralen Migration wurde jedoch nur bei Zellen mit der Mutation ACTB p.Thr120Ile festgestellt, was einen ersten Hinweis auf die Isoform-spezifische Funktion der beiden Aktinproteine liefert.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis V Abbildungsverzeichnis X Tabellenverzeichnis XIII 1. Einleitung 1 1.1. Baraitser-Winter-Zerebro-Fronto-Faziales-Syndrom 1 1.1.1. Das klinische Bild und genetische Ursachen 1 1.1.2. Neurologische Symptome und kortikale Malformationen beim BWCFF-S 3 1.2. Aktin 5 1.2.1. Die sechs Aktin-Isoformen 5 1.2.2. Das Aktin-Zytoskelett 5 1.2.3. Die Funktionen des Aktin-Zytoskeletts 8 1.2.4. Das Aktin-Zytoskelett im zentralen Nervensystem (ZNS) 10 1.3. Neuro- und Kortikogenese des humanen Gehirns 12 1.4. Zerebrale Organoide als Modellsysteme für neurologische Entwicklungsstörungen 15 1.5. Ziele dieser Arbeit 20 2. Material 21 2.1. Geräte und Verbrauchsmaterialien 21 2.2. Chemikalien und Kits 23 2.3. Lösungen für die Molekularbiologie 25 2.4. Medien für die Zellkultur 25 2.5. Puffer und Lösungen für Immunfluoreszenz-Analysen 27 2.6. Primer 28 2.7. Guide RNAs (gRNAs), Templates und Cas9 28 2.8. Primäre Antikörper 29 2.9. Sekundäre Antikörper und DNA-Fluoreszenzfarbstoff 30 2.10. Zelllinien 30 2.11. Humanes fetales Gehirngewebe 32 2.12. Software 33 3. Methoden 34 3.1. Molekularbiologische Methoden 34 3.1.1. DNA-Isolierung 34 3.1.2. Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) 34 3.1.3. Gelelektrophorese 35 3.1.4. Aufreinigung der PCR-Produkte 35 3.1.5. Sanger-Sequenzierung 36 3.2. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) 36 3.2.1. Reprogrammierung von dermalen Fibroblasten in iPS-Zellen 36 3.2.2. Kultivierung der iPS-Zellen 37 3.2.3. Gen-Editierung der iPS-Zellen mit CRISPR/Cas9 37 3.3. Differenzierung von iPS-Zellen in neurale Progenitorzellen (neural progenitor cells, NPCs) und Neurone 39 3.3.1. Kultivierung von Neuronen im XonaChip® 39 3.4. Differenzierung von iPS-Zellen in Vorderhirn-Organoide (forebrain organoids) 40 3.5. Differenzierung von iPS-Zellen in zerebrale Organoide (whole brain organoids) 42 3.6. Migrationsassay mit Neurosphäroiden 43 3.7. Migrationsassay mit zerebralen Organoiden (radiale Migration) 44 3.8. Immunfluoreszenz-Analysen 44 3.8.1. Färbeprotokoll für βCYA und γCYA in Einzelzellen, Organoiden und humanem fetalem Gewebe 45 3.8.2. Protokoll für Immunfluoreszenz-Färbungen mit Antigen-Demaskierung durch Sieden 45 3.9. Mikroskopie 46 3.10. Bildanalyse und Datenerhebung 46 3.10.1. Bildbearbeitung der Immunfluoreszenz-Aufnahmen für die Analyse der Verteilung von βCYA und γCYA in Einzelzellen, zerebralen Organoiden und humanem fetalen Gehirngewebe 46 3.10.2. Bildbearbeitung der Immunfluoreszenz-Aufnahmen von Einzelzellen und zerebralen Organoide 47 3.10.3. Quantifizierungen verschiedener Größen der zerebralen Organoide 47 3.10.4. Bildbearbeitung der Aufnahmen der zerebralen Organoide nach dem Migrationsassay 49 3.11. Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) 49 3.12. RNA-Einzelzell-Sequenzierung von zerebralen Organoiden 50 3.13. Analyse der RNA-Einzelzell-Sequenzierdaten der zerebralen Organoide 50 3.14. Statistik 51 4. Ergebnisse 53 4.1. Bestätigung der pathogenen Aktin-Varianten in den Patientinnen-spezifischen iPS- und editierten iPS-Zelllinien 53 4.2. Die beiden Aktin-Isoformen βCYA und γCYA zeigen ein überlappendes Expressionsmuster im humanen fetalen Gewebe des Neokortex 55 4.3. Isoform-spezifische intrazelluläre Anreicherung von βCYA und γCYA in neuralen Progenitorzellen (neural progenitor cells, NPCs) und Neuronen 58 4.4. Gehirn-Organoide als Krankheitsmodell für die BWCFF-S-assoziierten kortikalen Malformationen 62 4.4.1. Das Vorderhirn-Protokoll konnte nicht reproduziert werden 62 4.4.2. Differenzierung von Kontroll- und BWCFF-S-iPS-Zelllinien in zerebrale Organoide nach dem Lancaster-Protokoll und erfolgreiche Etablierung des Organoidmodells für Analysen des zellulären Pathomechanismus des BWCFF-S 63 4.5. Zerebrale BWCFF-S-Organoide rekapitulieren die mit dem BWCFF-S-assoziierte Mikrozephalie 64 4.5.1. Die Analyse der Lokalisierung von βCYA und γCYA zeigt keine Unterschiede zwischen zerebralen Kontroll- und BWCFF-S-Organoiden und ist ähnlich der Verteilung im humanen fetalen Neokortex 67 4.5.2. Zerebrale BWCFF-S-Organoide sind signifikant kleiner im Vergleich zu Kontroll-Organoiden 70 4.5.3. BWCFF-S-Organoide zeigen eine signifikant verminderte Größe der Ventrikel-ähnlichen Strukturen mit reduzierter Anzahl der Progenitorzellen 75 4.5.4. BWCFF-S-Organoide zeigen keine Unterschiede in Proliferation und Apoptose im Vergleich zu Kontroll-Organoiden 78 4.5.5. Apikale Progenitorzellen (APs) von BWCFF-S-Organoiden teilen sich vermehrt horizontal statt vertikal 81 4.5.6. Geneditierte BWCFF-S-ähnliche Organoide zeigen ebenfalls eine Veränderung in der Ausrichtung der Zellteilungsebene im Vergleich zur Kontrolle 82 4.5.7. BWCFF-S-Organoide zeigen eine veränderte Morphologie des Adhäsions-Verbindungsgürtels mit apikaler Anreicherung von Mikrotubuli in Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM)- und Immunfluoreszenz-Analysen 85 4.5.8. Geneditierte BWCFF-S-ähnliche Organoide zeigen ebenfalls eine abnormale Morphologie des Adhäsions-Verbindungsgürtels mit einer Anreicherung von Mikrotubuli an der apikalen Oberfläche der VZ 89 4.6. BWCFF-S-NPCs zeigen ein abnormales Migrationsver-halten im Neurosphäroid-Migrationsassay 91 4.7. Zerebrale BWCFF-S-Organoide mit ACTB p.Thr120Ile zeigen kaum Migration von neuralen Zellen 93 4.8. Die RNA-Einzelzell-Sequenzierung zeigt Veränderungen in den Zellpopulationen von BWCFF-S-Organoiden und eine reduzierte Anzahl der RGs und Neurone 96 5. Diskussion 106 5.1. βCYA und γCYA zeigen in Gewebeschnitten des humanen fetalen Neokortex sowie zerebralen Organoiden ein überlappendes Expressionsprofil, weisen aber intrazellulär eine Isoform-spezifische Anreicherung auf 107 5.2. Zerebrale Organoide eignen sich für die Modellierung der mit dem BWCFF-S-assoziierten kortikalen Malformationen 108 5.3. Die asymmetrische, horizontale Zellteilung von APs in BWCFF-S-Organoiden führt zu einer vorzeitigen Neurogenese und erklärt die mit dem BWCFF-S-assoziierte Mikrozephalie 110 5.4. Die Änderung der Orientierung der mitotischen Spindel in den apikalen Progenitorzellen weist auf eine gestörte Interaktion zwischen Mikrotubuli und dem Aktin-Zytoskelett hin 113 5.5. Die BWCFF-S-Organoide zeigen keine grundlegenden strukturellen Veränderungen der AJ 114 5.6. Editierte BWCFF-S-ähnliche Organoide mit cr. ACTB p.Thr120Ile zeigen eine ähnliche Pathologie wie BWCFF-S-Organoide mit ACTB p.Thr120Ile 115 5.7. Limitationen des zerebralen Organoidmodells müssen bei der Krankheitsmodellierung berücksichtig werden 117 5.8. Die BWCFF-S-Mutation ACTB p.Thr120Ile führt zu Migrationsstörungen von neuralen Zellen 119 5.9. BWCFF-S-Organoide haben eine reduzierte Anzahl von RGs und Neuronen 120 6. Ausblick 123 7. Zusammenfassung 125 8. Summary 128 9. Literaturverzeichnis 130 10. Anhang 142 10.1. Charakterisierung der reprogrammierten und editierten iPS-Zellklone 142 10.2. Auswertungsstrategie für die intrazelluläre Verteilung von βCYA und γCYA in NPCs und Neuronen 146 10.3. Werte der Winkel der Zellteilungsebenen der APs in der Anaphase 146 10.4. Immunfluoreszenz-Analysen des Adhäsions-Verbindungs-gürtels 148 10.5. Zusätzliche Daten der RNA-Einzelzell-Sequenzierung 149 11. Danksagung i 12. Veröffentlichungen iv 13. Erklärung zum Antrag auf Eröffnung des Promotionsverfahrens vi 14. Eidesstattliche Versicherung vii

Das normale Kolonepithel weist eine strenge Zellhierarchie auf, die aus bekannten Zelltypen besteht. Bei Darmkrebs (CRC) ist die Struktur weniger konserviert und nicht gut verstanden. Krebsauslösende Mutationen können die Prävalenz von Zelltypen verändern, und Zellen können sich auch dedifferenzieren, um einer gezielten Krebstherapie zu entgehen. Mein Ziel ist es, die Existenz heterogener Zelltypen in Organoiden zu bestätigen und Signalnetzwerke in CRC zu untersuchen, indem ich mit pharmakologischen Eingriffen spezifische Signalwege inhibiere, die Zellhierarchien im normalen Darm kontrollieren. Strategisch ausgewählte Medikamente wurden eingesetzt, um Knotenpunkte in verschiedenen Signalwegen zu hemmen, die für das Fortschreiten von Darmkrebs relevant sind. Ich untersuchte, ob die Inhibition von Signalwegen die Zusammensetzung der Zelltypen und den Differenzierungszustand verändert oder welche Kombinationen von Inhibitoren Plastizität oder Apoptose auslösen könnten. Von Patienten stammende Organoide mit verschiedenen onkogenen Treibermutationen wurden kultiviert und 48 Stunden lang mit einer Reihe von Inhibitoren und Inhibitorkombinationen behandelt. Diese Organoide wurden hauptsächlich auf zwei Ebenen untersucht: durch scRNA seq zur Ermittlung ihres Transkriptoms und durch CyTOF, das die Proteinhäufigkeit pro Zelle misst, um die Aktivität von Signaltransduktionskaskaden zu beurteilen. Beide Methoden wurden eingesetzt, um die Heterogenität des CRC zu quantifizieren. Ich konnte feststellen, dass sich Organoide mit denselben Treibermutationen ähnlicher verhalten und dass die molekularen Grundlagen der verschiedenen Linien Unterschiede im Therapieerfolg bedingen. Heterogene Transkriptome und Proteinexpression wurden durch einen Differenzierungsgradienten beeinflusst und konnten durch die Zugabe von Inhibitoren verändert werden. Die MAPK-Aktivität folgt diesem Differenzierungsgradienten und eine MAPK-Inhibition verringerte die Zellheterogenität und führte zu Plastizität. Darüber hinaus stellte ich fest, dass ein Teil der Zellen in Apoptose geht und die verbleibenden Zellen einen nicht-proliferativen Stammzellzustand annehmen, der es den Zellen ermöglicht, sich nach Aussetzung der Behandlung zu erholen. Es wurden in silico und in vitro Analysen durchgeführt, um neuartige Inhibitorkombinationen zur Maximierung der Apoptose in CRC-Organoiden zu finden, um die Entstehung therapieresistenter Subpopulationen weiter zu reduzieren. Wirksame Behandlungskombinationen bleiben jedoch zelllinienabhängig. Durch die getrennte Analyse des Zelldifferenzierungszustands und des Zellsignalisierungszustands habe ich dazu beigetragen zu verstehen, wie Tumorzellen einer gezielten Therapie durch nicht-genetische Resistenzmechanismen entgehen können. Die MAPK-Inhibition zur Verringerung der Zellheterogenität in Kombination mit anderen Inhibitoren könnte in Zukunft zur Optimierung des Therapieerfolgs eingesetzt werden. / Normal colon epithelium has a strict cell hierarchy consisting of well-known cell types. In colorectal cancer (CRC) the structure is less conserved and poorly understood. Cancer driver mutations may modulate the prevalence of cell types, and cells may also dedifferentiate to overcome targeted cancer therapy. My aim is to confirm the existence of heterogeneous cell types in organoids and investigate signaling networks in CRC by targeting specific signaling pathways with pharmacological intervention, which control cell hierarchies in the normal intestine. Strategically selected drugs were used to inhibit nodes in different signaling pathways relevant to the progression of CRC. I explored whether signaling inhibition changes cell type composition and differentiation state, or which inhibitor combinations might induce plasticity or apoptosis. Patient-derived organoids with different oncogenic diver mutations were cultured and treated with a panel of inhibitors and inhibitor combinations for 48 hours. These organoids were mainly examined on two levels: by scRNA seq to assess their transcriptome and by CyTOF, which measures protein abundance to assess the activity of pathways. Both methods were used to quantify CRC heterogeneity. I was able to see that organoids with the same driver mutations behave more similarly and that the molecular underpinnings of the different lines drive differences in therapy response. Heterogeneous transcriptomes and protein expression were affected by a differentiation gradient and could be altered by inhibitor addition. MAPK activity was graded along this differentiation gradient, and MAPK inhibition reduced cell heterogeneity and induced plasticity. Additionally, I found that a fraction of cells undergo apoptosis, and the remaining cells adopt a non-proliferative stem cell state, which allows cells to recover after suspension of treatment. \textit{In silico} and \textit{in vitro} analyses were performed to find novel inhibitor combinations to maximize apoptosis in CRC organoids to further reduce the emergence of therapy-resistant subpopulations. However, effective treatment combinations remain cell-line dependent. By separately analyzing cell differentiation state and cell signaling state I contributed to our understanding of how tumor cells can evade targeted therapy by non-genetic resistance mechanisms. Using MAPK inhibition to reduce cell heterogeneity in combination with other inhibitors may be used in the future to optimize therapy success.