Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-15T13:32:40Z No. of bitstreams: 2 TESE Maria Angelica da Silva.pdf: 2203628 bytes, checksum: f618e74288a647b78d637d4346df2c36 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-15T13:32:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Maria Angelica da Silva.pdf: 2203628 bytes, checksum: f618e74288a647b78d637d4346df2c36 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / CAPES; FACEPE / Os papilomavirus bovino (BPV) são oncovirus com DNA circular dupla fita e usualmente espécie-específico. Embora o BPV cause doenças de importância veterinária, o conhecimento sobre sua diversidade e biologia ainda é limitado. Esse trabalho objetivou estudar a biologia e diversidade da infecção por BPV em lesões cutâneas de bovinos e sítios não epiteliais de bovinos e equinos. No capítulo I, buscou-se avaliar a diversidade de PV em lesões cutâneas. Foram encontrados os BPV 1, 2, 3, 6 e o Papilomavírus associado ao sarcóide felino (FeSarPV) e a presença de co-infecções. No capítulo II, foram avaliados mecanismos etiopatogênicos em lesões papilomatosas induzidas por BPV. Foi observada a expressão da oncoproteína E5 em todos os fibropapilomas analisados e uma superexpressão da conexina 26 nos fibropapilomas, comparado com o tecido normal. No capítulo III, foi verificada a presença do DNA de BPV em espermatozoide e líquido seminal de sêmen comercial de touros e seu efeito na função espermática. O DNA do BPV2 foi encontrado em todas as amostras avaliadas, porém sem causar redução na função espermática. No Capítulo IV, foi avaliada a presença e expressão de BPV em sangue de bovinos sadios e afetados por papilomatose. Os BPV 1 e 2 foram encontrados em animais assintomáticos e com papilomatose assim como sua expressão. No Capítulo V, foi verificada a presença e expressão de BPV em sêmen fresco de touros saudáveis. O DNA de BPV2 foi encontrado em 35% das amostras e a expressão das proteínas E2 e E5 foi verificada em 55% das amostras de sêmen positivas para BPV2. No capítulo VI foi investigada a presença e expressão genes de BPV em células do sangue e sêmen de cavalos saudáveis por PCR e RT-PCR. Os BPV 1 e 2 foram encontrados no sangue de 20% dos cavalos avaliados e no sêmen 35% dos animais. A expressão da oncoproteína E5 foi verificada em 36% das amostras de sangue e em sêmen positivas para o BPV. No Capítulo VII, foram comparados dois sistemas de detecção de BPV por PCR, um com primers tipo específico e outro com primers consenso em lesões cutâneas e fuidos de bovinos. Os primers tipo específico para detecção de BPV mostraram-se mais sensíveis do que os primers consenso, além disso, através destes foi verificada a alta prevalência de co-infecções nas amostras estudadas. Porém, os primers consenso, amplificaram alta diversidade de BPV, e prováveis novos tipos de BPV nas amostras estudadas. Desta forma, os trabalhos oriundos desta tese, permitiram descrever a diversidade de BPV nas lesões cutâneas de bovinos do Brasil e um de seus prováveis mecanismos de ação, além disso, contribuem para fortalecer a hipótese de que os BPV são capazes de infectar tecidos não-epiteliais, através da verificação da presença e expressão de genes virais em células sanguíneas e do sêmen de bovinos e equinos. Os resultados obtidos nesta tese vêm contribuir para o melhor conhecimento de ferramentas moleculares que podem ser empregadas nos estudos de presença e caracterização do BPV nos diversos tecidos bovinos.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-10T17:37:33Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-MariaAngelicaSilva.pdf: 2202931 bytes, checksum: 9e64864a364b4356fa6e0609d9ae8aeb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-10T17:37:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-MariaAngelicaSilva.pdf: 2202931 bytes, checksum: 9e64864a364b4356fa6e0609d9ae8aeb (MD5) Previous issue date: 2012 / Os papilomavirus bovino (BPV) são oncovirus com DNA circular dupla fita e usualmente espécie-específico. Embora o BPV cause doenças de importância veterinária, o conhecimento sobre sua diversidade e biologia ainda é limitado. Esse trabalho objetivou estudar a biologia e diversidade da infecção por BPV em lesões cutâneas de bovinos e sítios não epiteliais de bovinos e equinos. No capítulo I, buscou-se avaliar a diversidade de PV em lesões cutâneas. Foram encontrados os BPV 1, 2, 3, 6 e o Papilomavírus associado ao sarcóide felino (FeSarPV) e a presença de co-infecções. No capítulo II, foram avaliados mecanismos etiopatogênicos em lesões papilomatosas induzidas por BPV. Foi observada a expressão da oncoproteína E5 em todos os fibropapilomas analisados e uma superexpressão da conexina 26 nos fibropapilomas, comparado com o tecido normal. No capítulo III, foi verificada a presença do DNA de BPV em espermatozoide e líquido seminal de sêmen comercial de touros e seu efeito na função espermática. O DNA do BPV2 foi encontrado em todas as amostras avaliadas, porém sem causar redução na função espermática. No Capítulo IV, foi avaliada a presença e expressão de BPV em sangue de bovinos sadios e afetados por papilomatose. Os BPV 1 e 2 foram encontrados em animais assintomáticos e com papilomatose assim como sua expressão. No Capítulo V, foi verificada a presença e expressão de BPV em sêmen fresco de touros saudáveis. O DNA de BPV2 foi encontrado em 35% das amostras e a expressão das proteínas E2 e E5 foi verificada em 55% das amostras de sêmen positivas para BPV2. No capítulo VI foi investigada a presença e expressão genes de BPV em células do sangue e sêmen de cavalos saudáveis por PCR e RT-PCR. Os BPV 1 e 2 foram encontrados no sangue de 20% dos cavalos avaliados e no sêmen 35% dos animais. A expressão da oncoproteína E5 foi verificada em 36% das amostras de sangue e em sêmen positivas para o BPV. No Capítulo VII, foram comparados dois sistemas de detecção de BPV por PCR, um com primers tipo específico e outro com primers consenso em lesões cutâneas e fuidos de bovinos. Os primers tipo específico para detecção de BPV mostraram-se mais sensíveis do que os primers consenso, além disso, através destes foi verificada a alta prevalência de co-infecções nas amostras estudadas. Porém, os primers consenso, amplificaram alta diversidade de BPV, e prováveis novos tipos de BPV nas amostras estudadas. Desta forma, os trabalhos oriundos desta tese, permitiram descrever a diversidade de BPV nas lesões cutâneas de bovinos do Brasil e um de seus prováveis mecanismos de ação, além disso, contribuem para fortalecer a hipótese de que os BPV são capazes de infectar tecidos não-epiteliais, através da verificação da presença e expressão de genes virais em células sanguíneas e do sêmen de bovinos e equinos. Os resultados obtidos nesta tese vêm contribuir para o melhor conhecimento de ferramentas moleculares que podem ser empregadas nos estudos de presença e caracterização do BPV nos diversos tecidos bovinos. / Bovine papillomavirus (BPV) are double-stranded circular DNA oncovirus and usually species-specific. Although BPV causes diseases of veterinary importance, knowledge about their biology and diversity is still limited. This study investigated the natural history of BPV infection in cattle and cutaneous epithelial sites of cattle and horses. In Chapter I, we sought to evaluate the diversity of PV in cutaneous lesions. We found BPV 1, 2, 3, 6 and papillomavirus associated with feline sarcoid (FeSarPV) and co-infections. In Chapter II, we detected the BPV DNA in sperm and seminal fluid of trade bull semen and its effect on sperm function. The DNA of BPV2 was found in all samples, without causing a reduction in sperm function. In Chapter III, we evaluated etiopathogenic mechanisms of BPV induced lesions. We observed the expression of E5 oncoprotein in all analyzed fibropapillomas and an overexpression of connexin 26 in fibropapillomas compared to normal tissue. In Chapter IV, we evaluated the presence and expression of BPV in blood of healthy and affected cattle by papillomatosis. The BPV 1 and 2 were found in asymptomatic and papillomatosisaffected animals as well as its expression. In Chapter V, we detected the presence and expression of BPV in fresh semen of healthy bulls. BPV2 DNA was found in 35% of samples and the expression of E2 and E5 proteins was found in 55% of BPV2- positive semen. In Chapter VI was investigated the presence and expression of BPV genes in blood and semen cells of healthy horses by PCR and RT-PCR. BPV 1 and 2 were found in 20% of blood horses and in 35% of semen evaluated. Expression of E5 oncoprotein was found in 36% of blood and semen samples positive for BPV. In Chapter VII, we compared two PCR methods for BPV detection in skin lesions and fluids: the use of BPV type-specific and consensus primers. The type-specific primers for detection of BPV were more sensitive than consensus primers and could detect co-infection of BPV in the samples. Consensus primers amplified a high diversity of BPV, and probable new BPV types in the samples studied. Thus, this thesis allowed describing the diversity of BPV in the skin lesions of Brazillian cattle and one of its possible mechanisms of action and also contributes to strengthen the hypothesis that BPV may infect non-epithelial sites, by verifying the presence and expression of viral genes in blood and semen cells of cattle and horses. The results obtained in this thesis contribute to a better understanding of molecular tools that can be employed in studies of presence and characterization of BPV in various bovine tissues.

Mais de 200 mutações patogênicas já foram descritas no gene que codifica a Cx26 (GJB2) que levam à surdez hereditária. A mais frequente destas mutações é a c.35delG. Ela é a principal causa de surdez não sindrômica com padrão de herança autossômico recessivo na população brasileira e em diversas populações do mundo. O genoma humano contém 21 diferentes genes de proteínas da família das conexinas que são expressos em diversos tecidos. Os canais comunicantes e hemicanais formados por conexinas facilitam a passagem de pequenos metabólitos entre as células adjacentes e entre a célula e o meio extracelular, promovendo a homeostasia celular. Este estudo teve o objetivo de avaliar os efeitos da mutação c.35delG em homozigose no gene GJB2 em SHEDs sobre a diferenciação celular e sobre a expressão das Cx26 (GJB2), Cx30 (GJB6), Cx31 (GJB3), Cx43 (GJA1) e Cx50 (GJA8) em SHEDs (Stem cells from human exfoliated deciduous teeth). Para isso, obtivemos linhagens de SHEDs a partir de 3 indivíduos portadores da mutação c.35delG em homozigose e de 3 indivíduos controle, sem a mutação. Nossos resultados indicaram que SHEDs portadoras da mutação apresentam maiores taxas de diferenciação em adipócitos e em osteócitos do que SHEDs de indivíduos controle. Por meio de RT-PCR, RT-PCR quantitativa e citometria de fluxo identificamos a expressão dos genes GJB2 (Cx26), GJB6 (Cx30) e GJA1 (Cx43) e suas respectivas proteínas, tanto em SHEDs dos indivíduos com a mutação como em SHEDs de indivíduos controle. Não há expressão dos genes GJA8 (Cx50) e GJB3 (Cx31) e suas respectivas proteínas em SHEDs. Por meio de RT-PCR quantitativa observamos aumento dos níveis de expressão do RNAm de GJA1 e redução de RNAm de GJB2 em SHEDs oriundas de pacientes com c.35delG, quando comparadas às de amostras controle. Resultados obtidos por meio de Western Blotting mostraram aumento de aproximadamente 50% na expressão da Cx43 corroborando os resultados obtidos por meio de RT-PCR quantitativo. Detectamos que a expressão da Cx26 em células de indivíduos com mutação é 50% menor do que em células de indivíduos controle. Os aumentos observados das taxas de diferenciação em adipócitos e em osteócitos podem estar relacionados ao aumento da expressão da Cx43. Sabe-se que a Cx43 possui importante papel na manutenção de pré-adipócitos durante a fase de expansão clonal na adipogênese. A Cx43 também está relacionada à sinalização celular nas vias de proliferação e diferenciação durante a osteogênese. Indivíduos portadores da mutação c.35delG apresentam surdez sem outros fenótipos associados sugerem que ocorra redundância funcional entre as conexinas. Além disso, o aumento da expressão de GJA1 (Cx43) nas SHEDs oriundas dos indivíduos surdos com a mutação c.35delG falam a favor da existência de um mecanismo de regulação compensatório a ser esclarecido, que aumenta a síntese de Cx43 na redução ou ausência da Cx26 funcional / More than 200 patogenic mutations in the connexin 26 gene (GJB2) were associated to deafness. The most frequent is the c.35delG mutation, which is the most common cause of nonsydromic recessive hearing loss in the Brazilian population, and also in several populations in the world. The human genome contains 21 genes that comprise the gene family of the connexins, expressed in many different tissues. Connexins are components of gap junctions and hemichannels, which facilitate the transference of small metabolites between cells and between cells and the extracelular medium. The aim of this study was to investigate the effects of the c.35delG mutation on adipogenesis, chondrogenesis and osteogenesis, and also its effects on mRNA and protein expression related to Cx26 (GJB2), Cx30(GJB6), Cx31 (GJB3), Cx43 (GJA1) and Cx50 (GJA8) in SHEDs (stem cells from human exfoliated deciduous teeth). For this purpose, 3 SHED lines from patients with c.35delG mutation in homozygosis and 3 lines from individuals without mutation were established. We observed that the rates of induced differentiation into adipocytes and osteocytes were higher in SHEDs from individuals with the c.35delG mutation than in SHEDs from control individuals. By RT-PCR, real time RT-PCR and flow cytometry were detected the expression of GJB2, GJB6 and GJA1 genes and their respective proteins Cx26, Cx30 and Cx43 in SHEDs from control samples and in SHEDs with the mutation. The expression of GJA8 (Cx50) and of GJB3 (Cx31) were not detected in SHEDS from both groups. Quantitative gene expression analysis using real-time RT-PCR revealed significantly elevated levels of GJA1 mRNA expression and decreased GJB2 mRNA expression in cells from patients with c.35delG, when compared to cells from normal controls. Western Blotting analysis showed an increase of about of 50% of the protein Cx43 in cells with c.35delG mutation, in comparison to cells from normal controls, in accordance with the real-time RT-PCR results. We detected that Cx26 protein expression in samples with c.35delG mutation is approximately 50% lower than in SHEDs from normal controls. The observed increase in differentiation rates related to adipogenesis and osteogenesis may be explained by the higher levels of Cx43 expression. This is supported by the fact that Cx43 was reported to play an important role in the maintenance of pre-adipocytes during clonal expansion and it was also related to cell signaling pathways in proliferation and differentiation during osteogenesis. Individuals with c.35delG in homozygosis present only deafness, without other symptoms, which suggests that functional redundancy between connexins may exist. The increase of Cx43 expression in SHEDs from deaf patients with c.35delG mutation found by us may be related to a compensation mechanism to be clarified, which results in increase of the production of Cx43 when functional connexin Cx26 is reduced or absent

A causa mais frequente de surdez de herança autossômica recessiva são as mutações no lócus DFNB1, onde estão os genes GJB2 e GJB6. Dentre os indivíduos com deficiência auditiva associada a esse lócus, 10% a 50% apresentam uma única mutação recessiva no gene GJB2, frequência muito superior à esperada em função da frequência de heterozigotos na população geral. Apesar de alguns desses casos terem sido elucidados após a identificação de grandes deleções no gene GJB6 ou nas suas proximidades, a existência de muitos indivíduos com uma única mutação patogênica no gene GJB2 sugere que a haplo-insuficiência nesse gene possa interagir com outras mutações no mesmo gene, no gene GJB6 vizinho, ou até em outros genes. O objetivo desse estudo foi identificar novos alelos patogênicos, novas proteínas e novos genes que interagem com o lócus DFNB1, do ponto de vista molecular e celular, e que possam ser responsáveis por surdez de herança autossômica recessiva. Desse modo, pretendemos contribuir para o esclarecimento da patogênese da surdez de herança autossômica recessiva. Nesse trabalho, três tipos de estudos foram realizados, com metodologias próprias. Na primeira parte, buscamos identificar novos alelos patogênicos no lócus DFNB1 que poderiam ser responsáveis por surdez quando presentes em heterozigose composta com outros alelos patogênicos nos genes GJB2 e GJB6. Foi realizada a análise do DNA de 16 pacientes surdos portadores de uma única mutação patogênica em um desses dois genes por meio: (i) do sequenciamento das regiões codificadora, promotora e doadora de splicing (intron 1) do gene GJB2, (ii) da triagem de uma deleção de 200 kb localizada a 130 kb da proximidade distal da região 5\' do gene GJB6 e (iii) da pesquisa de variações no número de cópias de um ou mais exons dos genes GJB2, GJB6, GJB3 e WFS1 por MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Detectamos uma segunda mutação provavelmente patogênica em dois dos 16 pacientes heterozigotos: em um deles, a mutação p.L76P (c.C227T) foi identificada na região de código do gene GJB2 e foi por nós descrita pela primeira vez; no segundo caso, uma duplicação (0,4-1,2Kb) que inclui a região de código do gene GJB2 foi detectada, também inédita na literatura. Na segunda parte, tivemos como objetivo obter um modelo experimental para estudos funcionais in vitro da proteína codificada pelo gene GJB2, a conexina 26, em seu local de expressão que são as células de suporte do órgão de Corti. Padronizamos o cultivo in vitro de células progenitoras do órgão de Corti de camundongos e de cobaias e conseguimos obter a diferenciação in vitro das otoesferas dos camundongos em células que expressam marcadores de células ciliadas (Miosina VIIa e Jagged2) e de células de suporte (p27kip e Jagged1). Por fim, na terceira parte, buscamos por proteínas que interagem com a conexina 26 por meio de ensaios de precipitação por afinidade. Para isso, produzimos clones recombinantes de uma proteína de fusão GST-Cx26 e de uma proteína controle (GST), e realizamos sua expressão in vitro em bactérias E.coli B21. Ensaios de precipitação por afinidade entre a proteína de fusão GST-Cx26 ou GST sozinha e proteínas extraídas de cérebro ou fígado de camundongos foram realizados em diferentes condições. A identificação e a análise das proteínas presentes em bandas de SDS-PAGE, obtidas no ensaio de precipitação com a proteína de fusão GST-Cx26 e ausentes no ensaio com a GST, foram realizadas por espectrometria de massas. Identificamos um total de 49 proteínas candidatas a interagirem com a região C-terminal da Cx26. Realizamos diversas análises in silico e em literatura específica e após exclusão de candidatas por: (i) redundância de representação no ensaio GST-Cx26, (ii) diferença entre a massa molecular esperada e a obtida, (iii) precipitação inespecífica e (iv) localização subcelular incompatível com a conexina 26, selecionamos um total de 22 proteínas candidatas a interagirem com a região C-terminal da conexina 26, para estudos futuros. A confimação da interação entre essas 22 proteínas e a conexina 26 é desejável por meio de estudos de co-localização e imuno-coprecipitação / The most frequent causes of nonsyndromic recessive hearing loss are mutations in locus DFNB1, in the GJB2 and GJB6 genes. Among the individuals with hearing loss with mutations in this locus, 10% to 50% present a single recessive mutation in the GJB2 gene, frequency much higher than expected taking into account the frequency of heterozygotes in the general population. Although some of these cases have been elucidated after the identification of large deletions in GJB6 or its surrounding regions, the existence of many individuals with a single pathogenic mutation in the GJB2 gene suggests that haplo-insufficiency of this gene may interact with other types of mutations in the same gene, in the neighbor gene GJB6, or even in other genes. The aim of this study was to identify new pathogenic alleles, proteins and genes that interact with the locus DFNB1, from the molecular and cellular perspective, and that may be responsible for autosomal recessive deafness. Thus, we aimed to contribute to the understanding of the pathogenesis of autosomal recessive deafness. In this work, three different types of studies were performed, each one with a particular methodology. In the first part, we searched for new pathogenic alleles in the locus DFNB1 that could be responsible for deafness, when present in compound heterozygosis with other pathogenic alleles in GJB2 and GJB6 genes. We performed DNA analysis in samples from 16 deaf patients, carriers of a single pathogenic mutation in one of these two genes by: (i) sequencing the coding, promoter and splice donor (intron 1) regions of the GJB2 gene, (ii) screening for a deletion of 200 kb located 130 kb upstream from GJB6 gene and (iii) investigating copy number variations in of one or more exons of the genes GJB2, GJB6, GJB3 and WFS1 by MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). We detected a second mutation, probably pathogenic, in two of the 16 heterozygous patients: in one case, the p.L76P (c.C227T) mutation was identified in the coding region of the GJB2 gene and was firstly described by us; in the second case, a novel duplication (0.4 - 1.2 Mb) that includes the coding region of the GJB2 gene was detected. In the second part, our objective was to obtain an experimental model for in vitro functional studies of the protein encoded by the GJB2 gene, connexin 26, in its site of expression, that is, in the supporting cells of the organ of Corti. We standardized the culturing of guinea pigs and mice progenitor cells of organ of Corti. We were also able to induce differentiation of mice\'s otospheres into cells that express markers of hair (myosin VIIa and Jagged2) and supporting cells (p27kip and Jagged1). Finally, we searched for connexin 26 interacting proteins by pull-down assays. Recombinant clones expressing a fusion protein GST-Cx26 and a control protein (GST) were produced, so that in vitro expression in E. coli B21 could be performed. Pull-down experiments, perfomed with fusion protein GST-Cx26 or GST alone, and with proteins from mice brain or liver extracts were done under several different conditions. The identification and analysis of proteins present in SDS-PAGE bands in experiments performed with the fusion protein GST-Cx26, and absent in the GST assay, were performed by mass spectrometry. We identified a total of 49 candidate proteins for interaction with the C-terminal region of Cx26. In silico analyses performed in several databases and search in the literature allowed exclusion of candidates by: (i) redundancy of representation in the GST-Cx26 experiments; (ii) discrepancy between the expected and the obtained molecular weight; (iii) nonspecific precipitation and (iv) subcellular localization incompatible with connexin 26 localization. Summing up, we selected a total of 22 candidate proteins to interact with the C-terminal region of connexin 26. Confirmation of the interaction between these proteins and connexin 26 is planned to be performed by co-localization studies and by immuno-coprecipitation

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vaniapiatto_tese.pdf: 1479841 bytes, checksum: 96e04c84851d635167398b1a4196d2fe (MD5) Previous issue date: 2003-11-28 / Mutações no gene que codifica a proteína conexina 26 têm contribuído para a maioria das deficiências auditivas pré-lingual, sensorioneural não-sindrômicas recessivas. Uma mutação específica, a 35delG, é a mais freqüente das mutações detectadas no gene GJB2 nos vários grupos étnicos estudados. O objetivo foi determinar a prevalência de mutações no gene GJB2 em pacientes com deficiência auditiva sensorioneural não sindrômica, do Serviço de Otorrinolaringologia da FAMERP, em São José do Rio Preto, SP. Trinta e três casos-índice foram avaliados por exames fisico e complementares para excluir formas sindrômicas e causas ambientais da deficiência auditiva e, pela reação em cadeia da polimerase alelo-específico (AS-PCR) para a detecção da mutação 35delG. Os pacientes heterozigotos para a mutação 35delG e aqueles que não tiveram a mutação detectada foram submetidos, posteriormente, ao PCR para detecção da mutação A(GJB6-D 1381830) e ao sequenciamento automático direto para análise da região codificante do gene GJB2. A mutação 35delG foi detectada em 27,3% dos casos-índice (9/3 3) ou em 2 1,2% dos alelos (14/66). A mutação A(GJB6-DI3SI 830) foi encontrada em um (3,0%) caso-índice heterozigoto 35delG. O seqüenciamento direto nos casos-índice heterozigotos identificou um paciente (3,0%) com as mutações 35delG/V3 71. As mutações no gene GJB2 são responsáveis por mais de um quarto das deficiências auditivas sensorioneural não-sindrômica na população do estudo e, o teste PCR alelo-específico (AS-PCR) é um método fácil para rastreamento da mutação 35delG e os resultados positivos podem estabelecer o diagnóstico etiológico e aconselhamento genético nos pacientes afetados.