L'optimisation de la digestion anaérobie par voie sèche est actuellement limitée par un manque de connaissances fondamentales. En particulier, les effets des principaux paramètres de procédé sur la dynamique réactionnelle sont peu connus en digestion sèche : teneur en eau, propriétés du substrat ou taux d'inoculation. Ces conditions opératoires ont des conséquences importantes à l'échelle des micro-organismes par la modification des conditions environnementales locales. Si la relation entre les propriétés des substrats lignocellulosiques et l'activité de la biomasse microbienne est au cœur de la dynamique réactionnelle, elle reste très peu prise en compte lors de l'ajustement des conditions opératoires. Ce travail vise à comprendre l'impact des paramètres de procédé (teneur en eau, caractéristiques du substrat, taux d'inoculation) sur le développement, la structuration et l'activité des micro-organismes au cours de la digestion sèche de substrats lignocellulosiques, en vue de maitriser le procédé dans son ensemble. La stratégie retenue a consisté à suivre la dégradation de la paille de blé, modèle des résidus agricoles méthanisables, en réacteurs discontinus faiblement inoculés. Quatre séries d'expériences ont été mises en place pour : i) comprendre comment les paramètres de procédés impactent les réactions, ii) étudier le comportement métabolique des micro-organismes à faibles teneurs en eau, iii) déterminer comment les communautés microbiennes se spécialisent selon l'évolution des caractéristiques du substrat au cours de sa dégradation, et enfin iv) valider les résultats par un taux d'inoculation moins contraignant. Tout d'abord, le criblage des principaux paramètres de procédés (teneur en matières sèches, taille des particules et taux d'inoculation) a montré une évolution progressive de leurs effets au cours de l'avancement de la réaction, sur les processus de digestion. Ensuite, l‘étude de la fermentation en voie sèche a permis de montrer, qu'en présence d'eau libre, l'augmentation de la siccité n'impacte pas le métabolisme microbien, mais modifie les équilibres entre les communautés microbiennes. Le recours à un protocole de compartimentation de la biomasse microbienne spécialement développé dans cette thèse a mis en évidence une spécialisation forte et progressive des communautés microbiennes associées à l'hydrolyse du substrat, au cours de sa dégradation. Des observations par microscopie électronique à transmission indiquent que cette modification coïncide avec la dégradation progressive des tissus de la paille en fonction de leur degré de lignification. La mise en évidence de barrières physiques, récalcitrantes à la biodégradation et rarement décrites dans le contexte de la méthanisation, indique que l'accessibilité du substrat est le paramètre principal limitant la réaction. Ces informations suggèrent que le broyage du substrat est un prétraitement de choix en digestion sèche. Cependant, une dernière expérience a montré qu'en voie sèche, un broyage fin limite les gains de performances du procédé par une augmentation des risques d'acidification des digesteurs. / Nowadays, optimization of solid-state anaerobic digestion is limited by a lack of fundamental knowledge. In particular, the effects of the main process parameters, such as water content, substrate property or inoculation rate, on the reaction dynamics are poorly understood in solid-state anaerobic digestion. In fact, process parameters have consequences at microbial scale by the modification of the local environmental conditions. Nevertheless, even if the relationship between the lignocellulosic substrate characteristics and the microbial activity is a keystone of the reaction dynamics, it is rarely considered for the selection of operating conditions.This work aims to understand the influence of process parameters (total solid content, substrate characteristics, and inoculation ratio) on the microbial development, compartmentation and activity in order to optimize dry anaerobic digestion of lignocellulosic substrate. The selected strategy consisted in following wheat straw biodegradation, which is a model of agricultural wastes available for anaerobic digestion, in low inoculated batch reactors. Four series of experiment have been established to: i) understand the impact of process parameters on the reaction, ii) study the metabolic behavior of microorganisms face to low water content, iii) evaluate the relationship between substrate characteristics and modification of microbial communities and finally iv) validate results by less restricting inoculation rate.First, a screening of solid-state process parameters (total solid content, particle size and inoculation rate) showed a progressive change of their effect on digestion process during the reaction progress. Then, the study of dry fermentation indicated that, when water is free within the media, increasing total solid content has a low impact on the microbial metabolism, but modifies equilibriums between microbial communities. Based on a protocol developed to investigate the biomass compartmentation, we enlightened a strong and progressive specialization of the microbial communities associated to substrate hydrolysis during its biodegradation. Observations using transmission electronic microscopy indicated that this modification corresponds to a progressive degradation of the straw tissues depending on their lignification degree. Furthermore, the identification of physical barriers, rarely described in anaerobic digestion, suggests that substrate accessibility is the main parameter limiting the reaction. This information suggests that substrate milling can be theoretically a good pretreatment to improve dry anaerobic digestion. However, a last experiment showed that fine milling limits the process performances by a higher risk of acidification in digesters.

La création de nouvelles enzymes pour l’hydrolyse de la biomasse est une stratégie clé pour ledéveloppement du bioraffinage. Dans ce contexte, les xylanases de la famille GH11 sont déjàdéployées dans de nombreux procédés industriels et donc bien positionnées pour jouer un rôleimportant dans ces procédés. La cible de cette étude, la xylanase GH11 (Tx-Xyl) de la bactérieThermobacillus xylanilyticus, est une enzyme thermostable et donc une bonne candidate pour destravaux d’ingénierie visant l’amélioration de son activité sur des substrats ligno-cellulosiques.Dans cette étude, deux stratégies d’ingénierie des enzymes ont été employées afin d’obtenir denouvelles informations portants sur les relations structure-fonction au sein de Tx-Xyl. La premièrestratégie a consisté en l’utilisation d’une approche de mutagenèse aléatoire, couplée à l’emploi deméthodes de recombinaison in vitro. Ces travaux avaient pour objectif d’améliorer la capacitéhydrolytique de Tx-Xyl sur la paille de blé. La deuxième stratégie mise en oeuvre s’est appuyée surune approche semi-rationnelle visant la création d’une enzyme chimérique, qui bénéficierait d’uneamélioration des interactions enzyme-substrat au niveau du sous-site -3.Le premier résultat majeur de cette thèse concerne le développement d’une méthode de criblagequi permet l’analyse à haut débit de banques de mutants pour la détection de variants quiprésentent une activité hydrolytique accrue directement sur paille de blé. A l’aide de ce crible, nousavons pu analyser plusieurs banques de mutants, représentant un total de six générations demutants, et identifier une série de combinaisons de mutations différentes. D’un côté, un variant,comportant deux mutations silencieuses, permet une meilleure expression de Tx-Xyl, alors qued’autres enzymes mutées présentent des modifications intrinsèques de leurs aptitudes catalytiques.Comparés à l’enzyme parentale Tx-Xyl, certains mutants solubilisent davantage les arabinoxylanes dela paille et, lorsqu’ils sont déployés avec un cocktail de cellulases, participent à une réactionsynergique qui permet un accroissement du rendement des pentoses et du glucose libérés.A l’aide d’une approche semi-rationnelle, une séquence de 17 acides aminés en provenance d’unexylanase GH11 fongique a été ajoutée à l’extrémité N-terminale de Tx-Xyl, afin de créer de nouveauxbrins β. L’enzyme chimérique a pu être exprimée avec succès et caractérisée. Néanmoins, l’analysede ses propriétés catalytiques a révélé que celle-ci ne présente pas davantage d’interactions avec sonsubstrat dans le sous-site -3, mais les résultats obtenus fournissent de nombreux renseignements surles relations structure-fonction au sein de l’enzyme. De plus, ces travaux nous permettent depostuler que Tx-Xyl posséderait un site de fixation secondaire pour les xylanes, un élement jusqu’iciinsoupçonné dans cette enzyme. Par ailleurs, l’analyse de nos résultats nous permet de proposer uneexplication rationnelle pour l’échec de notre stratégie initiale / Engineering new and powerful enzymes for biomass hydrolysis is one area that will facilitate thefuture development of biorefining. In this respect, xylanases from family GH11 are already importantindustrial biocatalysts that can contribute to 2nd generation biorefining. The target of this study, theGH11 xylanase (Tx-Xyl) from Thermobacillus xylanilyticus is thermostable, and is thus an interestingtarget for enzyme engineering, aiming at increasing its specific activity on lignocellulosic biomass,such as wheat straw. Nevertheless, the action of xylanases on complex biomass is not yet wellunderstood, and thus the use of a rational engineering approach is not really feasible.In this doctoral study, to gain new insight into structure-function relationships, two enzymeengineering strategies have been deployed. The first concerns the development of a randommutagenesis and in vitro DNA shuffling approach, which was used in order to improve the hydrolyticpotency of Tx-Xyl on wheat straw, while the second strategy consisted in the creation of a chimericenzyme, with the aim of probing and improving -3 subsite binding, and ultimately improvinghydrolytic activity.The first key results that has been obtained is the development of a novel high-throughputscreening method, which was devised in order to reliably pinpoint mutants that can better hydrolyzewheat straw. Using this screening method, several generations of mutant libraries have beenanalyzed and a series of improved enzyme variants have been identified. One mutant, bearing silentmutations, actually leads to higher gene expression, while others have intrinsically altered catalyticproperties. Testing of mutants has shown that some of the enzyme variants can improve thesolubilization of wheat straw arabinoxylans and can work in synergy with cellulose cocktails torelease both pentose sugars and glucose.Using a semi-rational approach, 17 amino acids have been added to the N-terminal of Tx-Xyl, withthe aim of adding two extra β-strands coming from a GH11 fungal xylanase. A chimeric enzyme hasbeen successfully expressed and purified and its catalytic properties have been investigated.Although this approach has failed to create increased -3 subsite binding, the data presented revealsimportant information on structure-function relationships and suggest that Tx-Xyl may possess ahitherto unknown secondary substrate binding site. Moreover, a rational explanation for the failureof the original strategy is proposed.

La litière de fumier recyclé (LFR) est utilisée dans les fermes canadiennes comme alternative à la litière conventionnelle de paille. Elle est obtenue par l’extraction de la fraction solide du fumier des vaches, parfois suivie par une maturation. Toutefois, les caractéristiques microbiologiques de cette litière sont peu documentées. Ainsi, cette étude a permis la description du microbiote et des caractéristiques microbiologiques de la LFR comparativement à la paille, avant et après leur utilisation, et d’évaluer l’impact de différentes méthodes de production de la LFR sur ces écosystèmes. Les résultats des analyses du microbiote ont démontré que la richesse et la diversité du microbiote de la LFR avant utilisation étaient différentes de celles de la paille. Les litières de fumier recyclé avant et après utilisation possédaient une diversité microbienne moindre comparativement à celles mesurées pour la paille avant et après utilisation. Aussi, les différentes méthodes de production de la LFR n’influençaient pas la richesse du microbiote, mais influencent sa composition. La méthode de production utilisant la séparation suivie d’une maturation en amas possédait une charge bactérienne moindre que celle utilisant la séparation suivit d’une maturation en boîte. Finalement, la LFR contenait plus de Listeria monocytogenes et de Salmonella spp que la litière de paille. Cela permet de conclure que la LFR, actuellement produite dans les fermes de l'Est du Canada, constitue un risque microbiologique plus élevé que la litière de paille. / Recycled manure solid bedding (RMS) is used on Canadian farms as an alternative to conventional straw bedding. RMS is obtained by extracting the solid fraction of dairy cow manure, sometimes followed by maturation. However, the microbiological characteristics of this bedding are poorly documented. This study allowed the description of the microbiota and microbiological characteristics of RMS compared to straw and assessed the impact of the RMS production methods on its microbiota. The results of the microbiota analyses demonstrated that the richness and diversity of the microbiota in unused RMS were different from unused straw. Unused RMS and used RMS possessed more similar microbial diversity compared to the microbial diversity between unused and used straw. Moreover, the different RMS production methods did not influence the richness of the microbiota but influence its composition. The RMS production method using separation followed by heap maturation had a lower bacterial load than production method using separation followed by box maturation. Finally, RMS contained more Listeria monocytogenes and Salmonella spp than straw bedding. This leads to the conclusion that RMS bedding currently produced on farms in Eastern Canada, clearly constitute a greater microbiological risk as compared to straw bedding.

Le son et la paille de blé, riches en hémicelluloses, sont deux co-produits de la récolte de blé, abondants et renouvelables, mais qui restent à mieux valoriser. Dans le but d'extraire ces hémicelluloses, possédant plusieurs propriétés intéressantes (filmogènes, épaississantes, émulsifiantes, stabilisantes…), un procédé de fractionnement a été élaboré. Ce procédé consiste, après extraction alcaline, en la purification des extraits hémicellulosiques obtenus. Deux techniques ont été appliquées : l'ultrafiltration et la chromatographie sur résine échangeuse d'anions. L'ultrafiltration a permis de concentrer les extraits d'hémicelluloses et de les purifier en éliminant dans le perméat la plupart des molécules contaminantes, essentiellement les sucres libres et les sels minéraux. Les principales limitations de cette étape étaient la viscosité des extraits et les phénomènes de polarisation de concentration et de colmatage des membranes. La percolation sur résine, quant à elle, a permis de décolorer les extraits et de produire des poudres d'hémicelluloses plus claires en fixant certaines molécules colorées telles que les molécules possédant des groupements phénoliques. La combinaison des deux techniques a permis de produire des hémicelluloses pures à 60%. L'extrapolation du procédé à l'échelle pilote par l'utilisation d'un extrudeur bi-vis a permis d'obtenir des poudres d'hémicelluloses pures à 40%. / Wheat bran and wheat straw are two by-products abundant and renewable, rich in hemicelluloses, but still not well valued. In order to extract these hemicelluloses characterized by their several interesting properties (film-forming, thickening, emulsifying, stabilizing…), a fractionation process was developed. This process consisted, after alkaline extraction, to purify the hemicellulosic extracts obtained. Two techniques were used: ultrafiltration and chromatography on anion exchange resin. The ultrafiltration allowed to concentrate the extracts and to purify them by removing in the permeate, the contaminating molecules, mostly free sugars and minerals. The main limiting factors of this stage were the extracts viscosity and the fouling of the membranes. The percolation on the resin discoloured the extracts and allowed to produce hemicellulosic powders with lighter colours and that by capturing the coloured compounds such as molecules with phenolic groups. The combination of the two techniques allowed the production of purified hemicelluloses; the purity was about 60%. The extrapolation of the process at a pilot scale using a twin-screw extruder allowed to obtain hemicelluloses with a purity of 40%.