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Papel dos receptores Toll-Like na atividade dos neutrófilos humanos desafiados com a cepa de alta virulência do Paracoccidioides brasiliensis /

Valério, Michele Janegitz Acorci. January 2009 (has links)
Resumo: Na paracoccidioidomicose, os estudos sobre os mecanismos de defesa do hospedeiro destacam o papel das células fagocitárias que participam ativamente dos mecanismos efetores diretos contra o fungo e da modulação da resposta inflamatória. Dentre essas células, nos últimos anos, os estudos têm se voltado para os neutrófilos, que exercem um importante papel efetor e modulador principalmente durante os estágios iniciais da infecção. As funções dessas células, incluindo as antimicrobicidas, podem ser reguladas por citocinas pró e anti-inflamatórias. Apesar dos mecanismos celulares e moleculares desse processo não estarem completamente entendidos, trabalhos nos últimos anos têm mostrado de forma bastante consistente o envolvimento dos "Toll Like Receptors" (TLRs). Neste contexto, os objetivos do presente trabalho foram: 1- Avaliar a expressão de TLR2 e TLR4 por neutrófilos humanos pré-ativados com GM-CSF, IL-15, TNF-a ou IFN-g e desafiados com cepa virulenta de Paracoccidioides brasiliensis cepa 18 (Pb18). 2- Avaliar a participação desses receptores na atividade fungicida, produção de H2O2 e das citocinas: IL-6, IL-8 e TNF-a e IL-10 por neutrófilos humanos pré-ativados com GM-CSF, IL-15, TNF-a, IFN-g e desafiados com Pb18. Nos ensaios referentes ao primeiro objetivo, as células foram tratadas por 18 horas com cada uma das citocinas ou LPS, posteriormente desafiadas com Pb 18 por 4 horas e avaliadas quanto a expressão de TLR2 e TLR4 por citometria de fluxo. Nos referentes ao segundo objetivo, as células foram ativadas com os mesmos estímulos, submetidas ao bloqueio de TLR2 e TLR4, através da incubação das células com anticorpos monoclonais específicos, desafiadas com Pb18 por 4 horas e analisadas quanto a atividade fungicida, produção de H2O2 e das citocinas IL-6, IL-8 e TNF-a e IL-10, por Elisa. Os resultados... (REsumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In paracoccidioidomycosis, phagocytic cells appear to provide one of the major lines of host defense. In this context, in last years, various studies have focused on the role of neutrophils that are involved in primary response to the fungus. Neutrophil functions are regulated by pro and anti-inflammatory cytokines. The molecular and cellular mechanisms involved in this process are not fully understood, but there are strong evidences about the involvement of "Toll Like Receptors" (TLRs). In this context, we aimed to evaluate TLR2 and TLR4 expression on human neutrophils primed with the cytokines GM-CSF, IL- 15, TNF-a or IFN-g and challenged with a virulent strain of Paracoccidioides brasiliensis (Pb18). Moreover, we asked if these receptors have a role on fungicidal activity, H2O2 and IL-6, IL-8, TNF-a and IL-10 production, by primed and challenged cells. In first assays, neutrophils were incubated with each of cytokines or LPS by 18 h, challenged with Pb18 by 4 h and evaluated by TLR2 and TLR4 expression by flow cytometry. In other assays, cells were incubated with each of cytokines or LPS by 18h, submitted to TLR2 and TLR4 blocking by specific monoclonal antibodies, challenged with Pb18 for 4 h and evaluated for fungicidal activity, H2O2 and IL-6, IL-8, TNF-a and IL-10 production, by ELISA. All cytokines increased TLR2 and TLR4 expression. Pb18 increased TLR2 expression inducing an additional effect to that of cytokines. On the contrary, it inhibited TLR4 expression. All cytokines increased neutrophils fungicidal activity, but this process was not associated with TLR2 or TLR4 expression. All cytokines and Pb18 increased H2O2 production, but in the same manner to fungicidal activity, the process was not associated to TLR2 or TLR4 expression. Neutrophils activation with GM-CSF and TNF-a resulted in a significative increase on IL-8... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Coorientador: Luciene Alarcão Dias Melicio / Banca: José Maurício Sforci / Banca: Sueli Aparecida Calvi / Banca: Gil Bernardi / Banca: Wafa Hanna Koury Cabrera / Doutor
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Identificação e purificação de prostaglandinas e leucotrienos produzidos por Paracoccidioides brasiliensis /

Biondo, Guilherme Augusto. January 2013 (has links)
Orientador: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Coorientador: Ana Paula Bordon-Graciani / Banca: Silvio Luiz de Oliveira / Banca: Carlos Artério Sorgi / Banca: Sandra de Moraes Gimenes Bosco / Banca: Dulce Helena Jardim Constantino / Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis. O estabelecimento da paracoccidioidomicose-infecção ou paracoccidioidomicose-doença depende das interações parasita-hospedeiro que podem resultar em uma resposta imune mais ou menos eficaz por parte deste último. Embora vários dos mecanismos decorrentes dessa interação já estejam descritos, estudos sobre a participação de outros fatores potenciais podem ampliar sobremaneira o nosso entendimento sobre a imunopatogênese da PCM. Nesse sentido, os eicosanóides como as prostaglandinas (PGs) e leucotrienos (LTs) devem ser avaliados. Em trabalhos anteriores detectamos que o fungo induz a produção de PGs e LTs por monócitos humanos que, de uma forma autócrina, suprimem ou aumentam respectivamente, as atividades antifúngicas dessas células. No entanto, os estudos têm mostrado que além de induzir a produção de eicosanóides, os próprios fungos podem produzir esses mediadores, revelando um mecanismo de virulência que tem potencialmente grandes implicações para o entendimento dos mecanismos das infecções fúngicas. Baseados nesses estudos detectamos que o P. brasiliensis produz tanto PGs como LTs, usando fontes endógenas e exógenas de ácido araquidônico, e que ambos são importantes para a manutenção da viabilidade do fungo. Adicionalmente, os resultados sugeriram que o fungo utiliza as vias metabólicas da ciclooxigenase (COX) para a produção de PGs e da lipoxigenase (5-LO) para LTs. No presente trabalho, aprofundamos esses estudos objetivando avaliar se o fungo produz outras classes de eicosanóides, além da PGE2 e LTB4, se as PGs e LTs liberados pelo P. brasiliensis podem ser considerados como PGE2 e LTB4 autênticos, isto é semelhantes aos detectados para os mamíferos, assim como estabelecer de uma forma definitiva se a COX e a 5-LO são as vias metabólicas utilizadas ... / Abstract: Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis. The establishment of paracoccidioidomycosis-infection or the evolution to paracoccidioidomycosis-disease in its more or less severe forms, primarily depends on complex host-parasite interaction, in which immune response mechanisms play an essential role. While many of these mechanisms have been elucidated, studies on the participation of other potential factors can greatly expand our understanding of PCM immunopathogenesis. Accordingly, eicosanoids such as prostaglandins (PGs) and leukotrienes (LTs) should be evaluated. In previous studies we found that the fungus induces the production of prostaglandins and leukotrienes by human monocytes that in an autocrine way suppress and increase, respectively, the antifungal activities of these cells. However, studies have shown that in addition to inducing the production of eicosanoids, fungi themselves can produce these mediators, showing a mechanism for virulence that has potentially important implications for understanding the mechanisms of fungal pathogenicity. Based on these studies, we found that P. brasiliensis produces both PGs and LTs, using exogenous and endogenous sources of arachidonic acid and that both are important for fungus viability. Additionally, the results suggested that the fungus uses cyclooxygenase (COX) and lipoxygenase (5-LO) metabolic pathways for PGs and LTs production, respectively. Here, we profound these studies evaluating whether PGs and LTs released by P. brasiliensis can be considered as authentic LTB4 and PGE2, i.e. similar to those detected for mammals. We also asked whether the fungus, in addition to PGE2 and LTB4, produces other classes of eicosanoids. Finally, we intended to definitively determine whether COX and 5-LO are the metabolic pathways used for this production. We found that fungus PGE2 and LTB4 ... / Doutor
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Efeito da suplementação nutricional com cogumelos A. blazei sobre a infecção experimental murina aguda por Paracoccidioides brasiliensis /

Jorge, Kattya Christina Paes. January 2010 (has links)
Resumo: A paracoccidioidomicose é uma das mais importantes micoses sistêmicas da América Latina e a resistência ao agente é fortemente dependente da resposta imune do hospedeiro. Devido à rica composição nutricional e suas propriedades medicinais o cogumelo comestível Agaricus blazei é amplamente utilizado na medicina tradicional. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi avaliar se a suplementação nutricional de camundongos infectados por P. brasiliensis, com o cogumelo A. blazei, contribui para a manutenção de seu estado nutricional e de sua competência imunológica. Para isso, camundongos BALB/c foram infectados por via intratraqueal com leveduras de Pb 18 e suplementados dieteticamente com o cogumelo acrescentado à ração comercial. Os animais foram sacrificados aos 7 ou 14 dias pós-infecção para avaliar o grau de infecção no pulmão, baço e fígado e do efeito do tratamento sobre a capacidade de resposta imune celular. Os animais infectados apresentaram perda de peso no início da infecção, com recuperação após duas semanas. Os animais infectados e suplementados com ração 15% tiveram maior perda de peso, bem como menor nível de recuperação em relação ao peso inicial. Os parâmetros bioquímicos indicam que as funções hepáticas e renais sofreram alterações decorrentes da infecção mas os efeitos da suplementação nutricional foram de pouca relevância. O tratamento provocou exacerbação da infecção na fase inicial (7 dias), acompanhada de intensa redução da atividade linfoproliferativa. A resistência dos animais parece restaurada aos 14 dias nos animais que receberam 5% de cogumelo na ração, observando-se redução de fungos viáveis nos pulmões, restauração da capacidade de resposta proliferativa dos esplenócitos, aumento nos níveis de TNF-a e redução de IL-4 nos pulmões e discreto aumento de IFN-g no baço... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Paracoccidioides is one of the main systemic mycosis in Latin America and the host resistance to the fungus Paracoccidioides brasiliensis, is strongly dependent on the immune responsiveness. Due to it rich nutritional composition and medicinal properties, the edible mushroom Agaricus blazei is widely used as traditional medicine. Then, our goal was to investigate whether the nutritional supplementation with A. blazei helps P. brasiliensis-infected mice to keep their nutritional status and immunocompetence. For this purpose, BALB/c mice were infected for intratracheal route with Pb 18 yeasts and fed with comercial chow supplemented with dried and powdered A. blazei fruiting bodies. Animals were evaluated at the 7th and 14th day on the infection levels, in lung, spleen and liver, and on cellular immunoresponsiveness. Infected mice showed weight loose in the beginning of the infection that was partially restored after 2 weeks. Infected animals, supplemented with 15% of A. blazei showed the higher weight loose, as well as lower restoring levels. Biochemical parameters indicate that the infection itself interfered in the liver and kidney functions but no relevant effect of nutritional supplementation was detected. The treatment induced infection exacerbation at the first week that was followed by intense decrease of lymphoproliferative activity of spleen cells. The resistance of mice against P. brasiliensis appears to be restored by the 14th day in those mice eating feed with 5% A. blazei. This view is supported by the observation that such animals have lower number of viable fungus inside the lungs than controls (group Pb), and also restored the lymphoproliferative activity. We also observed increased levels of TNF-a and decreased levels of IL-4 in the lungs and slight increase of INF-g in the spleen. Altogether, our results partially supported our initial hypothesis... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Ramon Kaneno / Coorientador: Angela Maria V. C. Soares / Banca: Paulo Câmara Marques Pereira / Banca: Andrea Vanessa / Mestre
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Método para reconstrução in silico de redes metabólicas de fungos : um estudo de caso para o Paracoccidioides lutzii

Silva, Waldeyr Mendes Cordeiro da 25 July 2014 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Ciência da Computação, 2014. / Submitted by Larissa Stefane Vieira Rodrigues (larissarodrigues@bce.unb.br) on 2014-12-02T16:33:58Z No. of bitstreams: 1 2014_WaldeyrMendesCordeiroDaSilva.pdf: 7282235 bytes, checksum: 1cac8233b834aef263b3415e216ce1b1 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-12-02T17:40:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_WaldeyrMendesCordeiroDaSilva.pdf: 7282235 bytes, checksum: 1cac8233b834aef263b3415e216ce1b1 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-02T17:40:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_WaldeyrMendesCordeiroDaSilva.pdf: 7282235 bytes, checksum: 1cac8233b834aef263b3415e216ce1b1 (MD5) / Os fungos produzem uma variedade de metabólitos com aplicações na indústria e na medicina, ao mesmo tempo que podem ser patógenos humanos. O Paracoccidioides lutzii é um fungo dimórfico causador da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica autóctone da América Latina, onde cerca de 10 milhões de pessoas estão infectadas, inclusive no Brasil, o qual contribui com cerca de 80% dos casos, afetando principalmente indivíduos em áreas rurais. Neste trabalho, foi criado um método para identificar e organizar vias de metabolismo em fungos, com ênfase no metabolismo secundário. Para validar o método, foi realizado um estudo de caso para o fungo P. lutzii, cujos resultados obtidos identificaram 2.087 reações enzimáticas, 1.437 enzimas, 1.464 compostos e 335 vias metabólicas. As vias de metabolismo secundário representaram cerca de 4,5% do total de vias identificadas no P. lutzii. O método criado pode ser aplicado à reconstrução in silico de redes metabólicas de outros fungos. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Fungi produce various metabolites with applications in industry and medicine, furthermore, can be human pathogens. Paracoccidioides lutzii is a dimorphic fungus that causes paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis in Latin America affecting approximately 10 million people, including Brazil, which contributes about 80% of cases, usually affecting individuals in rural areas. In this work, we create a method to identify and organize metabolic pathways in fungi, with emphasis on secondary metabolism. To validate this method, a case study was performed for the fungus P. lutzii. The results identified 2,087 enzymatic reactions, 1,437 enzymes, 1,464 compounds and 335 metabolic pathways. The secondary metabolism pathways represented around 4.5% of pathways identified in the P. lutzii. The method created can be applied to the in silico reconstruction of metabolic networks of other fungi.
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Remodelamento metabólico de Paracoccidioides lutzii durante a privação de cobre determinado por análises proteômicas

Gonçalves, Laura Maria Barbosa 06 February 2015 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2015. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-04-06T16:31:05Z No. of bitstreams: 1 2015_LauraMariaBarbosaGonçalves.pdf: 3250806 bytes, checksum: 090e9b400e068bd5c145dc1ddc1e6f71 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-04-29T18:09:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_LauraMariaBarbosaGonçalves.pdf: 3250806 bytes, checksum: 090e9b400e068bd5c145dc1ddc1e6f71 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-29T18:09:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_LauraMariaBarbosaGonçalves.pdf: 3250806 bytes, checksum: 090e9b400e068bd5c145dc1ddc1e6f71 (MD5) / Paracoccidioides spp. é um fungo termodimórfico, agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM). Durante o processo de infecção Paracoccidioides spp. encontra ambientes com diferentes disponibilidades de micronutrientes essenciais como cobre, por exemplo. A obtenção de micronutrientes no hospedeiro é mecanismo crucial de estratégia adaptativa deste patógeno. Neste sentido, a identificação de proteínas relacionadas com captação/homeostase de metais traços, durante a infecção é importante para se obter um melhor entendimento dos mecanismos que compõem a resposta adaptativa do fungo. No presente estudo a técnica de eletroforese bidimensional (2-DE) e Nano-ESI-UPLC-MSE foi utilizada como ferramenta proteômica a fim de investigar o perfil de expressão de proteínas da forma de levedura de P. lutzii após 24 e 48h de privação de cobre. Foram identificadas 68 proteínas/isoformas por eletroforese 2-DE, sendo 42 com expressão aumentada e 26 com expressão diminuída em condições de depleção de cobre. Através do Nano-ESI-UPLC-MSE um total de 366 proteínas foram identificadas, sendo 232 induzidas e 134 reprimidas. As proteínas de P. lutzii que se apresentaram diferencialmente reguladas estão envolvidas em processos celulares que incluem metabolismo, energia, síntese de proteínas, defesa e virulência. As proteínas envolvidas no metabolismo de aminoácidos e que apresentaram expressão aumentada, são aquelas relacionadas à degradação de aminoácidos. Estas proteínas provavelmente foram induzidas para proporcionar precursores ao ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). O aumento da expressão de enzimas da via glicolítica também foi observado. Isto provavelmente ocorreu como forma de gerar ATP e intermediários metabólicos necessários para a manutenção do fungo sob condições de privação de cobre. Os dados gerados evidenciaram ainda uma indução em enzimas da via glicolítica, ciclo do TCA, via das pentoses fosfato, ciclo do metilcitrato e metabolismo dos lipídeos. Em condições de privação de cobre o metabolismo aeróbio é favorecido, o que provavelmente justifica o aumento da expressão de enzimas destas vias. Em conclusão, os dados do presente estudo indicam que a remodelação metabólica observada em condições de privação de cobre possivelmente é um mecanismo de sobrevivência do patógeno no ambiente hostil do hospedeiro. / Paracoccidioides spp. is a termodimorphic fungus, etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM). During the infection process, Paracoccidioides spp. faces environments with different availability of essential micronutrients such as copper, for example. The micronutrients obtainment in the host is a crucial mechanism of adaptive strategy for this host. Hence, the identification of proteins related to uptake/homeostasis of trace metals during infection is important for a better understanding of the mechanisms that makeup the fungus adaptive response. In the present study, the bidimensional electrophoresis (2-DE) and Nano-ESI-UPLC-MSE were used as proteomic tools in order to investigate the protein expression profile of P. lutzii in yeast form after 24 and 48h of copper deprivation. 68 proteins/isoforms were identified by 2-D analysis, which 42 were upregulated and 26 down regulated in copper depletion conditions. Through Nano-ESI-UPLC-MSE technique, 366 proteins were identified, 232 of them were induced and 134 repressed. P. lutzii proteins differentially regulated are involved in cellular processes including metabolism, energy, protein synthesis, defense and virulence. Proteins involved in the amino acid metabolism and showed an increased expression are related to amino acid degradation. These proteins were probably induced to provide precursors for tricarboxylic acid cycle (TAC). The increased expression of glycolytic pathway enzymes was observed. This probably happened as a way to generate ATP and metabolic intermediaries necessary for up keeping the fungus under copper deprivation conditions. The generated data pointed the induction of glycolytic pathway, tricarboxylic acid pathway, pentose phosphate pathway, methyl citrate pathway and lipid metabolism enzymes. The copper deprivation conditions favors the aerobic metabolism, which probably explains the increased expression of enzymes from the cited pathways. In conclusion, the presenting data indicate that the metabolic remodeling observed under copper deprivation conditions is possibly a survival mechanism of the pathogen under the host hostile environment.
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Análise proteômica e transcricional de Paracoccidioides em condições que mimetizam a infecção

Castro, Kelly Pacheco de 20 December 2012 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-02-19T16:44:30Z No. of bitstreams: 1 2012_KellyPachecoCastro.pdf: 6686042 bytes, checksum: 8f72ba02f2bbdb1b7be575c47cce7792 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2013-02-26T15:15:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_KellyPachecoCastro.pdf: 6686042 bytes, checksum: 8f72ba02f2bbdb1b7be575c47cce7792 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-02-26T15:15:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_KellyPachecoCastro.pdf: 6686042 bytes, checksum: 8f72ba02f2bbdb1b7be575c47cce7792 (MD5) / O fungo Paracoccidioides é um patógeno humano com ampla distribuição na América Latina. A infecção se inicia por inalação de conídios e ou propágulos da forma miceliana que ao atingirem o pulmão do hospedeiro se diferenciam na fase leveduriforme. Embora o perfil de expressão gênica em Paracoccidioides venha sendo estudado, pouco se conhece sobre o padrão de expressão de genes desta espécie durante o processo infeccioso. Durante a infecção, patógenos regulam o metabolismo em resposta a diferentes tipos de estresse e quantidades variadas de nutrientes disponíveis no hospedeiro, presumivelmente permitindo a sua adaptação e sobrevivência. Os íons metálicos são elementos essenciais para a manutenção de importantes vias metabólicas, e por esse motivo, a capacidade de adquiri-los pelos patógenos, a partir de fontes disponíveis no organismo hospedeiro, é considerada um fator de virulência. O zinco é considerado um íon metálico essencial para todos os organismos, por ser requerido para transcrição, tradução, replicação, resistência ao estresse oxidativo e virulência. Transportadores para este íons são altamente expressos em condições de infecção por Paracoccidioides. O presente trabalho descreve a análise de genes e proteínas diferencialmente expressos em células leveduriformes de Paracoccidioides em condições que mimetizam a infecção. Foi realizada a comparação do perfil proteômico de Paracoccidioides durante a privação de zinco e na disponibilidade desse metal com o objetivo de se descrever os mecanismos utilizados pelo fungo para sobreviver no ambiente com baixa disponibilidade de zinco, mimetizando a condição encontrada pelo patógeno durante a infecção. Adicionalmente, foi realizada a análise transcricional de Paracoccidioides recuperado de animais infectados. Os dados revelaram que proteínas relacionadas com resposta ao estresse, metabolismo de aminoácidos, gliconeogênese e ciclo do metilcitrato foram regulados durante a privação de zinco. Os transcritos induzidos durante a infecção no pulmão foram aqueles predominantemente relacionados com metabolismo de lipídios, ácidos graxos e isoprenóides, metabolismo de aminoácidos, resposta ao estresse e virulência e metabolismo de carboidratos. A expressão diferencial dos genes e proteínas identificados foi confirmada por ensaios de qRT-PCR. Os dados gerados podem facilitar estudos funcionais de novos genes e proteínas os quais podem ser importantes para estratégias de sobrevivência e adaptação do Paracoccidioides no hospedeiro. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides is a fungal human pathogen with a wide distribution in Latin America. The fungus causes infection through host inhalation of airborne propagules of the mycelial phase of the organism. These particles reach the lungs and differ in the yeast phase. Although gene expression in Paracoccidioides had been studied, little is known about the genome sequences expressed by this species during the infection process. During infection, pathogens regulate the metabolism in response to different types of stress and varying amounts of nutrients available in the host, presumably allowing its adaptation and survival. Metal ions are essential elements for the maintenance of important metabolic pathways, and therefore, the ability to acquire them by pathogens from sources available in the host organism, is considered a virulence factor. Zinc is considered a metal ion essential for all organisms, being required for transcription, translation, replication, resistance to oxidative stress and virulence. Here we describe the analysis of genes and proteins differentially expressed in yeast cells of Paracoccidioides under conditions mimicking of infection. It was performed a comparison of the proteomic profile of Paracoccidioides during zinc deprivation and in the availability of the metal in order to describe the mechanisms used by the fungus to survive in the environment with low vailability of zinc, mimicking the condition encountered by the pathogen during infection. Farther, was performed transcriptional analysis of Paracoccidioides recovered from lung of infected animals. The data revealed that proteins related to stress response, amino acid metabolism, gluconeogenesis and methylcitrate cycle were regulated during deprivation of zinc. The transcripts induced during infection in the lung were predominantly those related to lipid metabolism, fatty acid and isoprenoid, amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and stress response and virulence. The differential expression of genes and proteins identified was confirmed by qRT-PCR assays. The data generated can facilitate functional studies of novel genes and proteins which may be important for survival strategies and adaptation of Paracoccidioides in the host.
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Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Paracoccidioides brasiliensis : caracterização do gene/cDNA e análise funcional da proteína recombinante

Barbosa, Mônica Santiago January 2007 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-10-16T19:31:17Z No. of bitstreams: 1 Tese_Monica Santiago Barbosa.pdf: 382811 bytes, checksum: 4328a0b06b613d225acef72a46b938f6 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2009-10-20T15:42:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_Monica Santiago Barbosa.pdf: 382811 bytes, checksum: 4328a0b06b613d225acef72a46b938f6 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-10-20T15:42:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Monica Santiago Barbosa.pdf: 382811 bytes, checksum: 4328a0b06b613d225acef72a46b938f6 (MD5) Previous issue date: 2007 / Paracoccidioides brasiliensis é um importante patógeno humano que causa a paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica com ampla distribuição na América Latina. A adesão e a invasão de células são eventos essenciais envolvidos na infecção e disseminação do patógeno. Além disso, patógenos utilizam suas moléculas de superfície para se ligar a componentes da matriz extracelular para estabelecer a infecção. Uma proteína antigênica de P. brasiliensis foi isolada de gel de eletroforese bidimensional de proteínas totais do fungo e caracterizada. Peptídeos foram obtidos da proteína de 36 kDa e pI 6.8 e mostraram homologia com gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH: EC 1.2.1.12) de diversos organismos. O cDNA completo e o gene que codificam para PbGAPDH foram obtidos e ambos contém uma ORF que codifica para uma proteína com 338 aminoácidos que apresenta todos os peptídeos caracterizados na PbGAPDH nativa. O gene Pbgapdh contém 5 exons interrompidos por 4 introns. Análises realizadas com a PbGAPDH deduzida sugerem sua utilidade em prover relações filogenéticas, como também evidenciaram a correlação entre a filogenia e as posições dos introns nos genes cognatos. A expressão de Pbgapdh foi analisada e uma única espécie de mRNA de 2.0 Kb, preferencialmente expressa na fase leveduriforme de P. brasiliensis foi detectada em concordância com os altos níveis de expressão da proteína. A proteína recombinante GAPDH foi utilizada para produção de anticorpo policlonal em coelho. Por microscopia imunoeletrônica e análises por Western blot, foi detectada a presença da GAPDH, na parede celular de leveduras de P. brasiliensis e no citoplasma. A GAPDH recombinante foi capaz de se ligar a fibronectina, laminina e colágeno do tipo I. Uma observação importante, é que tanto o tratamento de P. brasiliensis com anticorpo anti-GAPDH, quanto de pneumócitos tratados com a GAPDH recombinante, promoveram a inibição da aderência e internalização de P. brasiliensis à células cultivadas in vitro (pneumócitos). Essas observações indicam que a GAPDH possivelmente contribui para a adesão do microrganismo aos tecidos do hospedeiro e para a disseminação da infecção. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis, an important human pathogen causing paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis with broad distribution in Latin America. Adhesion to and invasion of host cells are essential steps involved in the infection and dissemination of pathogens. Furthermore, pathogens use their surface molecules to bind to host extracellular matrix components to establish infection. An adhesin of P. brasiliensis was isolated from gel after two dimensional electrophoresis and characterized. Endoproteinase Lys-C-digest peptides of the purified protein, which presented a molecular mass of 36 kDa and pI 6.8, were subjected to sequence analysis of their amino acids, that revealed strong homology to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH: EC 1.2.1.12) from several sources. The complete cDNA and gene encoding PbGAPDH were obtained and both contained an open reading frame predicted to encode a 338 amino acid protein that presented all the peptides characterized in the native PbGAPDH. The Pbgapdh gene contained 5 exons interrupted by 4 introns. Analysis performed with the deduced PbGAPDH suggested its usefulness in providing phylogenetic relatedness, as well as evidenced the correlation between the phylogeny provided by the deduced proteins and introns positions in the cognate genes. The expression of Pbgapdh was analyzed and a single species of mRNA, of 2.0 Kb, preferentially expressed in the yeast parasitic phase of P. brasiliensis, was detected in agreement to the high levels of the GAPDH expression in the yeast cells of P. brasiliensis. The purified recombinant GAPDH was used to produce policlonal antibody in rabbit. By immunoelectron microscopy and Western blot analysis, GAPDH was detected in the cell wall and the cytoplasm of the yeast phase of P. brasiliensis. The recombinant GAPDH was found to bind to fibronectin, laminin, and type I collagen in ligand far-Western blot assays. Of special note, the treatment of P. brasiliensis yeast cells with anti-GAPDH polyclonal antibody and the incubation of pneumocytes with the recombinant protein promoted inhibition of adherence and internalization of P. brasiliensis to those in vitro cultured cells. These observations indicate that GAPDH could be contribute to the adhesion of the microorganism to host tissues and to the dissemination of infection.
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Caracterização molecular e funcional dos genes ras1 e ras2 do fungo dimórfico e patogênico Paracoccidioides Brasiliensis

Matos, Larissa Fernandes January 2007 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by mariana castro (nanacastro0107@hotmail.com) on 2009-12-16T16:50:35Z No. of bitstreams: 1 2007_LarissaFernandes.PDF: 9893771 bytes, checksum: 6e9d59dc179f263127c47b316b470fc9 (MD5) / Approved for entry into archive by Joanita Pereira(joanita) on 2010-01-06T16:35:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_LarissaFernandes.PDF: 9893771 bytes, checksum: 6e9d59dc179f263127c47b316b470fc9 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-06T16:35:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_LarissaFernandes.PDF: 9893771 bytes, checksum: 6e9d59dc179f263127c47b316b470fc9 (MD5) Previous issue date: 2007 / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termo-dimórfico que causa uma micose sistêmica de alta incidência na América Latina. Devido sua participação no controle de morfogênese, diferenciação e virulência em patógenos, decidiu-se caracterizar os genes ras em P. brasiliensis. Foram identificados ras1 e ras2 que codificam para duas proteínas diferentes com alta identidade. O padrão transcricional de ras também foi investigado por RT-PCR durante a transição micélio para levedura (M→Y), choque térmico a 42ºC e após internalização de leveduras em macrófagos murinos. Ambos os genes foram regulados negativamente em leveduras internalizadas em macrófagos e ras1 foi modulado negativamente a 42ºC. Entretanto, os genes ras não apresentaram variação transcricional durante a transição M→Y. O fato de que as proteínas Ras são localizadas na membrana através de farnesilação, permitiu a análise in silico dos genes que codificam para as subunidades das preniltransferases (farnesiltransferase e geranilgeraniltransferase I): ram1, ram2 e cdc43. P. brasiliensis apresenta em seu genoma todos os genes necessários para maquinaria de prenilação. Um inibidor de farnesiltransferase foi utilizado para investigar a importância desse processo no crescimento vegetativo e transição dimórfica. O bloqueio da farnesilação interferiu com o crescimento vegetativo de leveduras e estimulou a produção de tubos germinativos mesmo a 37ºC. Durante a transição Y→M, o inibidor aumentou a filamentação de maneira dosedependente, indicando que o bloqueio da farnesilação favorece a forma miceliana de P. brasiliensis. Os resultados sugerem que os genes ras devem ter um papel no dimorfismo, resposta a choque térmico e na interação patógeno-hospedeiro. Uma estratégia para estudar a função de ras1 em P. brasiliensis também foi desenhada através de interferência no RNA. Cassetes de silenciamento com ras1 senso e antisenso foram construídos para futura investigação detalhada do papel dos genes ras na patobiologia deste fungo. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis is a thermo-dimorphic fungus that causes a human systemic mycosis with high incidence in Latin America. Due to their participation in the control of pathogen morphogenesis, differentiation and virulence the characterization of ras genes in P. brasiliensis was done. It was identified ras1 and ras2 coding for two different proteins with high identity. The ras transcriptional pattern was investigated by RT-PCR during mycelium-to-yeast (M→Y) transition, heat shock at 42ºC and after internalization of yeast cells by murine macrophages. Both genes were down regulated inside macrophages and ras1, at 42ºC. In contrast, the ras genes did not show any transcriptional variation during the M→Y transition. The fact that Ras proteins are attached to the membrane via farnesylation prompted the search on Pb gene database for the genes coding the subunits of the prenyltransferases (farnesyltransferase and geranilgeraniltransferase I): ram1, ram2 and cdc43. P. brasiliensis has all genes necessary to the prenylation machinary. Also, a farnesyltransferase inhibitor was used to investigate the importance that process to vegetative growth and dimorphic transition. Farnesylation inhibition interfered with vegetative growth of yeast cells and stimulated germinative tube production even at 37ºC. During Y→M transition the inhibitor increased filamentation in a dose-dependent manner, indicating that impairement of farnesylation favors the mycelium form of P. brasiliensis. The results suggest that ras genes might have a role in dimorphism, heat shock response and in host-pathogen interaction. A strategy to study the ras1 function in P. brasiliensis via RNA interference was designed. Cassettes with ras1 sense and antisense were constructed for further investigate in detail the possible roles of ras genes in this fungal pathogen.
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Perfil transcricional do fungo Paracoccidioides na interação com célula pulmonares humanas (A549) : análise comparativa entre P. brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (Pb01)

Oliveira, Adriane Alves de 15 March 2010 (has links)
Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)-Universidade de Brasília, Brasília, 2010. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-16T23:09:11Z No. of bitstreams: 1 2010_AdrieneAlvesdeOliveira.pdf: 669257 bytes, checksum: caccf186a24fa4e80ddf59c3ade9eccc (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-16T23:10:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_AdrieneAlvesdeOliveira.pdf: 669257 bytes, checksum: caccf186a24fa4e80ddf59c3ade9eccc (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-16T23:10:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_AdrieneAlvesdeOliveira.pdf: 669257 bytes, checksum: caccf186a24fa4e80ddf59c3ade9eccc (MD5) / Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica humana causada por espécies do fungo termo-dimórfico Paracoccidioides. Até há pouco tempo, apenas a espécie P. brasiliensis era reconhecida dentro deste gênero, mas recentemente foi identificada a espécie P. lutzii, filogeneticamente distante da anterior. A infecção é adquirida provavelmente pela inalação de propágulos transportados pelo ar derivados da forma miceliana do fungo e que se alojam principalmente nos pulmões. Vários estudos sugerem que o parasitismo intracelular do fungo seja importante na colonização do hospedeiro e na disseminação da doença. Para avaliar essa hipótese foi analisado comparativamente o perfil transcricional de Paracoccidioides - P. brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (Pb01) recuperados do interior de pneumócitos humanos em cultura (A549) durante uma cinética de interação. Para tanto foi utilizada a técnica de microarranjos de cDNA no caso de P. lutzii e PCR em tempo real para os representantes das duas espécies. Os genes diferencialmente expressos identificados neste trabalho estão relacionados principalmente à limitação de glicose, resposta ao estresse oxidativo, remodelagem da parede celular e adesão aos tecidos do hospedeiro. Os resultados demonstram que de uma forma semelhante ao que ocorre no interior de macrófagos murinos peritoniais, Paracoccidioides apresenta uma plasticidade transcricional para sobreviver no microambiente de pneumócitos humanos, que de forma geral é semelhante entre as espécies analisadas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a human systemic mycosis caused by the thermaldimorphic fungus Paracoccidioides. Until recently, P. brasiliensis was recognized as the only species inside this genus, nevertheless last year P. lutzii was acknowledged as new specie phylogenetically distant from the former. The infection is acquired by the inhalation of propagules derived from the mycelium form of the fungus and establishes itself mainly in the lungs. Various studies suggest that the intracellular parasitism of this fungus is relevant in the host’s colonization and the dissemination of the disease. In order to evaluate this hypothesis a comparative transcriptional profile between P. brasiliensis (Pb18) and P. lutzii (Pb01) obtained from the interior of human pneumocytes linage (A549), during the interaction kinetics, was analysed. For this objective, cDNA microarray was used for P. lutzii (Pb01) and Real Time PCR for the representatives of both species of Paracoccidioides (Pb18 and Pb01). The genes identified by this study as differentially expressed were related mostly to glucose limitation, oxidative stress response, cell wall remodelling and adhesion to host’s tissues. Our results demonstrated that, in a similar manner in which occurs inside peritoneal murine macrophages, Paracoccidioides displays a transcriptional plasticity to survive in the microenvironment of the human pneumocytes, which is alike between both species analysed.
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Paracoccidioidomicose e neoplasia

Rodrigues, Gustavo da Silva January 2007 (has links)
Pacientes com paracoccidioidomicose (PCM) podem apresentar comorbidades de natureza não infecciosa, tais como a doença de Hodgkin, leucemias e carcinomas. Neste sentido, o presente trabalho tem como objetivo avaliar clinicamente a associação entre paracoccidioidomicose e neoplasia. Foi realizado um estudo retrospectivo durante um período de 35 anos (1972- 2007), das fichas clínicas de 802 pacientes com diagnóstico da micose, provenientes dos arquivos do Laboratório de Micologia, Santa Casa - Complexo Hospitalar, Porto Alegre. Vinte e quatro casos (3,18%) apresentaram concomitantemente algum tipo de neoplasia. Foram estudados aspectos demográficos, hábitos de vida, manifestações clínicas, radiológicas e laboratoriais, evolução e tratamento realizado em ambas as doenças. O diagnóstico da paracoccidioidomicose foi feito através do exame micológico direto, histopatologia e/ou soromicologia; todos os casos de neoplasia tiveram confirmação histopatológica e/ou citopatológica. Todos os pacientes eram do sexo masculino, com idade entre 40 e 65 anos, com uma mediana de 53 anos. Manifestações relacionadas ao aparelho respiratório foram as principais queixas quando do diagnóstico da micose. Predominou o envolvimento pulmonar seguido por tegumentar e ganglionar. Em 12 pacientes o diagnóstico da PCM precedeu o da neoplasia, em 10 foram simultâneos, e em dois a neoplasia foi identificada anteriormente à micose. Houve concomitância de lesões entre as duas doenças em 66,6% dos casos. Os carcinomas representaram 95,8% das neoplasias, dos quais o de pulmão foi o mais freqüente, com 15 casos (62,5%); um paciente tinha doença de Hodgkin. A diferença entre a freqüência de carcinoma brônquico na população estudada e na população sem a micose foi estatisticamente significante (p = 0,0015). A terapêutica da PCM consistiu, isoladamente, de sulfas (29,2%), sulfametoxazol-trimetoprim (20,8%), cetoconazol (12,5%), itraconazol (12,5%) e anfotericina B (4,2%); houve combinação entre drogas em dois casos e substituição em uma oportunidade. A conduta antineoplásica mais empregada foi cirúrgica (11/24) seguida da radioterápica (9/24), quimioterápica (3/24) de um não se obteve relato. Cura micológica foi observada em doze casos, em nove a evolução é desconhecida e três pacientes foram ao óbito. Em conjunto, os resultados mostraram que existe uma associação entre a paracoccidioidomicose e neoplasia. / Patients with paracoccidioidomycosis may have comorbidities of non-infectious, such as Hodgkin's disease, leukaemia and cancers. Thus, the present study aims to evaluate the clinical association between the paracoccidioidomycosis and neoplasia. A retrospective study was conducted over a period of 35 years (1972-2007) through the revision of chips clinics from 802 patients with clinical diagnosis of mycosis, from the archives of Mycology Laboratory, Santa Casa - Complex Hospital, Porto Alegre. Twenty-four cases (3.18%) had some form of cancer concurrently. They were studied demographics, habits of life, leading clinical, radiological and laboratory, as well as developments in treatment done in both diseases. Paracoccidioidomycosis was diagnosed based on direct mycological exam, serologic and/or histopathologic evidence. All cases of cancer were confirmed by histopathologic and/or cytopathologic examination. All patients were male, aged between 40 and 65 years, with a median of 53 years. Disturbs related to the respiratory system were the main complaints. Lung involvement was the most predominant, followed by the tegumentary and lymphatic. In 12 patients the diagnosis of paracoccidioidomycosis preceded that of neoplasia, 10 were simultaneous, and in two to neoplasia was identified prior to mycosis. There was a concomitance between both of the illnesses in 66,6% of the cases. The cancers accounted for 95.8% of the cancers of the lung, which was the most frequent, with 15 cases (62.5%); one patient had Hodgkin's disease. The difference between the frequency of bronchial carcinoma in the studied population and the population without mycosis was statistically significant (p = 0.0015). The paracoccidioidomycosis therapy consisted alone of sulfas (29,2%), sulfamethoxazoletrimethoprim (20,8%), ketoconazole (12,5%), itraconazole (12,5%) and amphotericin B (4,2%); there was a drug combination in both cases and a substitution in a given opportunity as well. The most used antineoplastic procedure was the surgical one (11/24), followed by radiotherapy (9/24) and chemotherapy (3/24). The mycological cure was noticed in twelve cases; in nine of the cases the evolution is unknown and three patients died. Together, the results showed that there is an association between paracoccidioidomycosis and cancer.

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