Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2002Bitstream added on 2014-06-13T19:15:40Z : No. of bitstreams: 1 barbosa_fh_me_botfm.pdf: 692507 bytes, checksum: a7f91088d5074d8d040c054c5989981c (MD5) / O fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis (Pb) é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistêmica mais importante da América Latina. A espécie de tatu Dasypus novemcinctus mostrou ser um importante reservatório do fungo e o estudo de isolados destes animais será útil para uma melhor compreensão da ecologia e epidemiologia desta doença. O objetivo deste trabalho foi comparar a virulência e variabilidade genética de isolados de tatus e de pacientes para melhor compreender a importância do tatu na PCM. Os isolados animais foram obtidos da área endêmica de Botucatu, São Paulo, Brasil, com exata informação dos locais de coleta. Os isolados clínicos, exceto a cepa padrão Pb265, foram obtidos de pacientes residentes nos municípios de Pratânia, Manduri e Botucatu. A virulência foi avaliada no modelo experimental do hamster através da contagem de UFC (Unidades Formadoras de Colônias), histopatologia e dosagem de anticorpos específicos e a caracterização molecular por meio da técnica de RAPD e sequenciamento do DNA ribossômico. Todos isolados de tatus foram virulentos, disseminando-se para vários órgãos. A cepa Pb265, isolada de paciente, apresentou baixa virulência. A contagem de UFC nos diferentes órgãos permitiu uma classificação do fungo em 4 categorias: virulência muito alta, virulência alta, virulência intermediária e baixa virulência. A análise molecular mostrou grande diversidade genética entre os isolados, porém não houve separação entre os fungos isolados de pacientes e de tatu. Estes resultados indicam que tanto o homem quanto o tatu podem estar sendo infectados por patógenos com mesmo genótipo, provavelmente localizados em foco ambiental comum. Portanto, os tatus como reservatórios do P. brasiliensis na natureza, representam importantes elos na cadeia da doença... / Paracoccidioides brasiliensis is the etiologic agent of paracoccidioidomycosis (PCM), the most important systemic mycosis in Latin America. The armadillo Dasypus novemcinctus has been confirmed as the first natural reservoir of this fungus and its geographic distribution is similar to the distribution of human PCM. This work analysed the virulence profiles and genetic diversity of P. brasiliensis isolates from different armadillos and clinical isolates. The animal isolates were obtained from the Botucatu endemic area of PCM, with exact information of the collection sites. The clinical isolates, except Pb265, were obtained from patients that live in the same endemic area (Pratânia, Manduri and Botucatu county). Virulence was evaluated in an experimental hamster model by colony-forming units (CFU) and histopathological analysis in the testis, liver, spleen, lung and circulating specific antibodies measured by ELISA. Molecular characterisation was evaluated by RAPD methods and sequencing analyses of the internal transcribed spacer regions (ITS 1 and ITS 2) and 5.8 S ribosomal gene. All isolates from armadillos were virulent, with dissemination to many organs. The clinical isolate Pb 265 was less virulent. The isolates were classified into four categories according to number of CFU per gram of tissue: very high, high, intermediate and low virulence. Molecular analysis showed large genetic similarity between all isolates and did not separate armadillos from clinical isolates. This study confirms that armadillos harbor pathogenic genotypes of P. brasiliensis, probably the same ones that infect man. Thus, the armadillos are very important animals in the epidemiology this disease.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-15Bitstream added on 2014-06-13T18:50:11Z : No. of bitstreams: 1 bannwart_cf_me_botfm.pdf: 462065 bytes, checksum: 2e3988993f9db6f1ef7a8c8058e75e6a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A interleucina-15 (IL-15) é uma citocina pró-inflamatória produzida principalmente por monócitos e macrófagos em resposta a agentes infecciosos, desempenhando importante papel modulador na imunidade inata e adaptativa. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da IL-15 sobre a atividade fungicida, metabolismo oxidativo e a produção de citocinas por monócitos humanos, infectados in vitro com cepa virulenta de Paracoccidioides brasiliensis (Pb18). Monócitos de sangue periférico, obtidos de indivíduos saudáveis, foram préincubados na ausência ou presença de IL-15 (12,5, 25 e 50 ng/mL) por 24 h a 37oC e infectados com Pb18 na proporção de 50 monócitos para uma célula fúngica durante 4 h e 18 h. A atividade fungicida de monócitos foi determinada após 4 h pela recuperação de fungos viáveis por plaqueamento das co-culturas em meio BHI-ágar. O metabolismo oxidativo foi avaliado pela liberação de peróxido de hidrogênio (H2O2) e de ânion superóxido (O2 -) nas culturas desafiadas com Pb18 e estimuladas com phorbol myristate acetate (PMA) durante 60 mim. A produção de fator de necrose tumoral-alfa (TNF-a), IL-6, IL-10 e IL-15 foi determinada por ensaio imunoenzimático (ELISA) nos sobrenadantes das coculturas obtidos após 4 e 18 h de incubação. Os resultados mostraram que a préincubação de monócitos com IL-15 induziu aumento significativo na atividade fungicida contra Pb18 de maneira dose-dependente, sendo esse efeito neutralizado pela adição de anticorpo monoclonal anti-IL-15. O tratamento com IL- 15 não interferiu na capacidade de liberação de H2O2 e O2 - por monócitos desafiados com Pb18 sugerindo que a atividade fungicida estimulada por IL-15 ocorre por mecanismos independentes do metabolismo oxidativo. Monócitos infectados com o fungo, na ausência de IL-15, produziram níveis de TNF-a, IL-6 e IL-10... / Interleukin-15 (IL-15) is a pro-inflammatory cytokine especially produced by monocytes and macrophages against infectious agents and that play a pivotal role in teh innatte and adaptive immune response. The aim of this study was to analyze the effects of IL-15 on fungicidal activity, oxidative metabolism and cytokine production by human monocytes challenged in vitro with a virulente strain of Paracoccidioides brasiliensis (Pb18). Peripheral blood monocytes obtained from healthy individuals were pre-incubated for 24h with or without human recombinant IL-15 (12.5,25 and 50 ng/mL), and then challenged with Pb18 in a ratio of 50:1 monocytes:fungi. Fungicidal activity of monocytes against Pb18 was assessed by viable fungi recovery from 4 h co-cultures after plating in BHI-agar. Oxidative metabolism was evaluated by hydrogen peroxide (H2O2) and superoxide anion (O2 -) release in the monocyte cultures challenged by Pb18 and stimulated with phorbol myristate acetate (PMA) for 60 min. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-a), IL-6, IL-10 and IL-15 production by monocytes were determined in culture supernatants by enzyme immunoassay (ELISA). The results showed that IL-15 ehanced fungicidal activity against Pb18 in a dose-dependent pattern. This effect was abrogated by additon of anti-IL-15 monoclonal antibody to the co-cultures. No significant effect of IL-15 on H2O2 and O2 - release by monocytes was observed suggesting that the fungicidal activity was independent of oxidative metabolism activation. Monocytes infected with P. brasiliensis in the absence of IL-15, produced significantly higher levels of TNF-a, IL-6 and IL-10 after 18 h of coculture in comparison to experiments of 4h-incubation with the fungus. The pretreatment of monocytes with IL-15 induced significant higher levels of TNF-a, IL-10 and IL-15 production by these cells challenged with the fungus... (Complete abstract click eletronic address below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-25Bitstream added on 2014-06-13T20:31:21Z : No. of bitstreams: 1 jorge_kcp_me_botfm.pdf: 250753 bytes, checksum: 0f377f3d4364fb4849fce6d105cf7940 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A paracoccidioidomicose é uma das mais importantes micoses sistêmicas da América Latina e a resistência ao agente é fortemente dependente da resposta imune do hospedeiro. Devido à rica composição nutricional e suas propriedades medicinais o cogumelo comestível Agaricus blazei é amplamente utilizado na medicina tradicional. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi avaliar se a suplementação nutricional de camundongos infectados por P. brasiliensis, com o cogumelo A. blazei, contribui para a manutenção de seu estado nutricional e de sua competência imunológica. Para isso, camundongos BALB/c foram infectados por via intratraqueal com leveduras de Pb 18 e suplementados dieteticamente com o cogumelo acrescentado à ração comercial. Os animais foram sacrificados aos 7 ou 14 dias pós-infecção para avaliar o grau de infecção no pulmão, baço e fígado e do efeito do tratamento sobre a capacidade de resposta imune celular. Os animais infectados apresentaram perda de peso no início da infecção, com recuperação após duas semanas. Os animais infectados e suplementados com ração 15% tiveram maior perda de peso, bem como menor nível de recuperação em relação ao peso inicial. Os parâmetros bioquímicos indicam que as funções hepáticas e renais sofreram alterações decorrentes da infecção mas os efeitos da suplementação nutricional foram de pouca relevância. O tratamento provocou exacerbação da infecção na fase inicial (7 dias), acompanhada de intensa redução da atividade linfoproliferativa. A resistência dos animais parece restaurada aos 14 dias nos animais que receberam 5% de cogumelo na ração, observando-se redução de fungos viáveis nos pulmões, restauração da capacidade de resposta proliferativa dos esplenócitos, aumento nos níveis de TNF-a e redução de IL-4 nos pulmões e discreto aumento de IFN-g no baço... / Paracoccidioides is one of the main systemic mycosis in Latin America and the host resistance to the fungus Paracoccidioides brasiliensis, is strongly dependent on the immune responsiveness. Due to it rich nutritional composition and medicinal properties, the edible mushroom Agaricus blazei is widely used as traditional medicine. Then, our goal was to investigate whether the nutritional supplementation with A. blazei helps P. brasiliensis-infected mice to keep their nutritional status and immunocompetence. For this purpose, BALB/c mice were infected for intratracheal route with Pb 18 yeasts and fed with comercial chow supplemented with dried and powdered A. blazei fruiting bodies. Animals were evaluated at the 7th and 14th day on the infection levels, in lung, spleen and liver, and on cellular immunoresponsiveness. Infected mice showed weight loose in the beginning of the infection that was partially restored after 2 weeks. Infected animals, supplemented with 15% of A. blazei showed the higher weight loose, as well as lower restoring levels. Biochemical parameters indicate that the infection itself interfered in the liver and kidney functions but no relevant effect of nutritional supplementation was detected. The treatment induced infection exacerbation at the first week that was followed by intense decrease of lymphoproliferative activity of spleen cells. The resistance of mice against P. brasiliensis appears to be restored by the 14th day in those mice eating feed with 5% A. blazei. This view is supported by the observation that such animals have lower number of viable fungus inside the lungs than controls (group Pb), and also restored the lymphoproliferative activity. We also observed increased levels of TNF-a and decreased levels of IL-4 in the lungs and slight increase of INF-g in the spleen. Altogether, our results partially supported our initial hypothesis... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-20Bitstream added on 2014-06-13T20:12:20Z : No. of bitstreams: 1 tavian_eg_me_botfm.pdf: 871930 bytes, checksum: 342b3c01d67e8458e6f2f4a552e5764b (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A IL-15 é uma citocina próinflamatória produzida principalmente por monócitos e macrófagos em resposta a agentes infecciosos, desempenhando importante papel modulador na imunidade inata e adaptativa. No caso de infecções por microrganismos intracelulares como algumas bactérias, protozoários e fungos destaca-se o papel da IL-15 no mecanismo de ativação de monócitos/ macrófagos e neutrófilos, processo que representa um importante mecanismo de defesa já em períodos precoces da infecção durante o desenvolvimento da resposta imune inata. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da IL-15 sobre a atividade fungicida de neutrófilos humanos desafiados com cepa virulenta do P. brasiliensis (Pb 18). Adicionalmente, testamos se essa atividade seria mediada por produtos do metabolismo oxidativo como anion superóxido e H2O2 e se estaria associada a alterações nos níveis das citocinas IL-8 e TNF- alfa. Neutrófilos do sangue periférico de indivíduos saudáveis , foram incubados na ausência ou presença de IL-15 (12,5 a 250 ng/mL) por 18h a 370C em tensão de 5% de CO2, infectados com Pb 18 por 4h e avaliados quanto a atividade fungicida , produção de ânion superóxido, H2O2 e quantificação nos sobrenadantes das citocinas TNF-a e IL-8. A préincubação de neutrófilos com IL-15 induziu um aumento significativo na atividade fungicida dessas células de maneira dose dependente. Adicionalmente após a ativação, foi detectado um aumento na produção de 51 anion superóxido e H2O2 por essas células, sugerindo a participação desses metabólitos como moléculas efetoras da atividade fungicida. O desafio das células em presença de catalase, levou a uma diminuição significativa da atividade fungicida comprovando o papel da H2O2 nesse processo. No entanto, os níveis de... / Interleukin-15 is a cytokine produced by a wide range of different cell types, including macrophages in response to lipopolysaccharide or microbial infection. This cytokine may play a crucial role in the activation of phagocytic cells against pathogens, mainly during innate immune response. The effects of IL-15 on human polimorphonuclear leukocyte fungicidal activity against high virulent P. brasiliensis strain were investigated. Prétreatment with IL-15 for 18h, increased neutrophils fungicidal activity in a concentration dependent manner. In addition, exposure to IL-15 induced enhanced neutrophil oxidative burst evaluated by superóxide anion and H2O2 release. Catalase inhibits fungicidal activity confirming a role for H2O2 in fungus Killing. In contrast, IL-8 and TNF-alfa levels were not affected by IL-15 suggesting that its effects were not mediated by these cytokines. Together, the results showed that IL-15 is a potent stimulant of antifungal activities of human neutrophils, at least in part, by a mechanism dependent on oxidative metabolism.

Submitted by Amanda Ribeiro dos Santos null (amandashalar@hotmail.com) on 2018-04-09T20:47:32Z No. of bitstreams: 1 2018-04-09_Dissertação_AmandaRibeiro-VersãoFinal.pdf: 5828961 bytes, checksum: d332ff1b02f6b315b3c46c6eb3e0fe4c (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Pizzani null (luciana@btu.unesp.br) on 2018-04-10T18:58:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 santos_ar_me_bot.pdf: 5828961 bytes, checksum: d332ff1b02f6b315b3c46c6eb3e0fe4c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-10T18:58:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 santos_ar_me_bot.pdf: 5828961 bytes, checksum: d332ff1b02f6b315b3c46c6eb3e0fe4c (MD5) Previous issue date: 2018-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada por fungos do gênero Paracoccidioides; suas principais formas clinicas são aguda/subaguda, crônica (FC) e residual. A maioria dos pacientes com a FC da doença, mesmo após tratamento eficaz, apresenta sequelas, principalmente fibrose pulmonar (FP) e enfisema. Os problemas sociais, econômicos e psicológicos desencadeados pela FP são subestimados. Apesar da fibrogênese na PCM ser reconhecida como um processo precoce, seus mecanismos não são totalmente conhecidos. No presente estudo, determinamos o perfil proteômico sérico de pacientes com PCM-FC com diferentes desfechos de FP. Vinte e nove pacientes com PCM pulmonar foram acompanhados periodicamente e as amostras de soro sanguíneo foram coletadas em quatro momentos: antes do tratamento (M0), cura clínica (M1), cura sorológica (M2) e cura aparente (M3). O grupo controle foi constituído por amostras de quinze indivíduos fumantes, pareados com idade e sexo dos pacientes avaliados. Ao final do tratamento (M3), os pacientes foram submetidos à avaliação de tomografia computadorizada e dois grupos de pacientes foram formados com base nos resultados de PF: PF menor (n = 17) e PF maior (n = 12). As proteínas de elevada abundância no soro foram removidas e, em seguida, submetidas à análise proteômica shotgun através do sistema nanoACQUITY UPLC-Xevo QTof MS. A identificação e quantificação das proteínas foram realizadas usando o software PLGS Expression E. Análise de enriquecimento e análise de rede de interação proteína-proteína (PPI) foram realizadas usando o software String. Antes do tratamento, os pacientes com PF menor, em comparação aos controles, apresentavam 91 proteínas diferencialmente expressas (60 sub-reguladas 31 superreguladas). Soro de pacientes com maior PF apresentaram 70 proteínas diferencialmente expressas (66 sub-reguladas 4 reguladas). A maioria dessas proteínas estavam envolvidas na regulação do processo celular e resposta inflamatória. Nas condições ensaiadas, o estudo permitiu identificar as proteínas APOH, A2M, GC e SERPINA1 como alvos envolvidos nos mecanismos moleculares da fibrogênse pulmonar na paracoccidioidomicose. Foi observado, ainda, que o momento de cura clínica apresentou maior atividade pró-fibrótica durante o seguimento dos pacientes. Além disso, foram identificadas 20 proteínas candidatas a biomarcadores no prognóstico da fibrose pulmonar, conforme segue: família das hemoglobulinas (HBB, HBD, HBG2, HBE1, HBG1, HBA1), ENO3, A2M, APOH, GC, IGHG-1, -2 e 3, IGLC1, -2 e -3, HP, SERPINA1, LRG1 e PZP. Nossos achados fornecem novos alvos para estudos futuros envolvendo a FP na PCM, assim como biomarcadores séricos em potencial. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is systemic mycosis caused by fungi of the genus Paracoccidioides; its main clinical forms are acute / subacute, chronic (CF) and residual. Most FC-PCM patients, even after effective treatment, present sequelae, mainly pulmonary fibrosis (PF) and emphysema. The social, economic and psychological problems triggered by PF are underestimated. Although fibrogenesis in PCM is recognized as an early process, its mechanisms are not fully known. In the present study, we aimed to determine the serum proteomic profile of patients with FC-PCM with different (PF) outcomes. Twenty-nine patients with pulmonary PCM patients were followed up periodically, and blood serum samples were collected in four moments: before treatment (M0), clinical cure (M1), serological cure (M2), and apparent cure (M3). For control group (n=15), serum samples of sex and age-matched smokers were also collected. At the end of treatment (M3), the patients were submitted to CT Scan evaluation and two groups of patients were formed based on PF outcomes: minor PF (n=17) and major PF (n=12). High-abundance proteins were removed from serum and submitted to shotgun proteomic assay using a nanoACQUITY UPLC-Xevo QTof MS system. The identification and quantification of proteins were performed using PLGS Expression E software. Enrichment analysis and protein-protein interaction (PPI) network analysis were performed using String software. Before treatment, patients with minor PF, in comparison to controls, showed 91 differentially expressed proteins (60 down-regulated and 31 up-regulated). Serum of patients with major PF exhibited 70 differentially expressed proteins (66 down-regulated and 4 up-regulated). Most of these proteins are involved in the regulation of cellular process and inflammatory response. The results allowed the identification of APOH, A2M, GC and SERPINA1 as targets involved in the molecular mechanisms of pulmonary fibrogenesis in paracoccidioidomycosis. It was also observed that the clinical cure presented greater pro-fibrotic activity during the follow-up of the patients. In addition, 20 candidate biomarkers were identified in the prognosis of pulmonary fibrosis, as follows: hemoglobin family (HBB, HBD, HBG2, HBE1, HBG1, HBA1), ENO3, A2M, APOH, GC, IGHG-1, -2 and 3, IGLC1, -2 and -3, HP, SERPINA1, LRG1 and PZP. Our findings provide new targets for further studies involving mechanisms of PF in PCM, as well as for promising potential biomarkers. / CNPq 470221/2014-3

Orientador: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Banca: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Banca: Iracilda Zeppone Carlos / Banca: Gil Benard / Banca: Andréa de Faria Fernandes Belone / Resumo: Células gigantes multinucleadas (CGM) são células características, presentes em lesões granulomatosas, induzidas por agentes infecciosos e, sua formação pode ser modulada por citocinas produzidas por células da resposta imune. No presente trabalho avaliou-se o efeito modulador de citocinas pró-inflamatórias (IFN-γ e TNF-α) e anti-inflamatórias (IL-10 e TGF-β1) na formação de CGM in vitro, a partir de monócitos humanos, estimulados com antígenos de Paracoccidioides brasiliensis (AgPb) e sobre a atividade fungicida dessas células desafiadas com a cepa Pb18 de P.brasiliensis. Monócitos do sangue periférico de indivíduos saudáveis foram cultivados na ausência de estímulo (controle), com AgPb (100ug/mL) ou com associações de AgPb e GM-CSF (100 U/ml) com as citocinas: IFN-γ (300UI/mL), IL-10 (50U/mL), TGF- β1 (250pg/mL) ou TNF-α (50U/mL). A formação de CGM foi avaliada após três dias de cultivo, estabelecendo-se o índice de fusão (IF) e a percentagem de CGM após fixação e coloração das células com May-Grunwald-Giemsa. Além disso, a atividade fungicida dessas células foi avaliada após 4 h de co-cultivo das CGM com 4 x 104 células leveduriformes viáveis da cepa Pb18 de P. brasiliensis, por plaqueamento das co-culturas em meio BHI-ágar e determinação da recuperação de fungos viáveis. O método estatístico empregado para comparação dos resultados foi análise de variância, com nível de significância de 5%. Os resultados mostraram que a incubação de monócitos com AgPb+GM-CSF+IFN-γ induziu IF significativamente mais elevados em relação a todas as demais culturas: controle, apenas estimulados com AgPb ou AgPb adicionado das demais citocinas. A adição de TNF- α+AgPb+GM-CSF não resultou em IF maiores do que os obtidos na cultura estimulada apenas com o AgPb, enquanto as citocinas IL-10 e TGF-β1 apresentaram efeito supressor... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Multinucleated giant cells (MGC) are characteristics cells present in granulomatous lesions induced by infectious agents and also may be modulated by cytokines produced by cells of the immune response. The present study evaluated the modulatory effect of interferon-gamma (IFN-γ) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) pro-inflammatory cytokines, and interleukin-10 (IL-10) and transforming growth factor beta (TGF-β1) anti-inflammatory cytokines on in vitro formation of MGC derived from human monocytes, stimulated with Paracoccidioides brasiliensis antigen (PbAg) and on fungicidal activity of these cells challenged with the Pb18 strain of P.brasiliensis. Peripheral blood monocytes obtained from healthy individuals were cultured for three days without stimulus (control) or with PbAg (100 ug/mL) or with association of PbAg and granulocyte macrophage colony stimulator factor (GMCSF (100 U/mL) with the following cytokines: IFN-γ (300 UI/mL), IL-10 (50 UI/mL), TGF-β1 (250 pg/mL) or TNF-α (50 UI/mL). The generation of MGC was evaluated by fusion index (FI) and the percentage of MGC formation after cell fixing and May-Grumwald-Giensa staining. Fungicidal activity of monocytederived MGC was evaluated 4h after co-culture of MGC with 4 x 104 viable yeast cells of Pb18 strain, by plating the cultures in BHI-agar and determination of viable fungi recovery. The statistical method employed for the comparison of the results was analysis of variance with the significance set at p< 0.05. The results showed that the incubation of monocytes with PbAg+GM-CSF+IFN-γ induced FI significantly higher than those observed in all the other cultures, such as control cultures, cultures stimulated with PbAg only or cultures stimulated with PbAg associated with the other cytokines. Stimulation with PbAg+TNF+GM-CSF did not result in FI higher than those obtained in the culture stimulated with PbAg only... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Banca: Wafa Hanna Koury Cabrera / Banca: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Resumo: A IL-15 é uma citocina próinflamatória produzida principalmente por monócitos e macrófagos em resposta a agentes infecciosos, desempenhando importante papel modulador na imunidade inata e adaptativa. No caso de infecções por microrganismos intracelulares como algumas bactérias, protozoários e fungos destaca-se o papel da IL-15 no mecanismo de ativação de monócitos/ macrófagos e neutrófilos, processo que representa um importante mecanismo de defesa já em períodos precoces da infecção durante o desenvolvimento da resposta imune inata. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da IL-15 sobre a atividade fungicida de neutrófilos humanos desafiados com cepa virulenta do P. brasiliensis (Pb 18). Adicionalmente, testamos se essa atividade seria mediada por produtos do metabolismo oxidativo como anion superóxido e H2O2 e se estaria associada a alterações nos níveis das citocinas IL-8 e TNF- alfa. Neutrófilos do sangue periférico de indivíduos saudáveis , foram incubados na ausência ou presença de IL-15 (12,5 a 250 ng/mL) por 18h a 370C em tensão de 5% de CO2, infectados com Pb 18 por 4h e avaliados quanto a atividade fungicida , produção de ânion superóxido, H2O2 e quantificação nos sobrenadantes das citocinas TNF-a e IL-8. A préincubação de neutrófilos com IL-15 induziu um aumento significativo na atividade fungicida dessas células de maneira dose dependente. Adicionalmente após a ativação, foi detectado um aumento na produção de 51 anion superóxido e H2O2 por essas células, sugerindo a participação desses metabólitos como moléculas efetoras da atividade fungicida. O desafio das células em presença de catalase, levou a uma diminuição significativa da atividade fungicida comprovando o papel da H2O2 nesse processo. No entanto, os níveis de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Interleukin-15 is a cytokine produced by a wide range of different cell types, including macrophages in response to lipopolysaccharide or microbial infection. This cytokine may play a crucial role in the activation of phagocytic cells against pathogens, mainly during innate immune response. The effects of IL-15 on human polimorphonuclear leukocyte fungicidal activity against high virulent P. brasiliensis strain were investigated. Prétreatment with IL-15 for 18h, increased neutrophils fungicidal activity in a concentration dependent manner. In addition, exposure to IL-15 induced enhanced neutrophil oxidative burst evaluated by superóxide anion and H2O2 release. Catalase inhibits fungicidal activity confirming a role for H2O2 in fungus Killing. In contrast, IL-8 and TNF-alfa levels were not affected by IL-15 suggesting that its effects were not mediated by these cytokines. Together, the results showed that IL-15 is a potent stimulant of antifungal activities of human neutrophils, at least in part, by a mechanism dependent on oxidative metabolism. / Doutor

Orientador: Eduardo Bagagli / Resumo: O fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis (Pb) é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistêmica mais importante da América Latina. A espécie de tatu Dasypus novemcinctus mostrou ser um importante reservatório do fungo e o estudo de isolados destes animais será útil para uma melhor compreensão da ecologia e epidemiologia desta doença. O objetivo deste trabalho foi comparar a virulência e variabilidade genética de isolados de tatus e de pacientes para melhor compreender a importância do tatu na PCM. Os isolados animais foram obtidos da área endêmica de Botucatu, São Paulo, Brasil, com exata informação dos locais de coleta. Os isolados clínicos, exceto a cepa padrão Pb265, foram obtidos de pacientes residentes nos municípios de Pratânia, Manduri e Botucatu. A virulência foi avaliada no modelo experimental do hamster através da contagem de UFC (Unidades Formadoras de Colônias), histopatologia e dosagem de anticorpos específicos e a caracterização molecular por meio da técnica de RAPD e sequenciamento do DNA ribossômico. Todos isolados de tatus foram virulentos, disseminando-se para vários órgãos. A cepa Pb265, isolada de paciente, apresentou baixa virulência. A contagem de UFC nos diferentes órgãos permitiu uma classificação do fungo em 4 categorias: virulência muito alta, virulência alta, virulência intermediária e baixa virulência. A análise molecular mostrou grande diversidade genética entre os isolados, porém não houve separação entre os fungos isolados de pacientes e de tatu. Estes resultados indicam que tanto o homem quanto o tatu podem estar sendo infectados por patógenos com mesmo genótipo, provavelmente localizados em foco ambiental comum. Portanto, os tatus como reservatórios do P. brasiliensis na natureza, representam importantes elos na cadeia da doença... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Paracoccidioides brasiliensis is the etiologic agent of paracoccidioidomycosis (PCM), the most important systemic mycosis in Latin America. The armadillo Dasypus novemcinctus has been confirmed as the first natural reservoir of this fungus and its geographic distribution is similar to the distribution of human PCM. This work analysed the virulence profiles and genetic diversity of P. brasiliensis isolates from different armadillos and clinical isolates. The animal isolates were obtained from the Botucatu endemic area of PCM, with exact information of the collection sites. The clinical isolates, except Pb265, were obtained from patients that live in the same endemic area (Pratânia, Manduri and Botucatu county). Virulence was evaluated in an experimental hamster model by colony-forming units (CFU) and histopathological analysis in the testis, liver, spleen, lung and circulating specific antibodies measured by ELISA. Molecular characterisation was evaluated by RAPD methods and sequencing analyses of the internal transcribed spacer regions (ITS 1 and ITS 2) and 5.8 S ribosomal gene. All isolates from armadillos were virulent, with dissemination to many organs. The clinical isolate Pb 265 was less virulent. The isolates were classified into four categories according to number of CFU per gram of tissue: very high, high, intermediate and low virulence. Molecular analysis showed large genetic similarity between all isolates and did not separate armadillos from clinical isolates. This study confirms that armadillos harbor pathogenic genotypes of P. brasiliensis, probably the same ones that infect man. Thus, the armadillos are very important animals in the epidemiology this disease. / Mestre

Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Gil Benardi / Banca: Cleni Mara Marzocchi Machado / Resumo: A capacidade de Paracoccidioides brasiliensis, agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), de causar doença com manifestações clínicas variadas, depende de seus fatores de virulência, em particular daqueles envolvidos na interação celular. Neste estudo pretendeu-se isolar e caracterizar adesina(s) de P. brasiliensis ligante(s) de fibronectina relacionadas à interação do fungo com células epiteliais de origem pulmonar, comparando amostras de P. brasiliensis, antes (18a) e depois (18b) da passagem em animal, posteriormente cultivadas em meio de Fava Netto e em meio sólido (ágar base) e líquido (BHI) contendo 5% de sangue de carneiro. Os extratos 18a e 18b obtidos dos diferentes meios apresentaram proteínas variando de 106 a 12 kDa. Os extratos da amostra 18a e 18b cultivados em meios sólido e líquido acrescidos de sangue demonstraram maior expressão de algumas proteínas, quando comparado às amostras 18a e 18b cultivadas apenas em meio de Fava Netto. Aparentemente, o uso de meios de cultura acrescidos de sangue é semelhante ao verificado após a passagem em animal. As proteínas com massas moleculares de 54 kDa e pI de 5,6; 58 kDa e pI de 5,9 e 60 kDa com pI de 6,3 foram caracterizadas como adesinas ligantes de fibronectina. Uma delas, a proteína de 54 kDa foi purificada por cromatografia de afinidade e eluída por eletroeluição. O sobrenadante contendo a proteína purificada foi avaliado por eletroforese bidimensional, confirmando a presença da proteína de 54 kDa e pI de 5,6 e seu papel como adesina. Os extratos cell-free dos isolados 113, 339, 2663-R3, 2681, PB01, 1934 de P. brasiliensis... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The capacity of Paracoccidioides brasiliensis, the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM), to provoke illnesses with great variety of clinical manifestations depends on its virulence factors, particularly on those involved in the cellular interaction. The present study was designed to isolate and characterize the adhesin fibronectin-binding related to the capacity of this fungus to adhere to the host by comparing P. brasiliensis samples, taken before (18a) and after (18b) animal inoculation and cultured on Fava Netto’s medium and on blood base agar solid medium and liquid (BHI) medium with 5% sheep blood. The 18a and 18b extracts, independent of the medium, presented proteins with the molecular weights of 106 and 12 kDa. Extracts from Pb18a and 18b cultured in blood agar solid and liquid (BHI) medium showed higher levels of protein expression than that from samples cultured on Fava Netto. Apparently, the use of the sheep blood in the medium is similar to the animal passage. Ligand affinity binding assays showed that proteins of 54 kDa, pI 5.6; 58 kDa and pI of 5.9 and 60 kDa and pI de 6.3 were evident in all P. brasiliensis cell-free extracts, and all had properties of adhesin fibronectin-binding. A fibronectin-binding protein of 54 kDa was purified by affinity chromatography and by electro elution. The protein purified was evaluated by isoelectric focusing, confirming the presence of protein of 54 kDa and pI of 5.6 and its role as an adhesin. The cell-free extracts from 113, 339, 2663-R3, 2681, PB01, 1934 P. brasiliensis isolates, also showed the expression of 54 kDa protein, and it was more evident in 113 and 339 isolates. Our experiments... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença granulomatosa sistêmica, causada pelo Paracoccidioides brasiliensis, um fungo imperfeito e termodimórfico. Embora o contágio ocorra principalmente pela via aérea, as vias transcutânea e mucosa não devem ser desconsideradas, devido à possibilidade de invasão através de pele ou mucosas. No presente estudo, a detecção molecular de P. brasiliensis por Nested- PCR foi realizada em fragmentos de biópsias de lesões cutâneo-mucosas de pacientes com PCM ativa e comparada a outras técnicas utilizadas como rotina no diagnóstico dessa micose. Para tanto, amostras de 29 pacientes atendidos no Serviço de Dermatologia, da Faculdade de Medicina de Botucatu/UNESP, foram coletadas no período de abril/2004 a abril/2007. Na análise histopatológica observou-se granulomas compactos bem organizados, algumas vezes ao lado de áreas contendo granulomas frouxos mal definidos. Tal técnica foi positiva em todas as amostras avaliadas, com presença de grande quantidade de células fúngicas em 65,5% dos casos, algumas com multi-brotamentos. Para as análises sorológicas, na técnica de ELISA, 74,1% dos casos apresentaram títulos de 1/12800, 11,1% apresentaram 1/3200, 3,7% apresentaram 1/800 e 11,1% foram negativos. Já para imunodifusão (ID), 3,5% apresentaram título de 1/512, 55,1% apresentaram títulos de 1/32, 3,5% apresentaram 1/16, 3,5% apresentaram 1/8, 10,3% apresentaram 1/4, 6,9% apresentaram 1/2 e 17,2% foram negativos. Foi observado um aumento nos níveis de TNF- , nos pacientes na forma grave, produzido por monócitos não estimulados, em comparação à forma leve e moderada, e ao controle. A produção desta citocina por monócitos estimulados com LPS também se mostrou gradativamente maior quanto maior a gravidade dos pacientes. Além disso, na análise do seguimento dos pacientes nota-se uma diminuição significativa... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença granulomatosa sistêmica, causada pelo Paracoccidioides brasiliensis, fungo imperfeito e termodimórfico (Franco et al., 1987, 1989). Com distribuição endêmica no Brasil e outros países da América Latina (Restrepo et al., 1973; Restrepo, 1985; Wanke & Londero, 1994), esse agente etiológico apresenta-se sob a forma de levedura em tecidos do hospedeiro ou quando cultivado à temperatura de 35-37°C, e sob a forma de micélio à temperatura ambiente (4-28°C) (Restrepo, 1985; San- Blas & San-Blas, 1985), As lesões primárias da PCM ocorrem com mais freqüência nos pulmões, dando origem a infecção subclínica, que pode evoluir para cura ou tornar-se latente na presença de resposta imune eficiente, ou ainda, disseminar para outros órgãos, por via hematogênica ou linfática, causando doença grave (Giraldo et al., 1976; Londero & Severo, 1981; Restrepo, 1988; Montenegro & Franco, 1994; Bethlem et al., 1999). A PCM tem como apresentações clínicas as formas aguda-subaguda e crônica (Franco et al., 1987). A primeira, também chamada juvenil, ocorre predominantemente em crianças, adolescentes e adultos jovens. Geralmente se desenvolve a partir de lesão primária não detectada, que se dissemina rapidamente pelas vias linfática e hematogênica para órgãos linfóides e hematopoiéticos, constituindo quadro infeccioso grave (Mendes et al., 1988). A forma crônica da doença é mais freqüente e se desenvolve a partir do complexo primário ou do foco quiescente (reinfecção endógena). Esta geralmente afeta adultos do sexo masculino, com idade superior a 30 anos. Apresenta quadro clínico de duração prolongada, normalmente acima de seis meses, onde se pode dizer que o comprometimento pulmonar é constantemente observado e o tegumentar (cutâneo e/ou mucoso) é freqüente (Marques et al., 1994)... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Silvio Alencar Marques / Coorientador: Eduardo Bagagli / Banca: Gil Benard / Banca: Flávia Villaça Morais / Banca: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Banca: Sandra de Moraes Gimenes Bosco / Doutor