Submitted by Luiz Felipe Barbosa (luiz.fbabreu2@ufpe.br) on 2015-03-13T15:15:04Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO_FINAL.pdf: 4132669 bytes, checksum: 2de35f385a67c750328123bf94990fd8 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T15:15:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO_FINAL.pdf: 4132669 bytes, checksum: 2de35f385a67c750328123bf94990fd8 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / CAPES / A infecção persistente por tipos oncogênicos de Papilomavírus Humano (HPV) é necessária para o desenvolvimento do câncer cervical e para uma grande porcentagem de outros tumores anogenitais e orofaríngeos. Desde que essas doenças têm como agente etiológico um vírus, a vacinação profilática representa uma intervenção barata, efetiva e logisticamente simples. A proteína L1 do capsídeo viral é capaz de arranjar-se em partículas morfologicamente e antigenicamente semelhantes ao vírus denominadas Virus-like particles (VLPs), abordagem esta utilizada pelas vacinas anti-HPV atualmente licenciadas. Apesar da eficácia comprovada, a implementação dessas vacinas é um desafio devido à desconhecida duração da proteção por elas conferida, o elevado custo atrelado e a possibilidade de outros tipos virais carcinogênicos emergirem. O sistema de expressão baseado em Pichia pastoris tem sido explorado para produção de VLPs de HPV, mas os níveis de expressão relatados têm sucesso variado e todos os trabalhos empregam vetores comerciais baseados no promotor induzível do gene AOX1 (PAOX1). No presente trabalho, avaliamos a produção extracelular da proteína L1 de HPV-16 em P. pastoris, mediante utilização dos sistemas baseados no promotor PAOX1 e no promotor constitutivo do gene PGK1 (PPGK1). Linhagens de P. pastoris recombinantes foram geradas mediante eletroporação com os cassetes de expressão pPICZAα-L1H16 e pPGK 3-L1H16. Clones contendo múltiplas cópias de cada cassete foram selecionados por ensaios de resistência à ZeocinaTM e triados quantos aos níveis de expressão mediante Colony blotting e Dot blotting, utilizando anticorpo anti-L1 (CamVir®). Embora tenha se observado aparente degradação e glicosilação da proteína L1, os resultados obtidos por Western blotting a partir das induções em frasco revelaram que o sistema baseado no promotor PPGK1 apresentou maiores níveis de expressão do que àquele baseado no promotor PAOX1. A tentativa de purificação da proteína L1 com resina de afinidade se mostrou insatisfatória, possivelmente devido à problemas conformacionais na cauda de poli-histidina. Esses resultados representam análises preliminares passíveis de otimização. Os eventos de glicosilação precisam ser confirmados por análises mais detalhadas. Metodologias alternativas para purificação das VLPs estão sendo avaliadas, bem como estratégias de cultivo para minimizar a proteólise de L1. O presente trabalho demonstra que o sistema não comercial baseado no promotor constitutivo do gene PGK1 de P. pastoris representa uma atrativa plataforma para produção de VLPs de HPV com fins vacinais.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:52:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4543_1.pdf: 1690700 bytes, checksum: da5dc337c7de1a577ea7ee10118fbca6 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Cerca de 490.000 novos casos de câncer cervical têm ocorrido entre mulheres do mundo todo a cada ano. No Brasil, a estimativa de incidência aponta o câncer de colo do útero como o terceiro mais comum entre as mulheres no ano de 2006, com estimativa de 19.260 novos casos em todo o país. Segundo o INCA (2006), no estado de Pernambuco, estima-se que ocorram 22,16 novos casos para cada 100.000 mulheres. O papilomavirus humano (HPV) é o principal agente envolvido em lesões benignas e malignas, sendo caracterizados como baixo-risco e alto-risco, respectivamente. Os HPVs de alto-risco, como os sorotipos 16 e 18, são capazes de produzir as oncoproteínas E6 e E7 que alteraram as funções das proteínas regulatórias do ciclo, como as proteínas p53 e retinoblastoma, respectivamente. Devido à dificuldade de cultivo do HPV em cultura de tecidos, a clonagem destes genes representa uma possibilidade de estudos mais avançados. Entre os novos sistemas de expressão de proteínas heterólogas, pode-se destacar Pichia pastoris que é facilmente manipulada, e possui a capacidade de expressar a proteína de interesse em altos níveis e também realizar modificações pós-transducionais. Assim, o objetivo do presente trabalho é clonar o gene E6 do HPV 16 em P. pastoris. Para tanto, o gene E6 do HPV 16 (477 bp) foi clonado diretamente no vetor pPICZA (3.300 bp), amplificado em Escherichia coli DH5α e linearizado com SacI para ser integrado ao genoma da levedura por recombinação. Todos os clones obtidos foram submetidos à PCR com primers específicos, linearizações com enzimas e seqüenciamento. O resultado obtido com o PCR da P. pastoris transformante apresentou tamanho correspondente ao gene E6. A seqüência gênica dos nucleotídeos apresentou um score de 93% quando alinhado com a seqüência gênica da E6 do HPV 16 depositada nos bancos de dados gênicos. Os clones obtidos permitirão a expressão desta oncoproteína por P. pastoris, e desta forma, o desenvolvimento de vacinas terapêuticas ou medicamentos sítio-específico capazes de erradicar a doença

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:04:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3741_1.pdf: 1581853 bytes, checksum: 0025fe881a3b0e2eed7c457909ca63d6 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Os papilomavírus são conhecidos por causarem lesões tumorais, geralmente benignas, em tecidos epiteliais de diversos organismos, que podem sob condições adequadas progredirem para o câncer. O papilomavírus bovino (BPV) tem sido amplamente caracterizado tanto por ser considerado um modelo experimental para o estudo do papilomavírus humano (HPV), quanto por sua grande importância na bovinocultura. Estudos para o combate da infecção mostram que vacinas baseadas em virus-like particles (VLPs), formadas a partir das proteínas capsidiais L1/L2 ou L1, induzem à produção de anticorpos neutralizantes conferindo proteção contra o mesmo tipo viral. A levedura Pichia pastoris é um sistema de expressão eficiente e de baixo custo para produção de altos níveis de proteínas, além de apresentar vantagens em relação a outros sistemas. Neste trabalho foi avaliado a possibilidade do uso do sistema de expressão heteróloga baseado em células da levedura P. pastoris para a produção da proteína L1 do capsídeo do papilomavírus bovino tipo 1. O gene L1 foi amplificado por PCR a partir do genoma completo de BPV 1, clonado no vetor pGEM-T Easy e subclonado sob a regulação do promotor AOX1 e em fase de leitura com uma cauda de poli-histidina presentes no vetor pPICZA. As células da levedura foram transformadas com a construção pPICZAL1B1 e os recombinantes resistentes a zeocina foram selecionados para expressão da proteína L1. Estes foram cultivados em frascos contendo meio com glicerol como fonte de carbono e após 48 horas o meio foi trocado por outro contendo 0,5% de metanol. A cada 24 horas foi adicionado metanol para uma concentração final de 2%, até completar 96 horas. Os resultados obtidos mostraram que os recombinantes P. pastoris transformados com o cassete de expressão pPICZAL1B1, após indução com metanol, foram capazes de expressar o gene L1 e de produzir a proteína L1 de BPV 1. Tais transformantes permitirão o estabelecimento de um sistema de expressão da proteína L1 e conseqüente produção de VLPs como primeiro passo para implementação de uma estratégia vacinal contra infecções por papilomavírus

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:04:44Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6206_1.pdf: 2700428 bytes, checksum: 581fcbaef95d2557078dfd0fe0d933dc (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Os papilomavírus humanos infectam o tecido epitelial mucoso ou cutâneo provocando o aparecimento de verrugas ou papilomas benignos que podem regredir ou evoluir para lesões malignas. A infecção por HPV é a doença sexualmente transmissível mais freqüente do mundo e está relacionada com a etiologia de certos tipos de cânceres, principalmente os anogenitais. O câncer cervical é o segundo mais freqüente entre as mulheres do mundo e o HPV-16 é o tipo mais encontrado, presente em 60% dos casos. Estudos para o combate da infecção mostram que as vacinas baseadas em Virus-Like Particles (VLPs), formadas a partir das proteínas capsidiais L1/L2 ou L1, induzem à produção de anticorpos neutralizantes que conferem proteção contra o mesmo tipo viral. A imunidade humoral é direcionada contra os epítopos conformacionais da proteína L1 que compõe 90% da estrutura capsidial. As VLPs são obtidas através da expressão dos genes capsidiais em sistema de expressão heterólogo e processos de purificação. A levedura Pichia pastoris é um sistema de expressão, eficiente e de baixo custo para a produção de altos níveis de proteínas, além de apresentar vantagens em relação a outros sistemas. Neste trabalho foi proposta a expressão do gene L1 de HPV-16 em células da levedura P. pastoris, como base de uma estratégia vacinal para o controle do câncer de colo de útero. O gene L1 de HPV-16 foi clonado em vetor de expressão pPICZA e a construção pPICZL1H16 foi integrada no genoma de Pichia. A transcrição do gene L1 foi confirmada por meio de RT-PCR e a expressão da proteína, por imunodetecção em Dot Blot. A obtenção dos clones de P.pastoris que expressam a proteína L1 de HPV-16, permitirá o desenvolvimento de mais uma estratégia vacinal baseada em VLPs

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:13:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2933_1.pdf: 6870658 bytes, checksum: acbcf9d7334f444ca5bd229930ce06f2 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O câncer cervical é a segunda maior causa de mortes entre mulheres no mundo. Esta neoplasia maligna está relacionada com a presença do Papilomavírus Humano (HPV), sendo o tipo 16 responsável por 60% dos casos. O HPV infecta o tecido epitelial mucoso ou cutâneo e é responsável pelo aparecimento de verrugas ou papilomas benignos que tendem a regredir naturalmente na maioria dos casos, mas que ainda assim causam prejuízos aos indivíduos infectados e aos sistemas públicos de saúde, sendo a papilomatose considerada a doença sexualmente transmissível mais prevalente no mundo, tornando essencial a aplicação de estratégias de combate à esta infecção. Vacinas baseadas em Virus-like particles (VLPs), formadas a partir das proteínas capsidiais L1 e L2 - que induzem a formação de anticorpos neutralizantes - já estão comercialmente disponíveis. Contudo, possuem um preço elevado considerando, principalmente, os países em desenvolvimento. A imunidade humoral é direcionada contra os epítopos conformacionais da proteína L1 que compõe 90% da estrutura capsidial. Para produção das VLPs os genes das proteínas capsidiais são expressos em sistemas heterólogos e o produto resultante é purificado. A escolha de um sistema mais simples e barato para essa expressão é fundamental para a redução do custo das vacinas. Uma alternativa promissora é a levedura Pichia pastoris. Este trabalho propôs a produção extracelular da proteína L1 de HPV16, que teve seu gene inserido no vetor pPCIZAα. A construção pPICZAαL1H16 foi integrada no genoma da levedura Pichia pastoris e a transcrição do gene L1 e a expressão da proteína foram confirmadas por RT-PCR e imunodetecção em Dot Blot. A expressão extracelular da proteína L1 de HPV 16, em células de P. pastoris, é uma etapa essencial na busca do desenvolvimento de uma estratégia vacinal mais economicamente viável baseada em VLPs

The methylotrophic yeast Pichia pastoris has become an efficient expression system for heterologous protein production. Different methods have been studied to enhance cell growth as well as the production of products of interest. Two of the major strategies for improving the product or biomass yields are optimizing bioprocess controls and cultivation conditions. In this work, the characteristics of this yeast system and of its different promoters are discussed, and the effect of operational strategies on cell growth and recombinant protein expression is also studied. The effect of different feeding strategies were studied and optimized for pGAP (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)-regulated phytase production in P. pastoris. Alternative carbon sources were screened and the feasibility of using citric acid as a carbon source for recombinant protein production was also investigated. The effects of parameters such as the carbon source concentration and culture pH were studied using shake-flasks, and the effect of different feeding profiles on bioreactor performance was also investigated. Three feeding strategies, Stepwise feeding, Exponential feeding and DO-stat feeding were tested and DO-stat was found to be more efficient and led to a high phytase activity. A modified DO-stat method was investigated to overcome the oxygen limited condition in the standard DO-stat method. For the carbon source, citric acid showed promise in improving phytase expression. Further experiments in bioreactors performed with the presence of certain amount of citric acid showed that less glycerol could be used to achieve the same level of phytase activity.

The aim of this diploma thesis is determination of alfalfa (Medicago sativa) infestation in Agricaltural company Kvasicko a. s. The monitoring of infestation was doing from 2013 to 2016 on land Odšenkovna, sawn on 29. 8. 2013, and on land Novina levá, sawn on 11. 4. 2014. Evaluation was made by counting method. The results of this evaluation were processed with DCA analysis and canonical corespondence analysis (CCA). It was found 11 species of weeds on observed lands during the monitoring. The most frequently weeds were: Capsella bursa-pastoris, Stellaria media, Taraxacum sec. Ruderalia and Veronica.

Pichia pastoris is a methylotrophic yeast that is commonly used for its ability to express and secrete heterologous proteins. However, some proteins are not readily secreted in P pastoris and so adjustments in the secretion pathway must be made in order to achieve secretion. The Lin-Cereghino lab previously developed mutant strains using restriction enzyme-mediated integration that enabled P pastoris to secrete Pgalactosidase at higher levels than the wild type strain. This study focuses on characterizing the random pREMI-Z mutations in the genomic DNA and examining their secretory phenotype, in hopes of creating a super secretor strain. The ah3 mutant was specifically chosen and characterized for its ability to secrete HRP and SLPI proteins and the effect of the pREMI-Z mutation on the morphology of the cells using transmission electron microscopy. An examination into the AH3 protein yielded a comparative B-galactosidase secretion study between the ah3 mutant and ah3 mutant cells transformed with the pKANB-AH3 rescue construct. Lastly, a cell localization experiment was done to examine where the AH3 protein may be found. These experiments help to increase the current understanding of the secretion pathway in Pichia pastoris and serves as an outline of how to characterize other pREMI -Z mutant strains.

No description available.

The methylotrophic yeast, Pichia pastoris, has been used to successfully produce and express over 700 heterologous proteins. Currently, the only two dominant selectable markers available are the Zeocin and blasticidin resistance genes. This study focused on characterizing and developing the modified G418 selectable marker so it could be used for primary selection of single copy and multicopy strains. To demonstrate its use as a selectable marker the SLPI reporter gene was inserted into the Zeocin resistance vector, pPICZB, and the new G418 resistance vector, pKANa B. The resulting constructs were then transformed into P. pastoris yJC100 cells. Piggyback strains containing both resistance vectors were also constructed. Real-time PCR, spot western blot, western immunoblot, and ELISA analysis confirmed that the modified G418 resistant vector was comparable to the Zeocin resistant vector and that its capable of generating multicopy transformants. In addition, analysis of our piggyback strains showed an increase in SIPI production and in plasmid copy number when compared to their respective "mother