La rétinol déshydrogénase est suggérée comme une enzyme importante dans le métabolisme des rétinoïdes (Vitamine A). Elle appartient à la superfamille des déshydrogénases/réductases à chaîne courte et catalyse la transformation du rétinol à l'aldéhyde correspondant. En fait, le clonage de la rétinol déshydrogénase humaine de type 16 (RDH16) par l'isolation de son ADNc, et la construction d'un vecteur d'expression qui exprime de façon stable l'enzyme ciblée, nous a permis de déterminer l'activité qui lui est attribuée. En effet, en transfectant le vecteur dans les cellules HEK-293, nous avons pu démontrer que la RDH16 possède aussi une activité 3aoxydative puisqu'elle catalyse la transformation du 5ct-androstane-3a,17p-diol (3a-diol) en dihydrotestostérone (DHT). Cette transformation représente une source de production d'androgènes, laquelle est différente de la voie classique où la production de la DHT se fait à partir de la testostérone par l'action de la 5a-réductase dans les tissus périphériques. La distribution tissulaire de la RDH16 établie par PCR quantitatif en temps réel est surtout concentrée dans le foie où elle joue un rôle dans le métabolisme des rétinoïdes et, en second lieu, à un niveau moindre dans la prostate, qui est un tissu sensible aux androgènes. Il est intéressant de noter que le gène Rdhlô chez la souris, le gène homologue de la RDH16 humaine, est très stimulé par la DHT et le déhydroépiandrostérone dans la glande préputiale, mais sa stimulation par l'estradiol n'est pas très importante.

La rétinol déshydrogénase 8 (RDH8) est impliquée dans le cycle visuel où elle réduit le tout-trans rétinal en tout-trans rétinol, ce qui prévient l’accumulation de lipofuscine (A2E), une molécule toxique qui peut mener à la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Il y a malgré tout une accumulation d’A2E dans les photorécepteurs et l’épithélium pigmentaire rétinien, ce qui suscite des interrogations à propos de son efficacité enzymatique. Il est donc important de caractériser ses propriétés enzymatiques pour clarifier cette question. La RDH8 est insoluble dans le lysat bactérien suite à sa surexpression dans un système E. coli. Il est cependant possible de la solubiliser en utilisant le détergent SDS, ce qui résulte en la production d’une protéine inactive et empêche ainsi la caractérisation de son activité enzymatique. Différentes approches ont donc été utilisées pour produire la RDH8 en absence de détergent. La première approche comprend l’ajout d’un ligand ou d’un cofacteur à la RDH8 lors de la surexpression et de la lyse cellulaire, afin de la rendre plus soluble. La deuxième approche consiste à utiliser la technologie des protéines de fusion afin d’obtenir une forme soluble de la RDH8 en fusion avec les étiquettes poly-His, MBP, TagR-TagR, NusA ou SUMO. La dernière approche comporte l’utilisation du système d’expression L. lactis pour permettre la sécrétion de la RDH8 dans le milieu de culture. Il a été impossible d’obtenir une forme soluble et pure de la RDH8 en raison de sa faible solubilité, de la protéolyse observée lors de la production des différentes protéines de fusion, ainsi que de l’absence d’expression dans le système L. lactis. La surexpression de la RDH8 en fusion avec différentes étiquettes dans les cellules eucaryotes Pichia pastoris pourrait toutefois permettre l’obtention d’une forme soluble de la RDH8 et la caractérisation de son activité enzymatique.

Objectif : Évaluer l’association entre l’activité estimée du stéaryle-CoA désaturase (SCD) et le syndrome métabolique (MetS) chez une population adulte de la Polynésie française. Méthode : Étude transversale (2006-2007) de 178 adultes vivants en zone urbaine (Papeete, île de Tahiti, archipel de la Société) et rurale (Tubuai, île de Tubuai, archipel des Australes). L’activité estimée de la SCD a été calculée par le ratio produit/précurseur d’acides gras mesurés dans la membrane des érythrocytes (SCD = C16:1n-7/C16:0). Le MetS a été défini selon les critères du NIH (National Institutes of Health, États-Unis). L’analyse de covariance a été utilisée pour comparer la composition en acide gras sanguin et l’activité estimée de la SCD selon la présence de MetS et de différents critères du MetS. La régression logistique multiple a été utilisée afin d’évaluer l’association entre l’activité estimée de la SCD en quartiles et le risque de MetS. Résultats : La prévalence de surpoids était de 87 % (dont 59 % d’obèses) et celle du MetS de 32 %. Les niveaux du précurseur du C16:1n-7, l’acide palmitoléique (C16:0), entre les participants avec et sans MetS étaient similaires. Le niveau d’activité estimée de la SCD était plus élevé chez les participants avec MetS, plus particulièrement chez ceux avec une hypertriglycéridémie. Une activité estimée de la SCD plus élevée était associée positivement à un risque plus élevé de MetS (Ptendance=0,04). Conclusion : Les résultats de notre étude suggèrent qu’une augmentation de l’activité estimée de la SCD est associée positivement au risque de MetS chez la population adulte de la Polynésie française. Une étude longitudinale serait requise afin de confirmer cette association. / Objective: To evaluate the association between estimated activity of stearoyl-CoA desaturase (SCD) and metabolic syndrome (MetS) in an adult population of French Polynesia. Method: A cross-sectional study (2006-2007) of 178 adults living in urban (Papeete, Tahiti, Society Archipelago) and rural areas (Tubuai, Island of Tubuai, Austral’s archipelago). We calculated the ratio of product/precursor of erythrocyte fatty acids to estimate the activity of desaturase (SCD = C16:1n-7/C16:0). MetS was defined according to the criteria of the U.S. NIH (National Institutes of Health). The covariance analysis was used to compare the blood fatty acid composition and the estimated activity of SCD based on the presence of MetS and different criteria of MetS. Multiple logistic regression was used to assess the association between estimated SCD activity in quartiles and MetS. Results: Prevalence of overweight was 87% (with 59% obese) and that of MetS 32%. The level of C16:1n-7 precursor, palmitic acid (C16:0), was similar between subject with and without MetS. The estimated SCD activity was higher in participants with MetS, especially those with hypertriglyceridemia. A higher estimated activity of SCD was positively associated with MetS risk of (Ptrend =0.04). Conclusion: The results of our study suggest that the estimated SCD activity is positively associated with risk of MetS in the adult population of French Polynesia. A longitudinal study would be required to confirm this association.

L'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est constitué d'une monocouche de cellules tapissant le fond de l'oeil et est localisée de façon apicale par rapport à la rétine neurale. Outre ses fonctions au niveau du cycle visuel, PEPR permet aussi la phagocytose des segments externes des bâtonnets (SEB) et la production de phagosomes. L'EPR digère ces phagosomes à l'aide d'enzymes telles les phospholipases A₂ (PLA₂) et recycle certaines de ses composantes tels les acides gras polyinsaturés (AGPI). Fait notable, plus de 60% des acides gras des phospholipides des SEB sont polyinsaturés. Ces membranes sont donc très susceptibles à l'oxydation. Il a déjà été démontré dans notre laboratoire que PEPR exprime une PLA₂ gamma cytosolique (cPLA₂ gamma). La spécificité et l'activité constitutive de cette PLA₂ suggèrent qu'elle pourrait participer au recyclage des AGPI. Les objectifs poursuivis dans cette partie de la thèse étaient de surexprimer, de purifier la cPLA₂ gamma et de caractériser ses propriétés enzymatiques et de liaison avec des modèles membranaires. Au niveau des interactions membranaires, nous avons d'une part démontré que la cPLA2-gamma recombinante était active, hydrolysant le L-DPPC en monocouche ainsi que le PAPC en vésicules (résultats non-montrés). Il s'agit selon nous de la première fois où une cPLA2-gamma recombinante issue d'un système prokaryote, dépourvue des modifications postraductionnelles associées à celle produite à partir du système eukaryote, notamment la farnésylation de son extrémité C-terminale et de nombreux sites potentiels de palmitoylation et d'un site de myristoylation (Tucker et al., 2005), était démontrée active. La vision chez les vertébrés commence avec l'absorption de lumière par les pigments visuels dans les cellules des photorécepteurs. Les pigments visuels, ou opsines, sont des récepteurs à sept hélices transmembranaires couplés aux protéines G localisés dans la membrane des disques des segments externes des bâtonnets et des cônes. Dans l'obscurité, le chromophore sensible à la lumière, le 11 cis retinal, est lié de manière covalente à l'opsine via un lien de base de Schiff à un résidu de lysine spécifique localisé au centre de la septième hélice alpha transmembranaire. La stimulation lumineuse a pour résultat Pisomérisation du 11-cis rétinal en tout-trans rétinal, ce qui cause un changement dans la conformation de la rhodopsine. La métarhodopsine II photoactivée résultante réagit avec la protéine G, appelée transducine, et déclenche la cascade de phototransduction qui mène à u l'hyperpolarisation des photorécepteurs et, finalement, à l'inhibition du relargage de neurotransmetteur au niveau de la terminaison synaptique. Après isomérisation du 11-cis-rétinal à la configuration tout-trans, la base de Schiff est hydrolysée et le chromophore photolyse se détache de l'opsine. Le tout-trans rétinal est alors réduit en tout-trans rétinol par une rétinol dehydrogenase (RDH) localisée dans la membrane discale des segments externes des photorécepteurs (Blaner et al, 1980; Nicotra et Livrea, 1982; Ishiguro et al, 1991; Palczewski et al, 1994). Les enzymes spécifiques responsables de cette réaction sont la RDH8 et la RDH 12 (Molday et al., 2009; Rattner et al., 2000; Maeda et al., 2006, Maeda et al. 2009). Six RDHs distinctes exprimées dans les photorécepteurs ont été récemment clonées. Leurs fonctions, in vivo, demeurent inconnues, mais elles ont toutes démontré leur capacité à réduire le tout-trans rétinal in vitro (Kasus-Jacobi et al. 2006). Plusieurs évidences suggèrent que cette réduction du tout-trans rétinal dans les cellules des photorécepteurs est cruciale pour le maintien du caractère fonctionnel et de l'intégrité structurale de la rétine. Cette réaction est la première étape d'une voie métabolique appelée le cycle visuel, lequel est essentiel pour une phototransduction soutenue. Cette voie intervient au niveau des photorécepteurs et de l'épithélium de pigment rétinien (EPR) et permet de recycler le tout-trans rétinal en 11-cis rétinal. Quand le tout-trans rétinol issu de la réduction du tout-trans rétinal est produit dans les photorécepteurs, il est transporté dans PEPR où il est estérifié par la lécithine rétinol acyl transferase (LRAT) et est emmagasiné sous forme de tout-trans rétinyl ester. Le tout-trans-rétinol peut aussi être acheminé à PEPR par la vascularisation choroïdienne, entrant dans PEPR via un processus récepteur-dépendant impliquant un complexe de protéine/transthyretin - protéine sérique liant le rétinol (SRBP) (Malpeli et al., 1996). Les rétinyl esters emmagasinés dans PEPR constituent le substrat pour Pisomérohydrolase (IMH), aussi appelée RPE65, une enzyme dont le rôle proposé serait de catalyser l'hydrolyse concertée du tout-trans rétinyl ester et l'isomérisation en 11-cis rétinol. L'oxydation du 11 cis-rétinol en 11-cis rétinal par la 11 cis rétinol dehydrogenase (RDH5) et/ou la RDH11 dans PEPR complète le cycle visuel. Le 11-cis rétinal est ensuite réacheminé vers les photorécepteurs où il se combine avec l'opsine pour régénérer la rhodopsine photosensible. La première étape du cycle visuel est importante parce qu'elle produit du tout-trans rétinol, utilisé pour approvisionner PEPR en Ill rétinyl ester. U ne s'agit cependant pas de Punique source de tout-trans-rétinol puisque celui en circulation dans l'organisme peut également être utilisé de façon alternative. À ce jour, on connaît encore peu de choses sur ces enzymes. Il est connu que des mutations de la RDH5 sont associées avec la maladie récessive rare fundus albipunctatus, alors que des mutations de la RDH 12 causent l'amaurose congénitale de Leber. Cependant le rôle physiologique exact de plusieurs autres isozymes de la RDH et de leur implication possible dans des pathologies de l'oeil demeurent toujours inconnus jusqu'à maintenant. L'objectif de ces travaux consistait à surexprimer et purifier la RDH 11 et une forme tronquée (N-delRDHll) pour ensuite mesurer ses interactions membranaires et, finalement, déterminer sa structure tridimensionnelle. Lors de cette étude, nous avons obtenu deux versions de la RDH-11, soit une version complète comportant les 318 acides aminés, ainsi qu'une version tronquée comportant une deletion des 26 premiers acides aminés en N-terminal que l'on appelera N-delRDHll tout au long de cette thèse. La version N-delRDHl 1 fut produite par génie moléculaire en raison du très faible niveau d'expression et de solubilité de la version complète de la RDH-11. Les meilleurs essais de purification ont produit une N-delRDHll d'une pureté supérieure à 95% et d'une concentration d'environ 1 mg/ml, ce qui nous a permis de tenter la cristallogénèse de cette protéine, malheureusement sans succès. Nous avons de plus démontré que la N-delRDH 11 surexprimée dans un système prokaryote était active, convertissant rapidement le tout-trans rétinal en rétinol. Or, il s'agit à notre connaissance de la première fois qu'une activité était démontrée pour une protéine issue d'un tel système d'expression. Les mesures effectuées en pression de surface ont permis d'établir comment la présence du segment N-terminal, sans être le seul élément nécessaire à la liaison membranaire, venait néanmoins accélérer grandement la cinétique de mobilisation de la protéine du coeur de phase jusqu'à l'interface. Cependant, ce segment N-terminal n'aurait pas d'effet significatif sur la pression d'insertion maximale (PIM) sous une monocouche de DOPE. Par ailleurs, les mesures de PIM avec les lipides comportant deux chaînes grasses 18:1 nous ont également permis de constater des différences significatives entre les différentes têtes polaires des phospholipides testés. / Les PIM les plus élevées ont été obtenues avec le DOPE (~ 44 mN/m) et les plus faibles avec le DOPC (~ 25 mN/m). Quant aux mesures faites en spectroscopic PM-IRRAS, nous avons d'une part confirmé que la N-delRDHll ainsi que la RDH 11 ont une structure secondaire à l'interface air-eau composée d'une proportion importante d'hélices-a, en accord avec les données que nous avions obtenues en solution par dichroïsme circulaire et spectroscopie infrarouge. Le maintien de la structure secondaire de la N-delRDHll à l'interface air-eau démontre également que l'intégrité de la protéine est préservée dans cet environnement. Ces mesures en PM-IRRAS ont de plus révélé un possible changement conformationnel de la N-delRDHll suite à la liaison de son substrat, le tout-trans rétinal, en plus de démontrer que la composition lipidique de la monocouche pouvait avoir un effet direct sur la stabilisation des hélices-a de la protéine.

Les microorganismes pathogènes qui infectent l’être humain ont besoin de fer pour croître et se multiplier. Chez l’humain, la majorité du fer est séquestré dans l’hème et dans des protéines à cause de sa faible solubilité au pH physiologique en présence d’oxygène. Les bactéries pathogènes ont dû développer divers systèmes d’acquisition afin d’utiliser l’hème comme source de fer. Les protéines ChuX, ChuY et ChuW sont codées par des gènes faisant partie du regroupement de gènes chu codant pour une voie d’acquisition directe de l’hème chez la bactérie E. coli O157:H7. Peu d’attention a été portée à ces trois protéines et les fonctions prédites selon leur séquence primaire ont été investiguées. Dans ce mémoire, nos résultats révèlent que la protéine ChuY, faisant partie de la famille des réductases à courtes chaînes atypiques, réduit le tripyrrole issu de la réaction de dégradation de l’hème catalysée par ChuS en utilisant le NADPH comme cofacteur. Cette réductase accélère aussi de neuf fois la vitesse de l’étape limitante de la réaction de ChuS, soit l’ouverture du porphyrine du verdohème. Les études spectroscopiques et la détermination des constantes cinétiques pré-stationnaires ont permis de confirmer que ChuY agit de façon catalytique. Les résultats permettent aussi de proposer un modèle de dégradation de l’hème impliquant les protéines ChuS et ChuY. La protéine ChuX aurait un rôle dans le transport et le stockage de l’hème. Nos résultats ont montré que la protéine holo-ChuX transfère l’hème à la protéine apo-ChuS rapidement, et que celle-ci assure ensuite sa dégradation. Finalement, aucun essai enzymatique n’a été effectué avec la protéine ChuW à cause de son insolubilité. Dans l’ensemble, cette étude a permis d’obtenir une meilleure compréhension du rôle respectif des protéines ChuY et ChuX dans le système d’acquisition de l’hème par E. coli O157:H7. / Pathogenic microorganisms that infect a mammalian host need iron to survive and grow. However, because of its low solubility at physiologic pH in aerobic environment, the majority of iron is sequestered in heme and proteins. Pathogenic bacteria have developed ways to acquire heme from the host as a source of iron. ChuX, ChuY and ChuW are proteins encoded by a gene cluster involved in direct heme acquisition in Escherichia coli O157:H7. So far, these three proteins have received little attention. In this study, the functions of these proteins have been investigated based on predictions from the primary sequence analyses. Our results reveal that the ChuY protein, belonging to the short chain dehydrogenase/reductase family, reduces the tripyrrole derived from the heme degradation reaction catalyzed by the ChuS protein using NADPH as cofactor. ChuY also accelerates nine times the rate-limiting step of the ChuS reaction, which is the opening of the porphyrin ring of verdoheme. Spectroscopic studies and the determination of the pre-stationary kinetic constants have confirmed the catalytic reductase activity of ChuY. From our results, a model of heme degradation involving both the ChuY and ChuS proteins is proposed. The ChuX protein is predicted to have a role in the transport and storage of heme. Our results show that holo-ChuX can transfer heme to the apo-ChuS protein quickly, after which heme degradation can start. Enzymatic testing of the ChuW protein could not be carried out because of the insolubility of this protein. Overall, this study has resulted in a better understanding of the respective role of the ChuY and ChuX proteins in the direct heme acquisition system of E. coli O157:H7.

Chez l'humain, la formation des hormones stéroïdiennes dans les tissus périphériques via le précurseur déhydroépiandrostérone (DHEA) circulant joue un rôle majeur dans le maintien du fonctionnement adéquat des tissus androgéno- et estrogéno-sensibles. Comme les primates ont le pouvoir de sécréter une grande quantité de DHEA via les glandes surrénales, le singe représente ainsi un meilleur modèle animal pour étudier la stéroïdogénèse que le rat ou la souris. Chez ces derniers, l'enzyme 17α-hydroxylase, 17,20-lyase (CYP17) est absente dans les glandes surrénales, lesquelles sont donc incapables de produire et de sécréter la DHEA et la 4-androstène-3,17-dione (4-dione) dans la circulation, comme le font humain et les primates. Dans le présent projet, nous étudions deux enzymes chez le singe cynomolgus (Macaca fascicularis) qui possèdent le potentiel de métaboliser les androgènes, mais les preuves de leur implication réelle sont encore manquantes. La première est la rétinol déshydrogénase de type 12 (RDH12) qui transforme le rétinal en rétinol, les résultats préliminaires obtenus dans notre laboratoire suggèrent qu'elle possède la capacité de convertir la dihydrotestostérone (DHT) en 5α-androstane-3p, 17β-diol (3β-diol). La deuxième enzyme est la 17β-hydroxysteroide dehydrogenase (17β-HSD) type 11, qui possède la capacité de catalyser la transformation du 5α-androstane-3α, 17β-diol (3α-diol) en androstérone (ADT). Pour déterminer les activités catalysées par la RDH12, nous avons préparé des transfectants stables qui expriment l'enzyme en utilisant les cellules transformées de rein embryonnaire d'humain (HEK-293). Nous avons trouvé que Macaca fascicularis RDH12 (mfRDH12) catalyse efficacement et sélectivement la transformation de 5α-androstane-3,17-dione (5α-dione) en epiandrostérone (Epi-ADT) et DHT en 3β-diol, respectivement. L'enzyme est exprimée spécifiquement dans la peau, la glande mammaire et le cerveau. Le niveau d'expression le plus élevé est dans la peau où elle est exprimée spécifiquement dans la glande sébacée. En utilisant l'androgène synthétique R1881 pour déterminer s'il est capable de stimuler l'expression de la RDH12 comme celle de la rétinol déshydrogénase de type 11 (RDH11), une enzyme paralogue de la RDH12, nous avons trouvé que ce produit ne stimule pas l'expression de la RDH12, par contre, il est un inhibiteur puissant de l'activité 3β-hydroxystéroïde déshydrogénase. Pour déterminer le rôle potentiel de la 17β-HSD type 11 dans le métabolisme des androgènes, nous avons quantifié le niveau d'expression de l'enzyme, déterminé la localisation de l'enzyme dans plusieurs tissus en utilisant le PCR en temps réel et l'hybridation in situ, et examiné s'il y a association avec les tissus androgéno-sensibles.

Les rétinol déshydrogénases ou RDHs sont des oxydoréductases inhérentes à l’accomplissement de la fonction visuelle de la rétine. Elles sont en effet impliquées dans le cycle visuel rétinien. Suite à l’absorption de la lumière par le pigment visuel des photorécepteurs, la rhodopsine, la RDH8 est la première enzyme qui va intervenir dans le cycle visuel après la libération du chromophore de la rhodopsine, le tout-trans rétinal. Ainsi, la RDH8 détoxifie les photorécepteurs car le tout-trans rétinal est une espèce très réactive qui peut induire des dommages à la rétine. La RDH11, quant à elle, agit de concert avec la RDH5 au niveau de la dernière étape du cycle visuel dans l’épithélium pigmentaire rétinien en transformant le 11-cis rétinol en 11-cis rétinal, qui sera réacheminé vers les photorécepteurs pour régénérer le pigment visuel. Toutefois, la structure tertiaire des RDHs n’a encore jamais été résolue. Ces enzymes sont néanmoins reconnues pour être associées aux membranes cellulaires par leur segment N- et/ou C-terminal. Nous avons alors entrepris ce travail afin de caractériser la structure de ces enzymes et mieux comprendre leur interaction avec les membranes. Nous avons étudié dans un premier temps différentes portions du segment N- et C-terminal de la RDH11 et la RDH8 respectivement, par différentes méthodes spectroscopiques. Nous avons alors observé que les segments de ces deux enzymes agissent par deux modes d’action totalement différents. La RDH11 ferait appel à un segment N-terminal transmembranaire qui adopte une conformation hélicale peu importe sa longueur, alors que la RDH8 utiliserait un segment C-terminal qui adopte une structure secondaire variable selon la longueur et dont la liaison est périphérique à la membrane. En plus, la liaison de la RDH8 par son segment C-terminal serait potentiellement facilitée par une ou plusieurs acylations situées au niveau de certaines cystéines. Les mesures de pression d’insertion maximale ont permis de comparer les interactions entre des segments de longueur variable en N-terminal de la RDH11 et en C-terminal de la RDH8 avec des monocouches de différents phospholipides. Ainsi, nous avons déterminé les interactions les plus favorables pour chacun de ces segments. Nous nous sommes focalisés par la suite sur l’étude de l’enzyme RDH8 et la comparaison de ses propriétés structurales, de stabilité et de liaison membranaire avec celles de sa forme tronquée RDH8t, dépourvue de son segment en C-terminal. Notons que nous avons mis au point un protocole adapté pour surexprimer et purifier la RDH8 et sa forme tronquée. À notre connaissance, il s’agit ici des premiers travaux de recherche rapportant la surexpression et la purification d’une RDH8 (bovine) complète dans un système procaryote (E. coli). Nous avons alors constaté que les deux formes de la RDH8, complète et tronquée, comprenaient majoritairement des hélices α en plus de la présence de feuillets β, en accord avec le motif de Rossmann fold suggéré dans la littérature pour cette famille d’enzymes. Il s’est avéré également que le segment C-terminal a un impact sur la stabilité de la RDH8 comme démontré par les mesures du contenu en structure secondaire de ces protéines en fonction des conditions de stockage et dans les expérimentations de dénaturation thermique. Enfin, les mesures de pression d’insertion maximale (PIM) et de synergie ont démontré que le segment C-terminal facilitait la liaison membranaire de la forme complète par rapport à la forme tronquée, notamment dans le contexte de phospholipides portant une tête polaire chargée négativement. L’interaction membranaire de la RDH8 pourrait donc impliquer des interactions électrostatiques. Des expériences de spectroscopie de fluorescence ont permis de confirmer l’implication du segment C-terminal dans la liaison de la RDH8 avec des bicouches lipidiques grâce à la présence de deux résidus tryptophanes uniquement dans son segment C-terminal. / In the retina, retinol dehydrogenases (RDHs) play a crucial role in the visual cycle allowing a good vision. The first step of the visual cycle is taking place in photoreceptors where RDH8 is located and then in the retinal pigmented epithelium (RPE) where RDH11 can be found. RDH11 is likely anchored to membranes by means of its N-terminal segment whereas RDH8 has been postulated to be membrane bound via its C-terminal segment. So, to better evaluate the role of the N-terminal segment of RDH11 and the C-terminal segment of RDH8 in the membrane binding of these proteins, different variants (Long and Short) of the aforementioned segments have been studied. In addition, mutations of the C-terminal segment of RDH8 have been introduced to monitor their interaction with lipid monolayers or bilayers. We have thus analyzed the secondary structure content of these segments by conventional spectroscopic methods such as circular dichroism (CD) and attenuated total reflectance (ATR) infrared spectroscopy whereas their interaction with phospholipids have been mainly monitored by surface pressure measurements when using monolayers and fluorescence spectroscopy for bilayers. Overall, we found that the N-terminal segment of RDH11 adopts an α-helix conformation acting as a transmembrane domain. Values of maximum insertion pressure (MIP) and synergy suggested a preferential binding of the RDH11 Long-peptide to phosphoethanolamine, which are abundant in the RPE. In the case of RDH8, our findings suggest an important role of the long C-terminal segment in membrane binding, which is supported by its helical content and the larger values of MIP and synergy. We also compared the behavior of RDH8 and its truncated form (RDH8t, without its C-terminal segment) to better understand the involvement of this segment in membrane binding. Thus, both enzymes have been expressed in E. coli, purified by affinity chromatography and studied by the spectroscopic methods mentioned above and by using MIP and synergy measurements. RDH8 and RDH8t display a secondary structure content in agreement with their predicted Rossmann fold. Interestingly, the removal of the C-terminal segment decreased the temporal and thermal stability of these enzymes. In addition, this segment contributes to protein-lipid interaction especially in presence of negatively charged phospholipids likely through electrostatic interactions. The involvement of the C-terminal segment of the RDH8 in its membrane anchoring has been further confirmed by fluorescence measurements of its two Trp residues located in this segment. The present characterization of RDH8 is a first step paving the way for the elucidation of its structural and functional features to gain a better understanding of its role within the visual cycle and investigating mechanisms of retinal pathogenesis.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / Au Canada, le cancer de la prostate (CaP) est le type de cancer le plus courant chez les hommes. Environ 30% des patients atteints de CaP développent une récidive après la chirurgie ou la radiothérapie, et pour laquelle il n'existe toujours pas de traitement curatif. Il est connu que le récepteur aux androgènes (AR) remplit des fonctions oncogéniques importantes pour la progression de cette maladie. Il a aussi été découvert qu'AR met en place une reprogrammation du métabolisme tumoral dans les cellules de CaP de façon à soutenir leur prolifération excessive. Dans le cadre de mon doctorat, j'ai cherché à mieux comprendre la reprogrammation du métabolisme cellulaire qui s'établit dans le CaP afin de trouver de nouvelles vulnérabilités métaboliques et de déterminer le potentiel thérapeutique y étant associé. Une synthèse des connaissances actuelles centrées autour du métabolisme cellulaire dans le CaP a permis de comprendre d'une part qu'AR contrôle simultanément plusieurs voies cataboliques et anaboliques pour promouvoir une production et une consommation d'énergie visant à stimuler la prolifération tumorale. D'autre part, les données suggèrent un rôle potentiel de l'enzyme cytoplasmique isocitrate déshydrogénase 1 (IDH1) dans les cellules de CaP. Les profils d'expression et d'activité des IDH ont montré qu'IDH1 est prédominante dans le CaP et qu'elle est spécifiquement stimulée par les androgènes. Par analyse de flux extracellulaires, il est montré à l'aide d'outils génétiques et pharmacologiques qu'IDH1 contribue de façon significative à la respiration mitochondriale dans le CaP. Les niveaux de métabolites obtenus par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS) montrent que l'activité d'IDH1 est essentielle à l'activation AR-dépendante du cycle de Krebs dans les cellules de CaP, spécifiquement à la stimulation du flux de carbones du pyruvate issu de la glycolyse. Ces données indiquent que les cellules de CaP utilisent un cycle de Krebs non-conventionnel combinant un sentier hybride entre la mitochondrie et le cytoplasme afin d'effectuer la respiration mitochondriale et produire de l'énergie. Finalement, le blocage d'IDH1 réduit la prolifération dans des lignées cellulaires de CaP, ralentit la croissance tumorale in vivo, et diminue la croissance d'organoïdes de cancer provenant de la prostate de patients atteints de CaP. Ces données démontrent qu'IDH1 représente une vulnérabilité métabolique potentiellement exploitable au niveau clinique pour traiter plus efficacement les patients atteints de CaP. / In Canada, prostate cancer (PCa) is the most common type of cancer in men. About 30% of PCa patients develop recurrence following surgery or radiotherapy, and for which no curative treatments are currently available. It is known that the androgen receptor (AR) plays important oncogenic functions in the progression of this disease. It has also been discovered that AR drives a reprogramming of tumor metabolism in PCa cells to support their excessive proliferation. In my doctoral work, I sought to better comprehend the reprogramming of cell metabolism that occurs in PCa to identify novel metabolic vulnerabilities and determine their therapeutic potential. A review of the current knowledge centered around cell metabolism in PCa has allowed to understand on one hand that AR simultaneously controls several catabolic and anabolic pathways to promote the production and the consumption of energy to induce the proliferation of tumor cells. On the other hand, the data suggest a potential role of the cytoplasmic isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) enzyme in PCa cells. The IDH expression and activity profiles have shown that IDH1 is predominant in PCa and that it is specifically stimulated by androgens. By extracellular flux analysis, it is shown using genetic and pharmacological tools that IDH1 significantly contributes to the mitochondrial respiration in PCa. The metabolite levels obtained using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) shows that IDH1 activity is essential for AR-dependent activation of the Krebs cycle in PCa cells, specifically for stimulating the carbon flux from glycolysis-derived pyruvate. These data indicate that PCa cells use an unconventional Krebs cycle combining a hybrid pathway between the mitochondria and the cytoplasm to perform mitochondrial respiration and produce energy. Finally, the IDH1 blockade reduces proliferation of PCa cell lines, slows tumor growth in vivo, and decreases the growth of cancer organoids generated from the prostate of PCa patients. These data demonstrate that IDH1 represents a potentially key metabolic vulnerability in this disease that could be exploited clinically to treat PCa patients more effectively.

La nitrate réductase périplasmique de Rhodobacter sphaeroides catalyse la réduction du nitrate en nitrite. C'est une métalloenzyme qui comprend un cofacteur à molybdène, un centre fer - soufre et deux hèmes.La réactivité du cofacteur à molybdène reste mal comprise pour plusieurs raisons. Entre autres : l'hétérogénéité des signatures RPE Mo(V), état semi-réduit du site actif, et l'existence d'états inactifs de l'enzyme selon les conditions.Pour comprendre la réactivité et la pertinence catalytique des principales espèces Mo(V), nous avons entrepris une caractérisation des processus d'activation et d'inactivation par électrochimie sur film de protéines, et une étude de leur structure par spectroscopies RPE et HYSCORE.Nos observations cinétiques suggèrent que l'activation irréversible de l'enzyme implique un réarrangement d'une des ptérines du cofacteur à Mo.Ceci est mis en évidence par la modification des couplages magnétiques intercentres du fait de l'activation, et par des modifications de structure au delà de la première sphère de coordination du Mo.Enfin, l'étude de l'inactivation réversible de l'enzyme par électrochimie montre l'implication des différents états redox du site actif dans le mécanisme d'inhibition, et donne les conditions nécessaires au piégeage de formes Mo(V) actives. / Rhodobacter sphaeroides periplasmic nitrate reductase catalyses the reduction of nitrate into nitrite. It is a metalloenzyme containing a molybdenum cofactor, an iron - sulfur cluster, and two haems.The reactivity of the molybdenum cofactor remains elusive for many reasons. Among others : the heterogeneity of the EPR signatures of Mo(V), the semi-reduced state of the active site, and the existence of inactive states of the enzyme, depending on conditions.In order to understand the reactivity and the catalytic relevance of the major Mo(V) species, we have undertaken a characterisation of the activation and inactivation processes by protein-film-electrochemistry, and a study of their structure by EPR and HYSCORE spectroscopies.Our kinetic observations suggest that the irreversible activation of the enzyme involves a rearrangement of one of the pterins of the Mo cofactor.This is evidenced by the modification of intercentre magnetic couplings due to the activation, and by structural modifications beyond the first coordination sphere of Mo.Finally, the study of enzyme reversible inactivation by electrochemistry shows the involvement of the different redox states of the active site in the inhibition mechanism, and yields the necessary conditions to trapping active Mo(V) forms.

Les variations dans la qualité des fromages affinés sont expliquées par plusieurs facteurs. Parmi ceux-ci, certains influencent la nature du microbiote des fromages, par exemple la présence de protéines antimicrobiennes natives du lait. Ce projet vise à déterminer la concentration et l'activité de la lactoferrine (Lf), de la lactopéroxydase (Lpo) et du lysozyme (Lz) au cours de la fabrication fromagère et dans différents types de fromages (Cheddar frais, Cheddar doux, Camembert et Suisse). Chaque protéine antimicrobienne fut analysée par deux méthodes. La technique de dosage d'immunoabsorption par enzyme liée (ELISA) fut employée pour chaque protéine. De plus, la Lpo fut mesurée par spectrométrie, la Lz par fluorescence et la Lf par HPLC. La mesure de Lf, Lpo et Lz dans le lait cru, le lait thermisé et le fromage frais a permis de déterminer qu'il n'y avait pas de différences significatives entre les teneurs dans le lait cru et le lait thermisé. Les résultats ont aussi démontré qu'il y a une quantité plus importante des trois antimicrobiens dans le fromage que dans le lait, et ce par un facteur de 2,78. Lors de l'étude des différents types de fromage commerciaux, diverses méthodes ont été comparées à l'ELISA. Il y a un manque de corrélation entre les valeurs obtenues par ELISA et celles obtenues par les autres méthodes. Les résultats révèlent que le fromage Camembert a une concentration moindre d'antimicrobiens que les trois autres fromages. Ceci semble être associé à une protéolyse plus avancée dans le Camembert. Les résultats ont aussi été rapportés par « gramme de protéines » et il y a tout de même des différences significatives entre les différents types de fromage. Ces résultats permettre une meilleure compréhension du passage des antimicrobiens présents dans le lait vers le fromage pour pouvoir, éventuellement, contrôler leur concentration. / Variations in cheese quality are explained by several factors. Among them, some influence the microbiota of cheeses such as native milk antimicrobial proteins. This project aims to determine the concentration and activity of lactoferrin (Lf), lactoperoxidase (Lpo) and lysozyme (Lz) during cheese making and in different cheese types (fresh Cheddar, mild Cheddar, Camembert and Suisse). Each antimicrobial protein was analyzed by two methods. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique was employed the analysis of each protein. In addition, the Lpo was measured by spectrometry, the Lz by fluorescence and the Lf by HPLC. The measurement of Lf, Lpo and Lz in raw milk, thermized milk and fresh cheese revealed that there were no significant differences between level in raw milk and thermized milk. Results also showed that there is a higher quantity of the three antimicrobials in cheese than in milk by a factor of 2.78. When studying different types of commercial cheese, the various methods were compared to ELISA. There is a lack of correlation between the results obtained by ELISA and those of the other methods. Results show that Camembert cheese has lower levels of antimicrobials than the other 3 cheeses and is different from Swiss cheese for all antimicrobials. This seems linked to a higher degree of proteolysis in Camembert. The results were also reported by "grams of protein" and there are still significant differences between the different types of cheese. These results allow a better understanding of the transition of the antimicrobials present in the milk towards the cheese to be able, possibly, to control their concentration.