A citricultura brasileira é considerada a mais competitiva do mundo, principalmente devido às excelentes condições encontradas pelos produtores aqui instalados, com ênfase ao Estado de São Paulo, maior produtor mundial de suco de laranja concentrado. Contudo, as características deste ramo do agronegócio favorecem a existência e propagação de inúmeras pragas e doenças. Recentemente a produção cítrica, em especial a produção de mudas, sofreu grandes mudanças. A CVC (Clorose Variegada dos Citros) doença causada pela bactéria Xylella fastidiosa, provocou a obrigatoriedade da produção de mudas cítricas em ambiente protegido desde janeiro de 2003. A produção de mudas cítricas no Brasil sempre se constituiu em atividade de suma importância para o desenvolvimento desta cultura. Porém, da mesma forma que muda de boa qualidade se constitui em um dos principais alicerces da citricultura, uma ruim pode fadar o citricultor à inviabilidade do negócio. Neste contexto o presente trabalho objetivou estudar as características biológicas das duas principais espécies de plantas daninhas que ocorrem em sistemas de produção de mudas cítricas (Oxalis corniculata L. e Cardamine bonariensis Pers.) quanto as condições ideais para sua germinação, verificar sua ocorrência em substratos e suas matérias primas, verificar a eficiência da compostagem da casca de Pinus em seu controle, avaliar o efeito de herbicidas aplicados em pré emergência sobre o substrato no cultivo de mudas e se a presença de O. corniculata afeta o desenvolvimento de mudas cítricas. Os resultados mostram que para O. corniculata as temperaturas que proporcionaram os maiores porcentuais de germinação (G%) foram 20 e 15 °C constantes, sendo nesta espécie o índice de velocidade de germinação (IVG) superior quando as sementes foram submetidas à temperatura constante de 20 °C, ambos os casos quando houve a presença de luz. Para C. bonariensis as temperaturas que proporcionaram os maiores G% foram 20/30 e 20/35 °C alternadas, sendo que para esta espécie o IVG foi superior quando as sementes foram submetidas à temperatura alternada de 20/30 °C, ambos os casos quando houve a presença de luz. As amostras coletadas dos materiais constituintes dos substratos não apresentaram contaminação por nenhum propágulo de planta daninha, detectável pela emergência de plântulas. O processo de compostagem da casca de Pinus é capaz de inviabilizar sementes de O. corniculata, C. bonariensis, Portulaca oleracea e Digitaria spp, bem como tubérculos de Cyperus rotundus em período de 30 dias. Em relação a aplicação de herbicidas no substrato é possível concluir que para as condições onde o experimento foi conduzido, a utilização dos herbicidas oxyfluorfen, flumioxazin, ametryn e oxadiazon não afeteram o desenvolvimento dos porta-enxertos de limoeiro 'Cravo', em nenhuma das doses utilizadas, sendo que aos 80 dias após o transplantio dos porta-enxertos, os herbicidas oxifluorfen e oxadiazon apresentam bons índices de controle de O. corniculata. A presença de O. corniculata nos vasos de produção de mudas cítricas afeta o desenvolvimento das mudas, sobretudo no que se refere à altura do porta-enxerto e massa seca do enxerto. A convivência das mudas com esta planta daninha não afeta o diâmetro do caule das mudas, a massa seca do porta-enxerto, a massa seca da raiz, bem como a massa seca total da muda. O período crítico de prevenção da interferência obtido no trabalho se estende dos 52 aos 69 DAT, admitindo-se 2,5 % de perdas aceitáveis. / The Brazilian citrus production is considered the most competitive in the world mainly because of the excellent conditions that the producers have, with emphasis to the State of São Paulo, the world's largest producer of concentrated orange juice. Despite this, the characteristics of this branch of the agribuisiness are favorable to the proliferation of pests and diseases. Recently, the citrus production, especially the nursery production, has suffered significant changes. The CVC, a disease caused by the Xyllella fastidiosa bacteria has forced the young tree production to be conducted in a protected environment since January 1993. The young citrus tree production has always been considered a very important activity for the development of the citrus culture. A good young tree can be considered one of the bases of the citrus production just as well as a bad young tree can be the factor that makes the business non profitable. In this context, the present study has the objective to analyze the biological characteristics of the two main weed species (Oxalis corniculata L. and Cardamine bonariensis Pers.) that occur in the citrus nursery production systems, verifying the ideal conditions in which their germination takes place, their presence in substrates and its primary material, the efficiency of the bark compost in their control, evaluate the application of preemergence herbicides on the substrate used in the nursery production and if the presence of O. orniculata affects the development of the young citrus tree. The results indicate that for O. corniculata the constant temperatures of 15 and 20°C promoted the highest germination indexes and the exposure of seeds to a constant temperature of 20 °C led to the highest levels of GSI. In both cases the seeds where submitted to the presence of light. For C. bonariensis the alternating temperatures 20/30 and 20/35 °C promoted the highest germination indexes and alternating temperature 20/30 °C promoted the highest levels of GSI. In both cases the seeds where submitted to the presence of light. The samples of the primary material of the substrate did not present contamination with weed seeds, detected through weed plant germination. The bark compost process is capable of invalidating the sedds of O. corniculata, C. bonariensis, Portulaca oleraceae and Digitaria spp and Cyprus rotundus tubers in a period of 30 days. In reference to the experiment conducted in this study, the use of the herbicides oxyfluorfen, flumioxazin, ametryn and oxadiazon did not affect de development of the root stock 'limoeiro-cravo? in any of the doses, and after 80 days of the transplant of the root stock the herbicide oxyfluorfen and oxadiazon presents good control indexes for O.corniculta. The presence of O. corniculata in the citrus nursery containers affected the development of the young trees, especially the height of the rootstock and the dry mass of the graft; it doesn't interfere with the development of the stem diameter and of the dry mass of the rootstock, of the roots our the total dry mass of the young tree. The critical period of competition extends it self from 52 to 69 DAT considering 2,5 % of acceptable lost.

A citricultura brasileira é considerada a mais competitiva do mundo, principalmente devido às excelentes condições encontradas pelos produtores aqui instalados, com ênfase ao Estado de São Paulo, maior produtor mundial de suco de laranja concentrado. Contudo, as características deste ramo do agronegócio favorecem a existência e propagação de inúmeras pragas e doenças. Recentemente a produção cítrica, em especial a produção de mudas, sofreu grandes mudanças. A CVC (Clorose Variegada dos Citros) doença causada pela bactéria Xylella fastidiosa, provocou a obrigatoriedade da produção de mudas cítricas em ambiente protegido desde janeiro de 2003. A produção de mudas cítricas no Brasil sempre se constituiu em atividade de suma importância para o desenvolvimento desta cultura. Porém, da mesma forma que muda de boa qualidade se constitui em um dos principais alicerces da citricultura, uma ruim pode fadar o citricultor à inviabilidade do negócio. Neste contexto o presente trabalho objetivou estudar as características biológicas das duas principais espécies de plantas daninhas que ocorrem em sistemas de produção de mudas cítricas (Oxalis corniculata L. e Cardamine bonariensis Pers.) quanto as condições ideais para sua germinação, verificar sua ocorrência em substratos e suas matérias primas, verificar a eficiência da compostagem da casca de Pinus em seu controle, avaliar o efeito de herbicidas aplicados em pré emergência sobre o substrato no cultivo de mudas e se a presença de O. corniculata afeta o desenvolvimento de mudas cítricas. Os resultados mostram que para O. corniculata as temperaturas que proporcionaram os maiores porcentuais de germinação (G%) foram 20 e 15 °C constantes, sendo nesta espécie o índice de velocidade de germinação (IVG) superior quando as sementes foram submetidas à temperatura constante de 20 °C, ambos os casos quando houve a presença de luz. Para C. bonariensis as temperaturas que proporcionaram os maiores G% foram 20/30 e 20/35 °C alternadas, sendo que para esta espécie o IVG foi superior quando as sementes foram submetidas à temperatura alternada de 20/30 °C, ambos os casos quando houve a presença de luz. As amostras coletadas dos materiais constituintes dos substratos não apresentaram contaminação por nenhum propágulo de planta daninha, detectável pela emergência de plântulas. O processo de compostagem da casca de Pinus é capaz de inviabilizar sementes de O. corniculata, C. bonariensis, Portulaca oleracea e Digitaria spp, bem como tubérculos de Cyperus rotundus em período de 30 dias. Em relação a aplicação de herbicidas no substrato é possível concluir que para as condições onde o experimento foi conduzido, a utilização dos herbicidas oxyfluorfen, flumioxazin, ametryn e oxadiazon não afeteram o desenvolvimento dos porta-enxertos de limoeiro 'Cravo', em nenhuma das doses utilizadas, sendo que aos 80 dias após o transplantio dos porta-enxertos, os herbicidas oxifluorfen e oxadiazon apresentam bons índices de controle de O. corniculata. A presença de O. corniculata nos vasos de produção de mudas cítricas afeta o desenvolvimento das mudas, sobretudo no que se refere à altura do porta-enxerto e massa seca do enxerto. A convivência das mudas com esta planta daninha não afeta o diâmetro do caule das mudas, a massa seca do porta-enxerto, a massa seca da raiz, bem como a massa seca total da muda. O período crítico de prevenção da interferência obtido no trabalho se estende dos 52 aos 69 DAT, admitindo-se 2,5 % de perdas aceitáveis. / The Brazilian citrus production is considered the most competitive in the world mainly because of the excellent conditions that the producers have, with emphasis to the State of São Paulo, the world's largest producer of concentrated orange juice. Despite this, the characteristics of this branch of the agribuisiness are favorable to the proliferation of pests and diseases. Recently, the citrus production, especially the nursery production, has suffered significant changes. The CVC, a disease caused by the Xyllella fastidiosa bacteria has forced the young tree production to be conducted in a protected environment since January 1993. The young citrus tree production has always been considered a very important activity for the development of the citrus culture. A good young tree can be considered one of the bases of the citrus production just as well as a bad young tree can be the factor that makes the business non profitable. In this context, the present study has the objective to analyze the biological characteristics of the two main weed species (Oxalis corniculata L. and Cardamine bonariensis Pers.) that occur in the citrus nursery production systems, verifying the ideal conditions in which their germination takes place, their presence in substrates and its primary material, the efficiency of the bark compost in their control, evaluate the application of preemergence herbicides on the substrate used in the nursery production and if the presence of O. orniculata affects the development of the young citrus tree. The results indicate that for O. corniculata the constant temperatures of 15 and 20°C promoted the highest germination indexes and the exposure of seeds to a constant temperature of 20 °C led to the highest levels of GSI. In both cases the seeds where submitted to the presence of light. For C. bonariensis the alternating temperatures 20/30 and 20/35 °C promoted the highest germination indexes and alternating temperature 20/30 °C promoted the highest levels of GSI. In both cases the seeds where submitted to the presence of light. The samples of the primary material of the substrate did not present contamination with weed seeds, detected through weed plant germination. The bark compost process is capable of invalidating the sedds of O. corniculata, C. bonariensis, Portulaca oleraceae and Digitaria spp and Cyprus rotundus tubers in a period of 30 days. In reference to the experiment conducted in this study, the use of the herbicides oxyfluorfen, flumioxazin, ametryn and oxadiazon did not affect de development of the root stock 'limoeiro-cravo? in any of the doses, and after 80 days of the transplant of the root stock the herbicide oxyfluorfen and oxadiazon presents good control indexes for O.corniculta. The presence of O. corniculata in the citrus nursery containers affected the development of the young trees, especially the height of the rootstock and the dry mass of the graft; it doesn't interfere with the development of the stem diameter and of the dry mass of the rootstock, of the roots our the total dry mass of the young tree. The critical period of competition extends it self from 52 to 69 DAT considering 2,5 % of acceptable lost.

A maioria das proteínas organelares são codificadas pelo núcleo, sintetizadas no citosol e direcionadas especificamente ao seu destino final. O direcionamento aos diferentes subcompartimentos subcelulares é feito por uma complexa e ampla maquinaria que envolve sequências de direcionamento, proteínas citossólicas e receptores organelares específicos. Entretanto, relativamente pouco se conhece sobre o processo na qual uma proteína recém sintetizada é transportada ao seu destino final. Parte significativa das proteínas destinadas às organelas possui a informação necessária ao seu transporte localizada na extremidade N-terminal. Vários estudos têm buscado caracterizar as etapas que envolvem a localização de uma proteína, desde os estágios iniciais após a sua síntese até os fatores que regulam o seu correto endereçamento. Modificações pós-traducionais, regiões 5-UTR, região C-terminal, transporte por vias alternativas e interações proteína-proteína podem agir na localização subcelular de proteínas. O estudo de redes biomoleculares se tornou um dos focos de estudo da biologia de sistemas e demonstra um enorme potencial na descoberta de diversos processos biológicos, como as interações proteína-proteína. As proteínas que possuem duplo direcionamento (DD) em Arabidopsis thaliana foram analisadas em redes de interação proteína-proteína (PPI) e proteínas que interagem com proteínas de DD foram escolhidas quanto a função e localização para a verificação de um eventual papel dessas proteínas na localização subcelular de outras proteínas. Para tanto, foram realizadas varreduras em ensaios de duplo-híbrido em levedura para os genes de GRF9 (14-3-3) e ATH7 (tiorredoxina tipo h). Os resultados para GRF9 incluem as proteínas peroxidase PRXR1 e dihidrolipoamida acetiltransferase. Já os resultados para ATH7 mostram a interação com glutamina sintetase (AT5G35630.3). A combinação dos estudos in silico com a varredura via duplo-híbrido de levedura abrem novas perspectivas no entendimento do controle da localização subcelular de proteínas. / Most organellar proteins are nuclear encoded, synthesized in the cytosol and then targeted to their destination. Specific subcellular targeting is conducted by a complex machinery for the specific localization of the proteins, which includes targeting sequences, cytosolic proteins and specific organelar receptors. However, little is known about the process that happens from the synthesis of a protein and the transport to its final destination. Most organellar proteins contain the information for their localization in the N-terminal sequence. Many studies have searched to characterize the steps involved in protein targeting, from the early stages after its synthesis to the cytosolic factors regulating its correct localization. Post-translational modifications, 5-UTR regions, the C-terminal extension on the protein, alternative transport pathways and proteinprotein interactions may influence the subcellular location of some proteins. The use of biomolecular netwoks has become one of the main focus of systems biology studies and possess a major potential in the discovery of several biological processes, such as protein-protein interactions (PPI). Dual-targeted (DT) proteins in Arabidopsis thaliana were analyzed through a PPI network, and the proteins displaying interactions with DT proteins were selected by their funtion and location. The selected proteins were analyzed for their eventual role in the subcellular targeting of other proteins. Screenings in yeast two-hibrid assays were performed for the genes GRF9 (14-3-3) and ATH7 (h-type thioredoxin). The results for GRF9 include a peroxidase (PRXR1) and dihydrolipamide acetyltransferase. The results for ATH7 include glutamine synthetase (AT5G35630.3). Combination of in silico analysis with yeast two-hibrid screenings provide new perspectives for understanding the control of subcellular localization.

A maioria das proteínas organelares são codificadas pelo núcleo, sintetizadas no citosol e direcionadas especificamente ao seu destino final. O direcionamento aos diferentes subcompartimentos subcelulares é feito por uma complexa e ampla maquinaria que envolve sequências de direcionamento, proteínas citossólicas e receptores organelares específicos. Entretanto, relativamente pouco se conhece sobre o processo na qual uma proteína recém sintetizada é transportada ao seu destino final. Parte significativa das proteínas destinadas às organelas possui a informação necessária ao seu transporte localizada na extremidade N-terminal. Vários estudos têm buscado caracterizar as etapas que envolvem a localização de uma proteína, desde os estágios iniciais após a sua síntese até os fatores que regulam o seu correto endereçamento. Modificações pós-traducionais, regiões 5-UTR, região C-terminal, transporte por vias alternativas e interações proteína-proteína podem agir na localização subcelular de proteínas. O estudo de redes biomoleculares se tornou um dos focos de estudo da biologia de sistemas e demonstra um enorme potencial na descoberta de diversos processos biológicos, como as interações proteína-proteína. As proteínas que possuem duplo direcionamento (DD) em Arabidopsis thaliana foram analisadas em redes de interação proteína-proteína (PPI) e proteínas que interagem com proteínas de DD foram escolhidas quanto a função e localização para a verificação de um eventual papel dessas proteínas na localização subcelular de outras proteínas. Para tanto, foram realizadas varreduras em ensaios de duplo-híbrido em levedura para os genes de GRF9 (14-3-3) e ATH7 (tiorredoxina tipo h). Os resultados para GRF9 incluem as proteínas peroxidase PRXR1 e dihidrolipoamida acetiltransferase. Já os resultados para ATH7 mostram a interação com glutamina sintetase (AT5G35630.3). A combinação dos estudos in silico com a varredura via duplo-híbrido de levedura abrem novas perspectivas no entendimento do controle da localização subcelular de proteínas. / Most organellar proteins are nuclear encoded, synthesized in the cytosol and then targeted to their destination. Specific subcellular targeting is conducted by a complex machinery for the specific localization of the proteins, which includes targeting sequences, cytosolic proteins and specific organelar receptors. However, little is known about the process that happens from the synthesis of a protein and the transport to its final destination. Most organellar proteins contain the information for their localization in the N-terminal sequence. Many studies have searched to characterize the steps involved in protein targeting, from the early stages after its synthesis to the cytosolic factors regulating its correct localization. Post-translational modifications, 5-UTR regions, the C-terminal extension on the protein, alternative transport pathways and proteinprotein interactions may influence the subcellular location of some proteins. The use of biomolecular netwoks has become one of the main focus of systems biology studies and possess a major potential in the discovery of several biological processes, such as protein-protein interactions (PPI). Dual-targeted (DT) proteins in Arabidopsis thaliana were analyzed through a PPI network, and the proteins displaying interactions with DT proteins were selected by their funtion and location. The selected proteins were analyzed for their eventual role in the subcellular targeting of other proteins. Screenings in yeast two-hibrid assays were performed for the genes GRF9 (14-3-3) and ATH7 (h-type thioredoxin). The results for GRF9 include a peroxidase (PRXR1) and dihydrolipamide acetyltransferase. The results for ATH7 include glutamine synthetase (AT5G35630.3). Combination of in silico analysis with yeast two-hibrid screenings provide new perspectives for understanding the control of subcellular localization.

A maca (Lepidium meyenii Walpers) é uma planta herbácea bienal da família Brassicae, cultivada principalmente na região dos Andes da América do Sul. A parte subterrânea vem sendo consumida por muito tempo devido a seu valor nutricional e energético, mas é mais conhecida no mercado peruano e internacional por alegadas propriedades terapêuticas. Esta raiz apresenta até 76% de carboidratos, dos quais 30% é amido. Este trabalho teve como objetivos estudar: as propriedades físico-químicas e funcionais do amido isolado; os parâmetros enzimáticos durante o armazenamento e a purificação parcial de enzimas amilolíticas. Em relação às propriedades do amido, este apresentou um teor de amilose de 20% valor semelhante aos encontrados em raízes e tubérculos similares. A turbidez das suspensões de amido apresentou estabilidade durante o armazenamento. A temperatura de gelatinização e a viscosidade da pasta foram a 45,7° e 46°C, respectivamente. Com base nos dados obtidos, o amido de maca seria indicado para alimentos que requeiram temperaturas moderadas no processamento, não sendo apropriado para o emprego em alimentos congelados. Os parâmetros enzimáticos medidos tais como teor de amido total, teor de açúcares solúveis, atividade amilolítica total, atividade de α e β amilases, não mostraram diferenças significativas entre as medidas durante um período de armazenamento de 16 dias. As microscopias eletrônicas de varredura (MEV) dos grânulos de amido mostraram grãos íntegros com superfícies lisas, com algumas depressões ao redor dos grânulos os quais poderiam indicar o inicio de ataque enzimático, ou fraturas na purificação. Em relação à purificação de enzimas amilolíticas, foi possível separar uma fração ativa com a carboximetilcelulose (CMC) seguida de cromatografia liquida de alta resolução (CLAE) que permitiu a separação de duas frações protéicas, analisadas por eletroforese SDS-PAGE e eletroforese bidimensional (2D). Os polipeptídeos identificados no gel 2D apresentaram massa molecular semelhante entre 22 a 27 kDa, e os pontos isoelétricos entre 4,8 e 7,3. / Maca (Lepidium meyenii Walpers) is a biennial herbaceous plant from Brassicae family, grown mainly in the Andes of South America. The underground part has been consumed for a long time due to its nutritional value and energy, but is best known in the Peruvian and international market for alleged therapeutic properties. This root has up to 76% carbohydrates, of which 30% is starch. This work aimed to study: the physico-chemical properties of isolated starch, the enzymatic parameters during storage and partial purification of amylases. In relation to the properties of starch, the amylose content showed a 20% value similar to those found in roots and tubers alike. The turbidity of starch suspensions was stable during storage. The gelatinization temperature and viscosity of the paste were 45.7 ° and 46 ° C, respectively. Based on data obtained from the starch of litter would be given to foods that require moderate temperatures in processing and is not suitable for use in frozen foods. The enzymatic parameters measured such as total starch content, soluble sugars, total amylolytic activity, activity of α and β amylases, showed no significant differences between the measures over a storage period of 16 days. Electronic microscopy (SEM) of starch granules showed grains with smooth surfaces, with some depressions around the granules which could indicate the beginning of enzymatic attack, or fractures in the purification. Regarding the purification of amylases was possible to separate an active fraction with carboxymethylcellulose (CMC) followed by high-resolution liquid chromatography (HPLC) which allowed the separation of two protein fractions, analyzed by SDS-PAGE and two-dimensional electrophoresis (2D ). The polypeptides had a molecular mass between 22 and 27 kDa and isoelectric points ranging from 4.8 to 7.3.

A maca (Lepidium meyenii Walpers) é uma planta herbácea bienal da família Brassicae, cultivada principalmente na região dos Andes da América do Sul. A parte subterrânea vem sendo consumida por muito tempo devido a seu valor nutricional e energético, mas é mais conhecida no mercado peruano e internacional por alegadas propriedades terapêuticas. Esta raiz apresenta até 76% de carboidratos, dos quais 30% é amido. Este trabalho teve como objetivos estudar: as propriedades físico-químicas e funcionais do amido isolado; os parâmetros enzimáticos durante o armazenamento e a purificação parcial de enzimas amilolíticas. Em relação às propriedades do amido, este apresentou um teor de amilose de 20% valor semelhante aos encontrados em raízes e tubérculos similares. A turbidez das suspensões de amido apresentou estabilidade durante o armazenamento. A temperatura de gelatinização e a viscosidade da pasta foram a 45,7° e 46°C, respectivamente. Com base nos dados obtidos, o amido de maca seria indicado para alimentos que requeiram temperaturas moderadas no processamento, não sendo apropriado para o emprego em alimentos congelados. Os parâmetros enzimáticos medidos tais como teor de amido total, teor de açúcares solúveis, atividade amilolítica total, atividade de α e β amilases, não mostraram diferenças significativas entre as medidas durante um período de armazenamento de 16 dias. As microscopias eletrônicas de varredura (MEV) dos grânulos de amido mostraram grãos íntegros com superfícies lisas, com algumas depressões ao redor dos grânulos os quais poderiam indicar o inicio de ataque enzimático, ou fraturas na purificação. Em relação à purificação de enzimas amilolíticas, foi possível separar uma fração ativa com a carboximetilcelulose (CMC) seguida de cromatografia liquida de alta resolução (CLAE) que permitiu a separação de duas frações protéicas, analisadas por eletroforese SDS-PAGE e eletroforese bidimensional (2D). Os polipeptídeos identificados no gel 2D apresentaram massa molecular semelhante entre 22 a 27 kDa, e os pontos isoelétricos entre 4,8 e 7,3. / Maca (Lepidium meyenii Walpers) is a biennial herbaceous plant from Brassicae family, grown mainly in the Andes of South America. The underground part has been consumed for a long time due to its nutritional value and energy, but is best known in the Peruvian and international market for alleged therapeutic properties. This root has up to 76% carbohydrates, of which 30% is starch. This work aimed to study: the physico-chemical properties of isolated starch, the enzymatic parameters during storage and partial purification of amylases. In relation to the properties of starch, the amylose content showed a 20% value similar to those found in roots and tubers alike. The turbidity of starch suspensions was stable during storage. The gelatinization temperature and viscosity of the paste were 45.7 ° and 46 ° C, respectively. Based on data obtained from the starch of litter would be given to foods that require moderate temperatures in processing and is not suitable for use in frozen foods. The enzymatic parameters measured such as total starch content, soluble sugars, total amylolytic activity, activity of α and β amylases, showed no significant differences between the measures over a storage period of 16 days. Electronic microscopy (SEM) of starch granules showed grains with smooth surfaces, with some depressions around the granules which could indicate the beginning of enzymatic attack, or fractures in the purification. Regarding the purification of amylases was possible to separate an active fraction with carboxymethylcellulose (CMC) followed by high-resolution liquid chromatography (HPLC) which allowed the separation of two protein fractions, analyzed by SDS-PAGE and two-dimensional electrophoresis (2D ). The polypeptides had a molecular mass between 22 and 27 kDa and isoelectric points ranging from 4.8 to 7.3.

Na célula eucariota, os processos metabólicos estão compartimentalizados em organelas e proteínas sintetizadas no citosol são endereçadas para elas por meio de sistema celular específico. Devido a sobreposições funcionais entre organelas, uma dada proteína pode ser requerida em mais de um compartimento. É o caso de proteínas com duplo direcionamento, em que um gene nuclear é capaz de gerar produtos protéicos direcionados para mais de uma organela. Cerca de 60 proteínas de plantas já tiveram seu duplo direcionamento demonstrado, a maioria para mitocôndrias e cloroplastos, portanto um fenômeno não tão raro como imaginado. Estudos recentes procuram esclarecer os mecanismos que permitem esse duplo direcionamento, mesmo existindo fatores celulares que garantem a especificidade do transporte para cada organela. O presente trabalho está dividido em três partes. Na primeira, foram investigados aspectos evolutivos do duplo direcionamento. Na análise comparativa de famílias gênicas com membros cujos produtos protéicos apresentam duplo direcionamento, em Arabidopsis thaliana e Oryza sativa, foi demonstrada a conservação do duplo direcionamento de monodeidroascorbato redutase, metionina aminopeptidase e, provavelmente, de THI1 (enzima da biossíntese de tiazol), entre as duas espécies. Os dados sugeriram um mesmo padrão de evolução em famílias incluindo membros com duplo direcionamento. Na segunda parte, o foco foi a seqüência de duplo direcionamento. Documentado o duplo direcionamento, para mitocôndrias e cloroplastos, de proteínas de ligação ao RNA, RBP1a, RBP1b e RPS19, mutações sítiodirigidas foram introduzidas na seqüência de direcionamento de RBP1b. A importância de aminoácidos positivos para o direcionamento de proteínas para mitocôndrias foi confirmada. Demonstrou-se que a mutação da alanina na posição 2, conservada em seqüências de direcionamento ambíguas para mitocôdrias e cloroplastos, não afeta o duplo direcionamento de RBP1b. A informação para o duplo direcionamento foi localizada entre os 17 primeiros aminoácidos da região amino-terminal. Os sinais de direcionamento para cloroplastos se distribuíram ao longo da seqüência. Enquanto a metade amino-terminal da seqüência foi suficiente para determinar o duplo direcionamento, a seqüência compreendendo os 13 aminoácidos seguintes afetaram a eficiência do transporte. Nessas análises, mostrou-se a adequação de método quantitativo na medida dos sinais de fluorescência da GFP, para ser aplicado em estudos quantitativos do direcionamento de proteínas para mitocôndrias e cloroplastos, in vivo. Na terceira parte, o foco foi o mecanismo traducional do duplo direcionamento de THI1, em A. thaliana. Entretanto, não foi possível testar a hipótese da presença de um sítio interno de entrada do ribossomo (IRES) no mRNA de thi1, pois não se encontrou um sistema de expressão transiente capaz de reproduzir dados da literatura que mostraram o duplo direcionamento de THI1. Nos sistemas testados, a proteína foi encontrada somente em cloroplastos, o que inviabilizou o prosseguimento da investigação. / Compartimentalization of the metabolic processes in organelles, each one having a characteristic protein pool and distinct functions, is a property of eukaryote cells. A highly specific cellular system directs proteins, which are synthesized in the cytosol, to the proper organelles. However, due to functional overlaps between organelles, a given protein may be needed in different compartments. This is the case of dual-targeted proteins, which are the product of single nuclear genes, but are somehow directed to different organelles. About 60 plant proteins have had their dual targeting demonstrated, most of them to mitochondria and cloroplasts, the phenomenon being not so rare as previously supposed. Investigations have focused on the mechanisms, which enable protein dual targeting, even in the presence of other cell mechanisms that guarantee the specific protein transport to each organelle. The present work on the subject can be divided in three parts. In the first part, evolutionary aspects of dual targeting were investigated. A comparative analysis of gene families that included members encoding dual-targeted proteins in Arabidopsis thaliana and Oryza sativa demonstrated that the dual targeting of monodehidro-ascorbate reductase, methyonine aminopeptidase and, problably, of the thiazole biosynthetic enzyme THI1 was evolutionary conserved between the two species. In addition, the data suggested the same pattern of evolution for families with members presenting dual targeting. The focus of the second part was the ambiguous sequence for dual targeting. After showing that the RNA-binding proteins RBP1a, RBP1b and RPS19 were dual-targeted to mitochondria and cloroplasts, sitedirected mutations were introduced in the targeting sequence of RBP1b. The importance of positive-charged amino acids for directing the protein to mitochondria was confirmed. Mutation of alanine at position 2, which is conserved in ambiguous sequences, was shown not to affect RBP1b dual targeting. Information for dual targeting was localized among the 17 first amino acids in the amino-terminal region. The signals for directing the protein to cloroplasts appeared distributed along the targeting sequence. While the amino-terminal half of the sequence was sufficient for RBP1b dual targeting, the sequence comprising the next 13 amino acids appeared to affect the efficiency of the transport. In these analyses, a quantitative method to measure the intensity of fluorescent signals of GFP had its efficacy demonstrated to be adopted for in vivo quantitative analysis of dual targeting to mitochondria and cloroplasts. In the third part, the focus was the translational mechanism enabling THI1 dual targeting to mitochondria and cloroplasts, in A. thaliana. It was hypothesized that an internal ribosomal entry site (IRES) was present in thi1 mRNA. However, a transient expression system could not be found that reproduced the literature data demonstrating THI1 dual targeting. In the tested systems the protein was addressed solely to cloroplasts, thus preventing the objective to be pursued.

Na célula eucariota, os processos metabólicos estão compartimentalizados em organelas e proteínas sintetizadas no citosol são endereçadas para elas por meio de sistema celular específico. Devido a sobreposições funcionais entre organelas, uma dada proteína pode ser requerida em mais de um compartimento. É o caso de proteínas com duplo direcionamento, em que um gene nuclear é capaz de gerar produtos protéicos direcionados para mais de uma organela. Cerca de 60 proteínas de plantas já tiveram seu duplo direcionamento demonstrado, a maioria para mitocôndrias e cloroplastos, portanto um fenômeno não tão raro como imaginado. Estudos recentes procuram esclarecer os mecanismos que permitem esse duplo direcionamento, mesmo existindo fatores celulares que garantem a especificidade do transporte para cada organela. O presente trabalho está dividido em três partes. Na primeira, foram investigados aspectos evolutivos do duplo direcionamento. Na análise comparativa de famílias gênicas com membros cujos produtos protéicos apresentam duplo direcionamento, em Arabidopsis thaliana e Oryza sativa, foi demonstrada a conservação do duplo direcionamento de monodeidroascorbato redutase, metionina aminopeptidase e, provavelmente, de THI1 (enzima da biossíntese de tiazol), entre as duas espécies. Os dados sugeriram um mesmo padrão de evolução em famílias incluindo membros com duplo direcionamento. Na segunda parte, o foco foi a seqüência de duplo direcionamento. Documentado o duplo direcionamento, para mitocôndrias e cloroplastos, de proteínas de ligação ao RNA, RBP1a, RBP1b e RPS19, mutações sítiodirigidas foram introduzidas na seqüência de direcionamento de RBP1b. A importância de aminoácidos positivos para o direcionamento de proteínas para mitocôndrias foi confirmada. Demonstrou-se que a mutação da alanina na posição 2, conservada em seqüências de direcionamento ambíguas para mitocôdrias e cloroplastos, não afeta o duplo direcionamento de RBP1b. A informação para o duplo direcionamento foi localizada entre os 17 primeiros aminoácidos da região amino-terminal. Os sinais de direcionamento para cloroplastos se distribuíram ao longo da seqüência. Enquanto a metade amino-terminal da seqüência foi suficiente para determinar o duplo direcionamento, a seqüência compreendendo os 13 aminoácidos seguintes afetaram a eficiência do transporte. Nessas análises, mostrou-se a adequação de método quantitativo na medida dos sinais de fluorescência da GFP, para ser aplicado em estudos quantitativos do direcionamento de proteínas para mitocôndrias e cloroplastos, in vivo. Na terceira parte, o foco foi o mecanismo traducional do duplo direcionamento de THI1, em A. thaliana. Entretanto, não foi possível testar a hipótese da presença de um sítio interno de entrada do ribossomo (IRES) no mRNA de thi1, pois não se encontrou um sistema de expressão transiente capaz de reproduzir dados da literatura que mostraram o duplo direcionamento de THI1. Nos sistemas testados, a proteína foi encontrada somente em cloroplastos, o que inviabilizou o prosseguimento da investigação. / Compartimentalization of the metabolic processes in organelles, each one having a characteristic protein pool and distinct functions, is a property of eukaryote cells. A highly specific cellular system directs proteins, which are synthesized in the cytosol, to the proper organelles. However, due to functional overlaps between organelles, a given protein may be needed in different compartments. This is the case of dual-targeted proteins, which are the product of single nuclear genes, but are somehow directed to different organelles. About 60 plant proteins have had their dual targeting demonstrated, most of them to mitochondria and cloroplasts, the phenomenon being not so rare as previously supposed. Investigations have focused on the mechanisms, which enable protein dual targeting, even in the presence of other cell mechanisms that guarantee the specific protein transport to each organelle. The present work on the subject can be divided in three parts. In the first part, evolutionary aspects of dual targeting were investigated. A comparative analysis of gene families that included members encoding dual-targeted proteins in Arabidopsis thaliana and Oryza sativa demonstrated that the dual targeting of monodehidro-ascorbate reductase, methyonine aminopeptidase and, problably, of the thiazole biosynthetic enzyme THI1 was evolutionary conserved between the two species. In addition, the data suggested the same pattern of evolution for families with members presenting dual targeting. The focus of the second part was the ambiguous sequence for dual targeting. After showing that the RNA-binding proteins RBP1a, RBP1b and RPS19 were dual-targeted to mitochondria and cloroplasts, sitedirected mutations were introduced in the targeting sequence of RBP1b. The importance of positive-charged amino acids for directing the protein to mitochondria was confirmed. Mutation of alanine at position 2, which is conserved in ambiguous sequences, was shown not to affect RBP1b dual targeting. Information for dual targeting was localized among the 17 first amino acids in the amino-terminal region. The signals for directing the protein to cloroplasts appeared distributed along the targeting sequence. While the amino-terminal half of the sequence was sufficient for RBP1b dual targeting, the sequence comprising the next 13 amino acids appeared to affect the efficiency of the transport. In these analyses, a quantitative method to measure the intensity of fluorescent signals of GFP had its efficacy demonstrated to be adopted for in vivo quantitative analysis of dual targeting to mitochondria and cloroplasts. In the third part, the focus was the translational mechanism enabling THI1 dual targeting to mitochondria and cloroplasts, in A. thaliana. It was hypothesized that an internal ribosomal entry site (IRES) was present in thi1 mRNA. However, a transient expression system could not be found that reproduced the literature data demonstrating THI1 dual targeting. In the tested systems the protein was addressed solely to cloroplasts, thus preventing the objective to be pursued.