Submitted by Chaylane Marques (chaylane.marques@ufpe.br) on 2015-03-12T18:59:12Z No. of bitstreams: 2 Dissertacao_Mestrado_Breno_Moacir_Farias_de_Albuquerque.pdf: 1983241 bytes, checksum: 2527dfa8747683b92433fbcc2a3e2bfc (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T18:59:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacao_Mestrado_Breno_Moacir_Farias_de_Albuquerque.pdf: 1983241 bytes, checksum: 2527dfa8747683b92433fbcc2a3e2bfc (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / O Papilomavírus bovino (BPV) é o agente etiológico da papilomatose bovina. Esta apresenta lesões que normalmente são benignas e tendem a regredir, porém podem progredir a uma neoplasia. Muitas metodologias utilizadas para detecção de BPV se mostram inespecíficas e apresentam reações cruzadas com outros organismos relacionados. No entanto, a reação quantitativa em tempo real em cadeia da polimerase (qPCR) é uma ferramenta de destaque na detecção, tipificação e quantificação de nucleotídeos e vem sendo utilizada na clínica para avaliar carga viral. O objetivo do trabalho foi desenvolver um novo protocolo de detecção, tipificação e quantificação de BPV através da qPCR. Foram desenhados cinco pares de primers, que possuem como alvo uma região conservada do genoma viral (gene L1) de diferentes BPVs. A seletividade dos primers foi testada in vitro e DNA extraído de células MDBK não infectadas foram utilizados como controle negativo. A técnica de qPCR permitiu detectar, tipificar e quantificar material viral dos BPVs 1, 2, 4, 5 e 6. O limiar relativo da detecção foi de 4fg de DNA, em torno de 30-40 cópias de DNA/μL. Dos cinco pares de primers produzidos, quatro apresentaram mesmo perfil térmico durante a qPCR (qPCRBPV2, 4, 5 e 6), permitindo em um único procedimento detectar e tipificar os quatro tipos virais. A distinção das amostras foi realizada através da análise de melting que permitiu tipificá-las. Através da metodologia desenvolvida foi observado que em lesões cutâneas de bovinos infectados com BPV a carga viral não se mostrou inferior a 1000 cópias/μL, enquanto que a técnica permite quantificar até um limiar de 40 copias de DNA/μl. Este trabalho possui relevância para validação de qPCR como diagnóstico da papilomatose bovina e particular importância quando aplicado em estudos da infecção pelo BPV e no monitoramento por veterinários da eficácia das futuras vacinas.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:52:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2841_1.pdf: 1812233 bytes, checksum: 78abbf363fbd42ac838d1798c601100f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Entre outras técnicas, os métodos eletroquímicos têm emergido como sendo atrativos devido à sua simplicidade, baixo custo, possibilidade de medição em tempo real e, geralmente, apresentarem alta sensibilidade. Neste estudo, foi desenvolvido um protótipo de um biossensor amperométrico de glicose, parcialmente baseado na tecnologia de impressão jato de tinta (Inkjet). Dois eletrodos foram confecionados pelo método screenprinting em uma fita de PVA (Polivinil Álcool). Em um deles, uma solução de glicose oxidase foi depositada por impresora a jato de tinta, modificada para os experimentos. O eletrodo de referência foi constituído de Ag /AgCl. Antes do processo de impressão, foi realizada uma verificação dos sitema impressor por Microscopia Eletrônica de Varredura, para avaliação dos poros de impressão. A Voltametria cíclica apresentou resposta linear entre concentração de glicose e os picos de corrente anódica em um mesmo intervalo de potencial, indicando a viabilidade do método. Neste trabalho também foi desenvolvido um genosensor para a detecção de sequências específicas de DNA transduzidas por Voltametria de Pulso Diferencial. Os eletrodos foram feitos pela imobilização de sequências de DNA em um eletrodo de ITO (Indium Tin Oxide) modificado com NaOH e APTES. Os resultados demonstraram um aumento do valor de corrente anódica (0,73 μA) quando a sequência de DNA estava presente no eletrodo, diferindo da corrente encontrada nos eletrodos sem a sequência imobilizada. Os resultados também mostraram que após a hibridização do DNA imobilizado com uma sequência complementar de uma região específica do vírus BPV contendo 27 bases, a corrente anódica diminuiu, indicando que o processo de hibridização ocorreu na superfície do eletrodo. A seqüência utilizada para a hibridização foi uma região específica do vírus BPV, contendo 27 bases. Os achados indicam que o eletrodo de ITO poderia ser um instrumento viável e de fácil manipulação para construção de biossensores de DNA

A ação metastática do BPV permanece não clara. Este estudo avaliou a ação do BPV na transição epitélio-mesênquima (TEM), empregando linhagens celulares de papiloma (P), fibropapiloma (FB) e carcinoma de esôfago (CE). Os resultados mostraram a presença de infecção produtiva e o aumento do potencial proliferativo nestas células. Porém, foi verificada a redução do potencial de membrana mitocondrial em relação à pele saudável (controle) e o aumento do estresse oxidativo, resultante da ação da oncoproteína E6, justificando a clastogenicidade e a aquisição do fenótipo-tronco descrito nas linhagens de P, FB e CE. Estas linhagens mostram capacidade migratória decorrente do sequestro citoplasmático de E-caderina, e o aumento dos níveis de expressão de vimentina, vinculina e N-caderina como consequência da ativação dos fatores STAT3 e SLUG, sugerindo a ação do vírus na indução da TEM. Tais resultados foram validados em amostras de tecido, reforçando a ação do vírus na TEM, bem como demostrando o potencial destas linhagens celulares como modelo de estudo da metástase. / BPV metastatic action remains unclear. This study evaluated the BPV action on epithelial-mesenchymal transmition (EMT), using cell lines form papilloma (P), fibropapilloma (FB) and esophageal carcinoma (EC). Results showed the productive infection presence and the proliferative potential increase in these cells. However, it was verified the mitochondrial membrane potential loss in relation to normal skin (control) and the oxidative stress increase as result of E6 oncoprotein, justifying the clastogenicity and stem-cell phenotype acquisition described in P, FB and EC cells. This cell lines showed a migratory capability as result of cytoplasmic sequester of E-cadherin, and the increase levels of vimentin, vinculin and N-cadherin as consequence of STAT3 and SLUG factors activation, suggest the virus action on EMT. These results were also verified in tissue samples, reinforcing the BPV action on EMT, as well as demonstrating the potential of these cell lines as model to study the metastasis.

A ação metastática do BPV permanece não clara. Este estudo avaliou a ação do BPV na transição epitélio-mesênquima (TEM), empregando linhagens celulares de papiloma (P), fibropapiloma (FB) e carcinoma de esôfago (CE). Os resultados mostraram a presença de infecção produtiva e o aumento do potencial proliferativo nestas células. Porém, foi verificada a redução do potencial de membrana mitocondrial em relação à pele saudável (controle) e o aumento do estresse oxidativo, resultante da ação da oncoproteína E6, justificando a clastogenicidade e a aquisição do fenótipo-tronco descrito nas linhagens de P, FB e CE. Estas linhagens mostram capacidade migratória decorrente do sequestro citoplasmático de E-caderina, e o aumento dos níveis de expressão de vimentina, vinculina e N-caderina como consequência da ativação dos fatores STAT3 e SLUG, sugerindo a ação do vírus na indução da TEM. Tais resultados foram validados em amostras de tecido, reforçando a ação do vírus na TEM, bem como demostrando o potencial destas linhagens celulares como modelo de estudo da metástase. / BPV metastatic action remains unclear. This study evaluated the BPV action on epithelial-mesenchymal transmition (EMT), using cell lines form papilloma (P), fibropapilloma (FB) and esophageal carcinoma (EC). Results showed the productive infection presence and the proliferative potential increase in these cells. However, it was verified the mitochondrial membrane potential loss in relation to normal skin (control) and the oxidative stress increase as result of E6 oncoprotein, justifying the clastogenicity and stem-cell phenotype acquisition described in P, FB and EC cells. This cell lines showed a migratory capability as result of cytoplasmic sequester of E-cadherin, and the increase levels of vimentin, vinculin and N-cadherin as consequence of STAT3 and SLUG factors activation, suggest the virus action on EMT. These results were also verified in tissue samples, reinforcing the BPV action on EMT, as well as demonstrating the potential of these cell lines as model to study the metastasis.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-15T13:32:40Z No. of bitstreams: 2 TESE Maria Angelica da Silva.pdf: 2203628 bytes, checksum: f618e74288a647b78d637d4346df2c36 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-15T13:32:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Maria Angelica da Silva.pdf: 2203628 bytes, checksum: f618e74288a647b78d637d4346df2c36 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / CAPES; FACEPE / Os papilomavirus bovino (BPV) são oncovirus com DNA circular dupla fita e usualmente espécie-específico. Embora o BPV cause doenças de importância veterinária, o conhecimento sobre sua diversidade e biologia ainda é limitado. Esse trabalho objetivou estudar a biologia e diversidade da infecção por BPV em lesões cutâneas de bovinos e sítios não epiteliais de bovinos e equinos. No capítulo I, buscou-se avaliar a diversidade de PV em lesões cutâneas. Foram encontrados os BPV 1, 2, 3, 6 e o Papilomavírus associado ao sarcóide felino (FeSarPV) e a presença de co-infecções. No capítulo II, foram avaliados mecanismos etiopatogênicos em lesões papilomatosas induzidas por BPV. Foi observada a expressão da oncoproteína E5 em todos os fibropapilomas analisados e uma superexpressão da conexina 26 nos fibropapilomas, comparado com o tecido normal. No capítulo III, foi verificada a presença do DNA de BPV em espermatozoide e líquido seminal de sêmen comercial de touros e seu efeito na função espermática. O DNA do BPV2 foi encontrado em todas as amostras avaliadas, porém sem causar redução na função espermática. No Capítulo IV, foi avaliada a presença e expressão de BPV em sangue de bovinos sadios e afetados por papilomatose. Os BPV 1 e 2 foram encontrados em animais assintomáticos e com papilomatose assim como sua expressão. No Capítulo V, foi verificada a presença e expressão de BPV em sêmen fresco de touros saudáveis. O DNA de BPV2 foi encontrado em 35% das amostras e a expressão das proteínas E2 e E5 foi verificada em 55% das amostras de sêmen positivas para BPV2. No capítulo VI foi investigada a presença e expressão genes de BPV em células do sangue e sêmen de cavalos saudáveis por PCR e RT-PCR. Os BPV 1 e 2 foram encontrados no sangue de 20% dos cavalos avaliados e no sêmen 35% dos animais. A expressão da oncoproteína E5 foi verificada em 36% das amostras de sangue e em sêmen positivas para o BPV. No Capítulo VII, foram comparados dois sistemas de detecção de BPV por PCR, um com primers tipo específico e outro com primers consenso em lesões cutâneas e fuidos de bovinos. Os primers tipo específico para detecção de BPV mostraram-se mais sensíveis do que os primers consenso, além disso, através destes foi verificada a alta prevalência de co-infecções nas amostras estudadas. Porém, os primers consenso, amplificaram alta diversidade de BPV, e prováveis novos tipos de BPV nas amostras estudadas. Desta forma, os trabalhos oriundos desta tese, permitiram descrever a diversidade de BPV nas lesões cutâneas de bovinos do Brasil e um de seus prováveis mecanismos de ação, além disso, contribuem para fortalecer a hipótese de que os BPV são capazes de infectar tecidos não-epiteliais, através da verificação da presença e expressão de genes virais em células sanguíneas e do sêmen de bovinos e equinos. Os resultados obtidos nesta tese vêm contribuir para o melhor conhecimento de ferramentas moleculares que podem ser empregadas nos estudos de presença e caracterização do BPV nos diversos tecidos bovinos.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-06T18:47:19Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Dissertacao-BrenoAlbuquerque.pdf: 1989114 bytes, checksum: 513b1650c4c44605e3bda0afef185321 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-06T18:47:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Dissertacao-BrenoAlbuquerque.pdf: 1989114 bytes, checksum: 513b1650c4c44605e3bda0afef185321 (MD5) Previous issue date: 2012 / O Papilomavírus bovino(BPV) é o agente etiológico da papilomatosebovina. Esta apresenta lesões que normalmente são benignas e tendem a regredir, porém podem progredir a uma neoplasia. Muitas metodologias utilizadas para detecção de BPV se mostram inespecíficas e apresentam reações cruzadas com outros organismos relacionados. No entanto, a reação quantitativa em tempo real emcadeia da polimerase (qPCR) é uma ferramenta de destaque na detecção, tipificação e quantificação de nucleotídeos e vem sendo utilizada na clínica para avaliar carga viral. O objetivo do trabalho foi desenvolver um novo protocolo de detecção, tipificação e quantificação de BPV através daqPCR. Foram desenhados cinco pares de primers, que possuem como alvo uma região conservada do genoma viral (gene L1) de diferentes BPVs. A seletividade dos primers foi testada in vitroe DNA extraído de células MDBK não infectadas foram utilizados como controle negativo. A técnica de qPCR permitiu detectar, tipificar e quantificar material viral dos BPVs 1, 2, 4, 5 e 6. O limiar relativo da detecção foi de 4fg de DNA,emtorno de 30-40 cópias de DNA/μL. Dos cinco pares de primers produzidos, quatro apresentaram mesmo perfil térmico durante a qPCR (qPCRBPV2, 4, 5 e 6), permitindo em um único procedimento detectar e tipificar os quatro tipos virais. A distinção das amostrasfoi realizada através da análise de meltingque permitiu tipificá-las. Através da metodologia desenvolvida foi observado que em lesões cutâneas de bovinos infectados com BPV a carga viral não se mostrou inferior a 1000 cópias/μL, enquanto que a técnica permite quantificar até um limiar de 40 copias de DNA/μl. Este trabalho possui relevância para validação de qPCR como diagnóstico da papilomatose bovina e particular importância quando aplicado em estudos da infecção pelo BPV e no monitoramento por veterinários da eficácia das futuras vacinas. / Bovine papillomavirus (BPVs) is the etiologic agent of bovine papilomatose which is characterized by hyper proliferative lesions. Papillomas in cattle are typically benignandoften regress, but occasionally lesions can persist and progress to malignant neoplasia.The majority of current techniques for identification of BPV is unspecific andpossessescross-reactivity with closely related organisms.The Real-time quantitative polymerase chain reaction assay (qPCR) has become an exceptional tool for detection and quantification of oligonucleotides and has been utilized increasingly on viral load evaluation.Aiming to develop a new protocol for fast detection, typification and quantification of BPV in qPCR, we designed five pairs of Oligonucleotides for BPV1, 2, 4, 5 and 6 focusing on L1 gene. The qPCR primers sets were testedin vitroandMadin-Darby Bovine Kidney Cells (MDBK)DNA was also used as negative control.The Real-time qPCR assay provided an accurate detection and quantification for the BPVs 1, 2, 4, 5 and 6. The relative detection limit for the assays was 4fg or 30 to 40genome equivalents. Four primers pairs (qPCRBPV2, 4, 5 and 6) had the same annealing temperature and their products showed differences on meltingpoints analyses. Through the meltingpoint analysis, samples can be identified and discriminated as a screening and then samples can be run for viral load. In our study we tested the viral load in bovine cutaneous skin warts and observed infections with 1000 copies/μl at least. However, this assay could reach levels of 40copies/μL. In conclusion, this methodology has an important impact on the validation of qPCR as a BPV diagnosis. Its relevance is proved when applied to BPV infection studies and the monitoring of the efficacy of future BPV vaccinesby veterinarians.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-10T17:37:33Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-MariaAngelicaSilva.pdf: 2202931 bytes, checksum: 9e64864a364b4356fa6e0609d9ae8aeb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-10T17:37:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-MariaAngelicaSilva.pdf: 2202931 bytes, checksum: 9e64864a364b4356fa6e0609d9ae8aeb (MD5) Previous issue date: 2012 / Os papilomavirus bovino (BPV) são oncovirus com DNA circular dupla fita e usualmente espécie-específico. Embora o BPV cause doenças de importância veterinária, o conhecimento sobre sua diversidade e biologia ainda é limitado. Esse trabalho objetivou estudar a biologia e diversidade da infecção por BPV em lesões cutâneas de bovinos e sítios não epiteliais de bovinos e equinos. No capítulo I, buscou-se avaliar a diversidade de PV em lesões cutâneas. Foram encontrados os BPV 1, 2, 3, 6 e o Papilomavírus associado ao sarcóide felino (FeSarPV) e a presença de co-infecções. No capítulo II, foram avaliados mecanismos etiopatogênicos em lesões papilomatosas induzidas por BPV. Foi observada a expressão da oncoproteína E5 em todos os fibropapilomas analisados e uma superexpressão da conexina 26 nos fibropapilomas, comparado com o tecido normal. No capítulo III, foi verificada a presença do DNA de BPV em espermatozoide e líquido seminal de sêmen comercial de touros e seu efeito na função espermática. O DNA do BPV2 foi encontrado em todas as amostras avaliadas, porém sem causar redução na função espermática. No Capítulo IV, foi avaliada a presença e expressão de BPV em sangue de bovinos sadios e afetados por papilomatose. Os BPV 1 e 2 foram encontrados em animais assintomáticos e com papilomatose assim como sua expressão. No Capítulo V, foi verificada a presença e expressão de BPV em sêmen fresco de touros saudáveis. O DNA de BPV2 foi encontrado em 35% das amostras e a expressão das proteínas E2 e E5 foi verificada em 55% das amostras de sêmen positivas para BPV2. No capítulo VI foi investigada a presença e expressão genes de BPV em células do sangue e sêmen de cavalos saudáveis por PCR e RT-PCR. Os BPV 1 e 2 foram encontrados no sangue de 20% dos cavalos avaliados e no sêmen 35% dos animais. A expressão da oncoproteína E5 foi verificada em 36% das amostras de sangue e em sêmen positivas para o BPV. No Capítulo VII, foram comparados dois sistemas de detecção de BPV por PCR, um com primers tipo específico e outro com primers consenso em lesões cutâneas e fuidos de bovinos. Os primers tipo específico para detecção de BPV mostraram-se mais sensíveis do que os primers consenso, além disso, através destes foi verificada a alta prevalência de co-infecções nas amostras estudadas. Porém, os primers consenso, amplificaram alta diversidade de BPV, e prováveis novos tipos de BPV nas amostras estudadas. Desta forma, os trabalhos oriundos desta tese, permitiram descrever a diversidade de BPV nas lesões cutâneas de bovinos do Brasil e um de seus prováveis mecanismos de ação, além disso, contribuem para fortalecer a hipótese de que os BPV são capazes de infectar tecidos não-epiteliais, através da verificação da presença e expressão de genes virais em células sanguíneas e do sêmen de bovinos e equinos. Os resultados obtidos nesta tese vêm contribuir para o melhor conhecimento de ferramentas moleculares que podem ser empregadas nos estudos de presença e caracterização do BPV nos diversos tecidos bovinos. / Bovine papillomavirus (BPV) are double-stranded circular DNA oncovirus and usually species-specific. Although BPV causes diseases of veterinary importance, knowledge about their biology and diversity is still limited. This study investigated the natural history of BPV infection in cattle and cutaneous epithelial sites of cattle and horses. In Chapter I, we sought to evaluate the diversity of PV in cutaneous lesions. We found BPV 1, 2, 3, 6 and papillomavirus associated with feline sarcoid (FeSarPV) and co-infections. In Chapter II, we detected the BPV DNA in sperm and seminal fluid of trade bull semen and its effect on sperm function. The DNA of BPV2 was found in all samples, without causing a reduction in sperm function. In Chapter III, we evaluated etiopathogenic mechanisms of BPV induced lesions. We observed the expression of E5 oncoprotein in all analyzed fibropapillomas and an overexpression of connexin 26 in fibropapillomas compared to normal tissue. In Chapter IV, we evaluated the presence and expression of BPV in blood of healthy and affected cattle by papillomatosis. The BPV 1 and 2 were found in asymptomatic and papillomatosisaffected animals as well as its expression. In Chapter V, we detected the presence and expression of BPV in fresh semen of healthy bulls. BPV2 DNA was found in 35% of samples and the expression of E2 and E5 proteins was found in 55% of BPV2- positive semen. In Chapter VI was investigated the presence and expression of BPV genes in blood and semen cells of healthy horses by PCR and RT-PCR. BPV 1 and 2 were found in 20% of blood horses and in 35% of semen evaluated. Expression of E5 oncoprotein was found in 36% of blood and semen samples positive for BPV. In Chapter VII, we compared two PCR methods for BPV detection in skin lesions and fluids: the use of BPV type-specific and consensus primers. The type-specific primers for detection of BPV were more sensitive than consensus primers and could detect co-infection of BPV in the samples. Consensus primers amplified a high diversity of BPV, and probable new BPV types in the samples studied. Thus, this thesis allowed describing the diversity of BPV in the skin lesions of Brazillian cattle and one of its possible mechanisms of action and also contributes to strengthen the hypothesis that BPV may infect non-epithelial sites, by verifying the presence and expression of viral genes in blood and semen cells of cattle and horses. The results obtained in this thesis contribute to a better understanding of molecular tools that can be employed in studies of presence and characterization of BPV in various bovine tissues.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:04:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3741_1.pdf: 1581853 bytes, checksum: 0025fe881a3b0e2eed7c457909ca63d6 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Os papilomavírus são conhecidos por causarem lesões tumorais, geralmente benignas, em tecidos epiteliais de diversos organismos, que podem sob condições adequadas progredirem para o câncer. O papilomavírus bovino (BPV) tem sido amplamente caracterizado tanto por ser considerado um modelo experimental para o estudo do papilomavírus humano (HPV), quanto por sua grande importância na bovinocultura. Estudos para o combate da infecção mostram que vacinas baseadas em virus-like particles (VLPs), formadas a partir das proteínas capsidiais L1/L2 ou L1, induzem à produção de anticorpos neutralizantes conferindo proteção contra o mesmo tipo viral. A levedura Pichia pastoris é um sistema de expressão eficiente e de baixo custo para produção de altos níveis de proteínas, além de apresentar vantagens em relação a outros sistemas. Neste trabalho foi avaliado a possibilidade do uso do sistema de expressão heteróloga baseado em células da levedura P. pastoris para a produção da proteína L1 do capsídeo do papilomavírus bovino tipo 1. O gene L1 foi amplificado por PCR a partir do genoma completo de BPV 1, clonado no vetor pGEM-T Easy e subclonado sob a regulação do promotor AOX1 e em fase de leitura com uma cauda de poli-histidina presentes no vetor pPICZA. As células da levedura foram transformadas com a construção pPICZAL1B1 e os recombinantes resistentes a zeocina foram selecionados para expressão da proteína L1. Estes foram cultivados em frascos contendo meio com glicerol como fonte de carbono e após 48 horas o meio foi trocado por outro contendo 0,5% de metanol. A cada 24 horas foi adicionado metanol para uma concentração final de 2%, até completar 96 horas. Os resultados obtidos mostraram que os recombinantes P. pastoris transformados com o cassete de expressão pPICZAL1B1, após indução com metanol, foram capazes de expressar o gene L1 e de produzir a proteína L1 de BPV 1. Tais transformantes permitirão o estabelecimento de um sistema de expressão da proteína L1 e conseqüente produção de VLPs como primeiro passo para implementação de uma estratégia vacinal contra infecções por papilomavírus

Os papilomavírus (PV) são vírus epiteliotrópicos e constituem um grande grupo geneticamente diverso da família Papillomaviridae que infecta diferentes espécies de mamíferos, répteis e aves. Estes vírus caracterizam-se por sua propriedade oncogênica, sendo responsáveis pela indução de tumores benignos e malignos nos epitélios cutâneo e mucoso de suas espécies hospedeiras. Nos bovinos, a papilomatose causa importantes prejuízos econômicos à pecuária de corte e leiteira, dentre as quais destacam-se as infecções secundárias, a dificuldade de amamentação do bezerro, a depreciação do couro e o descarte precoce de animais e, ainda, no caso de rebanhos de aptidão leiteira, a papilomatose mamária ocasiona dificuldade de ordenha, retenção de leite e predispõe à mastite. Independente do nível de tecnificação da exploração na pecuária, estes agentes podem ser encontrados em quase todos os países. No entanto, poucos tipos de papilomavírus bovinos (BPV) foram caracterizados até o presente momento. Desta forma, este trabalho teve como objetivo realizar um estudo de caracterização genética e patológica das infecções causadas pelo BPV na região norte do Brasil. No Capítulo 1, buscou-se avaliar a diversidade dos BPVs em lesões cutâneas de bovinos na região Amazônica brasileira utilizando o par de primers degenerados FAP (FAP59 e FAP64) Foram encontrados os BPVs tipo 1, 2, 11, e 13 além de quatro prováveis novos tipos virais que apresentaram baixa identidade com os BPVs 7, 8, 11 e 12. No Capítulo 2, o genoma de um novo tipo de papilomavírus bovino pertencente ao gênero Xipapillomavirus, espécie Xipapillomavirus 1, foi caracterizado aplicando a técnica de amplificação por círculo rolante seguida de sequenciamento de alta eficiência utilizando a plataforma Illumina. Este novo tipo apresentou maior similaridade com o BPV3 (79% de identidade a nível genômico) e preenche os requisitos para ser considerado um novo tipo de BPV. Histopatologicamente, a lesão causada por esse novo BPV foi caracterizada como papiloma exofítico, apresentando células bem diferenciadas, marcada acantose e paraqueratose. No Capítulo 3, foi realizado o sequenciamento de um genoma completo de BPV5 utilizando o mesmo protocolo do Capítulo 2. Este foi o primeiro genoma de BPV5 da América do Sul completamente sequenciado e caracterizado. Assim, os resultados obtidos nesta tese contribuem para o melhor conhecimento da variabilidade genética do BPV e mostra a importância da utilização de ferramentas moleculares na sua caracterização, principalmente em regiões carentes de estudos e que podem abrigar tipos desconhecidos. / Papillomaviruses (PV) are epitheliotropic viruses that constitute a large genetically diverse group of the Papillomaviridae family which can infect different species of mammals, reptiles and birds. These viruses are characterized by their oncogenic properties and are responsible for the induction of benign and malignant tumors in cutaneous and mucosal epithelia. In cattle, papillomatosis causes significant economic losses to beef and dairy cattle characterized by secondary infections, calf breastfeeding difficulties, leather depreciation, early animal discarding, mammary papillomatosis, retention of milk and predisposes to mastitis. Regardless of the level of technification of livestock farming, these agents can be found in almost all countries. However, few types of bovine papillomavirus (BPV) have been characterized to date. Thereby, this work had as objective to carry out a study of genetic and pathological characterization of the infections caused by the BPV from Northern Brazil. In Chapter 1, we evaluated the genetic diversity of BPVs in bovine cutaneous lesions from Brazilian Amazon using the degenerate FAP pairs of primers (FAP59 and FAP64). BPV1, 2, 11, and 13 were found in addition to four probable new viral types that had low identity with BPVs 7, 8, 11 and 12 In Chapter 2, the whole genome of a new BPV type belonging to genus Xipapillomavirus, species Xipapillomavirus 1, was characterized applying the technique of rolling circle amplification followed by high-throughput sequencing using the Illumina platform. This new type showed greater similarity with BPV3 (79% identity at the genomic level) and fulfills the requirements to be considered a new BPV type. Histopathology was characterized by exophytic papilloma, presenting well differentiated cells, marked acanthosis and parakeratosis. In Chapter 3, a complete BPV5 genome was sequenced using the same protocol used in Chapter 2. This was the first fully sequenced and characterized BPV5 genome from South America. Thus, the results obtained in this thesis contribute to a better knowledge of the genetic variability of BPV and shows the importance of the use of molecular tools in their characterization, especially in regions that are lacking in studies and which may harbor unknown types.

Os papilomavírus (PV) são vírus epiteliotrópicos e constituem um grande grupo geneticamente diverso da família Papillomaviridae que infecta diferentes espécies de mamíferos, répteis e aves. Estes vírus caracterizam-se por sua propriedade oncogênica, sendo responsáveis pela indução de tumores benignos e malignos nos epitélios cutâneo e mucoso de suas espécies hospedeiras. Nos bovinos, a papilomatose causa importantes prejuízos econômicos à pecuária de corte e leiteira, dentre as quais destacam-se as infecções secundárias, a dificuldade de amamentação do bezerro, a depreciação do couro e o descarte precoce de animais e, ainda, no caso de rebanhos de aptidão leiteira, a papilomatose mamária ocasiona dificuldade de ordenha, retenção de leite e predispõe à mastite. Independente do nível de tecnificação da exploração na pecuária, estes agentes podem ser encontrados em quase todos os países. No entanto, poucos tipos de papilomavírus bovinos (BPV) foram caracterizados até o presente momento. Desta forma, este trabalho teve como objetivo realizar um estudo de caracterização genética e patológica das infecções causadas pelo BPV na região norte do Brasil. No Capítulo 1, buscou-se avaliar a diversidade dos BPVs em lesões cutâneas de bovinos na região Amazônica brasileira utilizando o par de primers degenerados FAP (FAP59 e FAP64) Foram encontrados os BPVs tipo 1, 2, 11, e 13 além de quatro prováveis novos tipos virais que apresentaram baixa identidade com os BPVs 7, 8, 11 e 12. No Capítulo 2, o genoma de um novo tipo de papilomavírus bovino pertencente ao gênero Xipapillomavirus, espécie Xipapillomavirus 1, foi caracterizado aplicando a técnica de amplificação por círculo rolante seguida de sequenciamento de alta eficiência utilizando a plataforma Illumina. Este novo tipo apresentou maior similaridade com o BPV3 (79% de identidade a nível genômico) e preenche os requisitos para ser considerado um novo tipo de BPV. Histopatologicamente, a lesão causada por esse novo BPV foi caracterizada como papiloma exofítico, apresentando células bem diferenciadas, marcada acantose e paraqueratose. No Capítulo 3, foi realizado o sequenciamento de um genoma completo de BPV5 utilizando o mesmo protocolo do Capítulo 2. Este foi o primeiro genoma de BPV5 da América do Sul completamente sequenciado e caracterizado. Assim, os resultados obtidos nesta tese contribuem para o melhor conhecimento da variabilidade genética do BPV e mostra a importância da utilização de ferramentas moleculares na sua caracterização, principalmente em regiões carentes de estudos e que podem abrigar tipos desconhecidos. / Papillomaviruses (PV) are epitheliotropic viruses that constitute a large genetically diverse group of the Papillomaviridae family which can infect different species of mammals, reptiles and birds. These viruses are characterized by their oncogenic properties and are responsible for the induction of benign and malignant tumors in cutaneous and mucosal epithelia. In cattle, papillomatosis causes significant economic losses to beef and dairy cattle characterized by secondary infections, calf breastfeeding difficulties, leather depreciation, early animal discarding, mammary papillomatosis, retention of milk and predisposes to mastitis. Regardless of the level of technification of livestock farming, these agents can be found in almost all countries. However, few types of bovine papillomavirus (BPV) have been characterized to date. Thereby, this work had as objective to carry out a study of genetic and pathological characterization of the infections caused by the BPV from Northern Brazil. In Chapter 1, we evaluated the genetic diversity of BPVs in bovine cutaneous lesions from Brazilian Amazon using the degenerate FAP pairs of primers (FAP59 and FAP64). BPV1, 2, 11, and 13 were found in addition to four probable new viral types that had low identity with BPVs 7, 8, 11 and 12 In Chapter 2, the whole genome of a new BPV type belonging to genus Xipapillomavirus, species Xipapillomavirus 1, was characterized applying the technique of rolling circle amplification followed by high-throughput sequencing using the Illumina platform. This new type showed greater similarity with BPV3 (79% identity at the genomic level) and fulfills the requirements to be considered a new BPV type. Histopathology was characterized by exophytic papilloma, presenting well differentiated cells, marked acanthosis and parakeratosis. In Chapter 3, a complete BPV5 genome was sequenced using the same protocol used in Chapter 2. This was the first fully sequenced and characterized BPV5 genome from South America. Thus, the results obtained in this thesis contribute to a better knowledge of the genetic variability of BPV and shows the importance of the use of molecular tools in their characterization, especially in regions that are lacking in studies and which may harbor unknown types.