L'inhibidor de carboxipeptidasa de patata (PCI) és un antagonista de l'EGF. Un dels problemes del PCI, però, és la baixa afinitat per l'EGFR en comparació amb el lligand natural. En aquest treball s'han dissenyat nous bloquejadors de la via ErbB partint de l'estructura de l'EGF per tal d'augmentar l'afinitat d'unió. S'ha determinat que les variants tenen reduïda la capacitat d'activació del receptor però segueixen promovent la proliferació cel·lular. Tot i així, s'ha obtingut una variant, l'EGF Truncat, que tot i no estar correctament plegada, és la que ofereix uns millors. També s'ha dut a terme un tractament combinat entre el PCI i un inhibidor de tirosin quinases d'aquesta mateixa via, l'Iressa. Els resultats han posat de manifest que hi ha un antagonisme entre els dos tractaments. Aquesta és la primera vegada que s'associa de forma directa un tipus de tractament amb una resistència associada a l'activació de la producció autocrina de lligands, i representa un avenç molt important en la recerca oncològica. / Potato carboxypeptidase inhibitor (PCI) is an EGF antagonist. One of the main problems of PCI is its low affinity for EGFR in comparison to the natural ligand. In this study, blockers of the ErbB pathway have been designed taking as a model the EGF structure, in order to increase binding affinity. It has been observed that the variants have less ability to activate the receptor but they still promote cell proliferation. Nevertheless, the variant called Truncated EGF, although being unfolded, is the one that shows best perspectives.A combined treatment using PCI and a tyrosine kinase inhibitor of the same pathway, Iressa, has also been carried out. Results have shown that there is an antagonism between both treatments. This is the first time that a treatment is associated to resistance involving autocrine loop activation of ligands, and it represents a very important finding in the oncologic research.

In this work we report that potato carboxypeptidase inhibitor suppresses the growth of several human and mouse pancreatic adenocarcinoma cell lines. The inhibitor also reduces the growth of solid tumors obtained by subcutaneous injection of human adenocarcinoma cell line in nude mice and the appearance of metastasis in mice injected intraesplenically with B16H10 melanoma cells. A transgenic line has been characterized, mice develop choroid plexus carcicomas and insulinomas. Lifespan of animals immunized with PCI I s significantly higher than control mice. To further characterize the effects of PCI on tumor cell growth, analyses of cell cycle phase distribution have been performed. A significant increase in the G0/G1 phase is also detected. This finding is correlated with an increase in the mRNA expression of p53. Moreover, we have demonstrated that PCI is easily internalized by the cells and the inhibitor remain altered after the internalization / En el presente trabajo se ha demostrado que el inhibidor de carboxipeptidasa de patata (PCI) tiene un efecto inhibitorio sobre el crecimiento tumoral tanto in vitro como in vivo, y se ha estudiado su mecanismo de acción, lo que ha llevado a descubrir que el PCI es un antagonista del EGF. Con dicho fin se han utilizado técnicas de cultivo celular en conjunción con técnicas bioquímicas, de biología molecular, de análisis computacional y ensayos con modelos animales / En el present treball s’ha demostrat que l’inhibidor de carboxipeptidasa de patata (PCI) té un efecte inhibitori sobre el creixement tumoral tant in vitro com in vivo i s’ha estudiat el seu mecanisme d’acció, que ha permès descobrir que el PCI és un antagonista de l’EGF. Amb aquest fi s’han utilitzat tècniques de cultiu cel·lular amb tècniques bioquímiques, de biologia molecular, d’anàlisi computacional i assajos amb models animals

Tesis por compendio / [ES] En el contexto actual de cambio climático, resulta urgente desarrollar nuevas tecnologías de fitomejoramiento que garanticen el suministro de alimentos a una población en rápido crecimiento. La reciente aparición de herramientas basadas en las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (del acrónimo CRISPR en inglés) y sus proteínas asociadas (Cas) ha revolucionado la edición genómica dirigida, resultando muy prometedora tanto para la biología vegetal básica como para la mejora de cultivos. Los sistemas CRISPR-Cas más comunes incluyen una endonucleasa Cas y un ARN guía que determina específicamente la secuencia diana a editar en el genoma. El suministro de los componentes de reacción CRISPR-Cas a una célula vegetal es un paso crucial que influye notablemente en la velocidad y la eficiencia de edición. Los enfoques convencionales se basan en el suministro de dichos componentes mediante tecnologías de transformación o la expresión transitoria en protoplastos, siendo ambos procesos laboriosos que pueden acarrear problemas legales. Alternativamente, estudios recientes han destacado el potencial de virus de ARN para ser utilizados como vectores de expresión transitoria de los componentes de reacción CRISPR-Cas en plantas, también conocido como edición genómica inducida por virus (VIGE en inglés). Puesto que la aplicabilidad de cada vector viral se encuentra limitada por sus propiedades moleculares y un rango específico de plantas huésped, esta Tesis ha tenido como objetivo principal expandir y mejorar las herramientas disponibles para el VIGE. En primer lugar, diseñamos un vector derivado del Virus X de la patata (PVX; género Potexvirus; familia Alphaflexiviridae) para suministrar múltiples ARNs guía a una línea transformada de Nicotiana benthamiana que expresaba constitutivamente la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes. Mediante el vector derivado de PVX, conseguimos editar genes endógenos de la planta huésped de manera eficiente, IV produciendo casi un 80% de modificaciones en tejidos de plantas adultas. Curiosamente, PVX permitió la expresión simultánea de matrices de ARNs guía no espaciados, lo cual resultó en la edición de múltiples genes en pocos días. Obtuvimos progenies editadas con una alta tasa de mutaciones bialélicas hereditarias tanto de plantas regeneradas a partir de tejido infectado como de semillas de plantas infectadas; en este último caso, el ARN guía fue previamente fusionado a un módulo de ARN móvil. Dado que PVX no se transmite por semillas, todas las plántulas editadas estaban libres de virus. A fin de expandir las estrategias basadas en virus de plantas para una edición genómica sin transformación, seguidamente desarrollamos un sistema de dos vectores virales compatibles para el suministro simultáneo de todos los componentes de reacción CRISPR-Cas en la planta. Modificamos el Virus del grabado del tabaco (TEV; género Potyvirus; familia Potyviridae) para que expresase una nucleasa Cas12a y, en combinación con el envío de ARN guía mediante PVX, logramos la edición sin transformación de una línea de N. benthamiana que expresaba constitutivamente la NIb del potyvirus. Además, demostramos que un único vector PVX era capaz de proporcionar la actividad de NIb, así como de suministrar el ARN guía para la edición genómica en plantas silvestres. En conjunto, el trabajo realizado en esta Tesis contribuye a la expansión de las herramientas actuales para VIGE. La amplia gama de huéspedes que poseen tanto PVX como TEV, particularmente entre solanáceas, postula a ambos virus como candidatos muy prometedores para futuras aplicaciones en genómica funcional y mejora de cultivos. / [CA] En el context actual de canvi climàtic, resulta urgent desenvolupar noves tecnologies de fitomillorament que garantisquen el subministrament d'aliments a una població en ràpid creixement. La recent aparició d'eines basades en les repeticions palindròmiques curtes agrupades i regularment interespaiades (de l'acrònim CRISPR en anglés) i les seues proteïnes associades (Cas) ha revolucionat l'edició genòmica dirigida, resultant molt prometedora tant per a la biologia vegetal bàsica com per a la millora de cultius. Els sistemes CRISPR-Cas més comuns inclouen una endonucleasa Cas i un ARN guia que determina específicament la seqüència diana a editar en el genoma. El subministrament dels components de reacció CRISPR-Cas a una cèl·lula vegetal és un pas crucial que influeix notablement en la velocitat i l'eficiència d'edició. Els enfocaments convencionals es basen en el subministrament d'aquests components mitjançant tecnologies de transformació o l'expressió transitòria en protoplasts, sent tots dos processos laboriosos que poden implicar problemes legals. Alternativament, estudis recents han destacat el potencial de virus d'ARN per a ser utilitzats com a vectors d'expressió transitòria dels components de reacció CRISPR-Cas en plantes, també conegut com a edició genòmica induïda per virus (VIGE en anglés). Com que l'aplicabilitat de cada vector viral es troba limitada per les seues propietats mol·leculars i un rang específic de plantes hoste, aquesta Tesi ha tingut com a objectiu principal expandir i millorar les eines disponibles per al VIGE. En primer lloc, dissenyem un vector derivat del Virus X de la creïlla (PVX; gènere Potexvirus; família Alphaflexiviridae) per a subministrar múltiples ARNs guia a una línia transformada de Nicotiana benthamiana que expressava constitutivament la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes. Mitjançant el vector derivat de PVX, aconseguim editar gens endògens de la planta hoste de manera eficient, produint quasi un 80% de modificacions en teixits de plantes adultes. Curiosament, PVX va permetre l'expressió VI simultània de matrius d'ARNs guia no espaiats, la qual cosa va resultar en l'edició de múltiples gens en pocs dies. Vam obtindre progènies editades amb una alta taxa de mutacions bial·lèliques hereditàries tant de plantes regenerades a partir de teixit infectat com de llavors de plantes infectades; en aquest últim cas, l'ARN guia va ser prèviament fusionat a un mòdul d'ARN mòbil. Atés que PVX no es transmet per llavors, totes les plàntules editades estaven lliures de virus. A fi d'expandir les estratègies basades en virus de plantes per a una edició genòmica sense transformació, seguidament desenvolupem un sistema de dos vectors virals compatibles per al subministrament simultani de tots els components de reacció CRISPR-Cas en la planta. Modifiquem el Virus del gravat del tabac (TEV; gènere Potyvirus; família Potyviridae) perquè expressara una nucleasa Cas12a i, en combinació amb l'enviament d'ARN guia mitjançant PVX, aconseguim l'edició sense transformació d'una línia de N. benthamiana que expressava constitutivament la NIb del potyvirus. A més, vam demostrar que un únic vector PVX era capaç de proporcionar l'activitat de NIb, així com de subministrar l'ARN guia per a l'edició genòmica en plantes silvestres. En conjunt, el treball realitzat en aquesta Tesi contribueix a l'expansió de les eines actuals per a VIGE. L'àmplia gamma d'hostes que posseeixen tant PVX com TEV, particularment entre solanàcies, postula a tots dos virus com a candidats molt prometedors per a futures aplicacions en genòmica funcional i millora de cultius. / [EN] Innovative breeding technologies are urgently needed to ensure food supply to a rapidly growing population in the face of climate change. The recent emergence of tools based on the clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated (Cas) proteins has revolutionized targeted genome editing, thus holding great promise to both basic plant science and precision crop breeding. Most common CRISPR-Cas arrangements include a Cas endonuclease and a single guide RNA (sgRNA) that determines the specific target sequence to edit in the genome. The delivery of CRISPR-Cas reaction components within a plant cell is a crucial step that greatly influences editing speed and efficiency. Conventional approaches rely on supplying editing reaction components by transformation technologies or transient delivery to protoplasts, both of which are laborious processes that can raise legal concerns. Alternatively, recent studies have highlighted the potential of plant RNA viruses as transient delivery vectors of CRISPR-Cas reaction components, following the so-called virus-induced genome editing (VIGE). Since the applicability of each viral vector is limited to its molecular biology properties and a specific host range, the main objective of this Thesis has been to expand and improve the available toolbox for VIGE. First, we engineered a vector derived from Potato virus X (PVX; genus Potexvirus; family Alphaflexiviridae) to deliver multiple sgRNAs in a Nicotiana benthamiana transformed line constitutively expressing Streptococcus pyogenes Cas9. Using the PVX derived vector, host endogenous genes were efficiently targeted, producing nearly 80% indels in the tissues of adult plants. Interestingly, PVX allowed the simultaneous expression of unspaced sgRNA arrays, achieving highly efficient multiplex editing in a few days. We obtained edited progeny with a high rate of heritable bi-allelic mutations either from plants regenerated from infected tissue or infected plant seeds; in the latter II case, the sgRNA was previously fused to a mobile RNA module. Hence, since PVX is not seed-transmitted, all edited seedlings were virus-free. Aiming to expand the virus-based toolbox for transformation-free editing, we next developed a two-compatible virus vector system for the simultaneous delivery of all CRISPR-Cas reaction components in the plant. Tobacco etch virus (TEV; genus Potyvirus; family Potyviridae) was engineered to express a Cas12a nuclease, and in combination with PVX-assisted sgRNA delivery, we achieved successful transformation-free genome editing in a N. benthamiana line constitutively expressing potyviral NIb. Moreover, we demonstrated that a single PVX vector can supply the potyviral NIb activity as well as perform sgRNA delivery for genome editing in wild-type plants. Altogether, the work performed in this Thesis contributes to the enrichment of the current VIGE toolbox. The wide host range that both PVX and TEV possess, particularly among solanaceous species, postulates them as promising candidates for future applications in VIGE-mediated functional genomics and precision breeding. / Uranga Ruiz De Eguino, M. (2022). Engineering Viral Vectors for CRISPR-Cas Mediated Genome Editing in Plants [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/183374 / Compendio

Tesis por compendio / [ES] La polilla guatemalteca de la papa, Tecia solanivora, es una plaga invasora originaria de Guatemala desde donde se extendió a lo largo de Centro y Sudamérica, llegando a las Islas Canarias en 1999, y alcanzando la España peninsular en 2015. Si bien en la península Ibérica se encuentra en proceso avanzado de erradicación, en el archipiélago canario ya se ha establecido y se asume que su erradicación no es posible. El manejo de Tecia solanivora es muy complejo debido a que pasa la mayor parte de su ciclo biológico bajo el suelo, protegida en el interior del tubérculo, quedando completamente expuesta solo la polilla adulta. Para la gestión de la plaga se aplican habitualmente medidas culturales durante el ciclo vegetativo, que se combinan con el uso de trampas de feromonas, contribuyendo estas medidas a reducir pérdidas en la cosecha, no obstante, estas siguen siendo económicamente inaceptables. Además, existe una carencia de productos fitosanitarios suficientemente eficaces en campo y la ausencia de productos autorizados para su uso en almacenes. De no ejecutar ninguna estrategia de gestión de la plaga, las pérdidas en las cosechas pueden alcanzar alrededor del 50% en campo y del 100% en almacén. En este contexto, la búsqueda de enemigos naturales para la gestión integrada de la plaga ha cobrado especial relevancia. Particularmente, son interesantes los organismos oófagos, como los estudiados en el presente trabajo, los parasitoides de huevos, Trichogramma achaeae, Trichogramma euproctidis y el ácaro depredador Blattisocius tarsalis, que permiten eliminar la plaga antes que se produzca la eclosión de los huevos, hecho que resulta trascendental, dado que una vez se produce la emergencia de la larva, esta migra hacia el interior del suelo y penetra en los tubérculos resultando muy difícil su eliminación. Por lo tanto, estos agentes de biocontrol eliminan la plaga antes de que las patatas resulten dañadas. En el presente trabajo se aplicó una metodología para realizar un proceso de evaluación para ambas especies de Trichogramma con el objetivo de seleccionar la mejor en tres contextos, laboratorio, semicampo y semialmacén y el ácaro depredador bajo condiciones de laboratorio, semialmacén y almacén. Los resultados revelaron que si bien, T. euproctidis mostró muy buen potencial en los estudios preliminares de laboratorio tanto para condiciones de campo como de almacén, los experimentos de semicampo y semialmacén indicaron que no es un buen agente de control biológico para Tecia solanivora debido a su escasa capacidad para localizar sus huevos. En contraposición, T. achaeae, aunque mostró una eficacia más baja en condiciones de laboratorio, dio resultados prometedores en condiciones de semicampo. Estos resultados confirman la importancia de probar los agentes de biocontrol en condiciones de semicampo o semialmacén antes de dar el paso a condiciones de campo o almacén, dado que basarse solo en resultados positivos de laboratorio podría llevar decisiones incorrectas y una perdida innecesaria de esfuerzos y recursos. En el caso de B. tarsalis, se obtuvieron resultados óptimos en todas las etapas de selección, por lo que fue probado en almacén experimental donde se mostró como un buen agente de control de la polilla guatemalteca de la papa. En este sentido, se deberán continuar las investigaciones a fin de mejorar las liberaciones (densidades y número), y evaluar su uso en otros sistemas de almacenaje. Finalmente, se requerirá un estudio de su viabilidad económica teniendo en cuenta el coste de la cría masiva. Es importante señalar que el uso de agentes de control biológico, como el parasitoide T. achaeae y el ácaro B. tarsalis serán solo dos de las herramientas disponibles para el control integrado de la plaga. En condiciones de campo, las medidas culturales y el trampeo deben mantenerse para reducir las poblaciones de adultos y las puestas de huevos. Así mismo, en almacén las inspecciones visuales y el cribado de patatas infestadas / [CA] L'arna guatemalenca de la creïlla, Tecia solanivora és una plaga invasora originària de Guatemala des d'on es va disseminar al llarg de Centre i Sud-amèrica, arribant a les Illes Canàries el 1999 I alcançant l'Espanya peninsular el 2015. Tot i que en la península Ibèrica es troba en procés avançat d'erradicació, en l'arxipèlag canari ja s'ha establit i es considera que l'erradicació no és possible. La gestió de Tecia solanivora es molt complexa degut a que pasa la major part del cicle vital davall del sòl, refugiada en l'interior del tubèrcle, només la fase adulta está completament exposta. Per al maneig de la plaga, habitualment s'apliquen mesures culturals durant tot el cicle vegetatiu, que es combinen amb l'ús de paranys de feromones, contribuint les esmentades mesures a reduir pèrdues en la collita. Tanmateix, estes continuen sent econòmicament inassumibles. A més ens trobem amb una carència de productes fitosanitaris per al camp prou eficaços i amb l'absència de productes autoritzats en l'àmbit dels magatzems. De portar-se a terme cap estratègia de gestió de la plaga, les pèrdues en la collita poden suposar al voltant del 50% al camp i del 100% als magatzems. En este context, la recerca d'enemics naturals per a la gestió integrada de la plaga ha cobrat especial rellevància. Particularment, són interessants els organismes oòfags, com els estudiats en el present treball, els parasitoides Trichogramma achaeae, Trichogramma euproctidis i l'àcar depredador Blattisocius tarsalis, que permeten eliminar la plaga abans que es produïsca l'eclosió dels sous, fet que resulta transcendent, donat que una vegada es produeix l'emergència de la larva, esta migra cap a l'interior del sòl i penetra en els tubercles resultant molt difícil la seua eliminació. Per tant, estos organismes de biocontrol eliminen la plaga abans que les creïlles resulten danyades. En el present treball es va aplicar una metodologia per realitzar un procés d'avaluació per ambdós espècies de Trichogramma, amb l'objectiu de seleccionar la millor, en els tres contextos, laboratori, semicamp i semimagatzem, I l'àcar depredador sota condicions de laboratori, semimagatzem i magatzem. Els resultats van revelar que si bé, T. euproctidis, mostrà molt bon potencial en els estudis preliminars de laboratori tant per a condicions de camp com de magatzem, els experiments de semicamp i semimagatzem van indicar que no es un bon agent de control biològic per a T. solanivora donada la seua escassa capacitat de trobar els ous. En contraposició, T. achaeae, encara que va mostrar una eficàcia baixa en condicions de laboratori, es va mostrar prometedors en condicions de semicamp. Estos resultats il·lustren la importància de provar els agents de biocontrol en condicions de semicamp o semimagatzem abans de fer el pas a condicions de camp o magatzem, basar-se solament en resultats de laboratori podria suposar la presa de decisions incorrectes amb una pèrdua d'esforços i recursos. En el cas de B. tarsalis, s'obtingueren resultats òptims en totes les etapes de selecció, i per això va ser provat en magatzem experimental on es va mostrar com un bon agent de control de l'arna guatemalenca de la creïlla. En este sentit, s'han de continuar les investigacions amb l'objectiu de millorar els alliberaments (densitats i número), i avaluar el seu ús en altres sistemes d'emmagatzematge. Finalment, es requerirà l' estudi de la seua viabilitat econòmica tenint en compte el cost de la cria massiva. És important assenyalar, que l'ús d'agents de control biològic, com el parasitoide T. achaeae i l'àcar B. tarsalis seran sols dos de les eines disponibles per al control integrat de la plaga. En condicions de camp, les mesures culturals i la instal·lació de parany deuen mantindre's pe reduir les poblacions d'adults i les postes d'ous. Així mateix, en magatzem les inspeccions visuals i el rebuig de creïlles infestades deuen mantindre's. / [EN] The Guatemalan potato moth, Tecia solanivora, is an invasive species. It is native to Guatemala, from where it spread to Central and South America, arriving in the Canary Islands in 1999 and reaching mainland Spain in 2015. Although it is in the process of being eradicated from the Iberian Peninsula, it is established in the Canary Islands and is not considered eradicable. The management of T. solanivora is very complex. Almost its entire biological cycle takes place under the soil and inside the tuber, which protects the pest, and only the adult stage is exposed. If no management strategies are applied, crop losses can reach around 50% in the field and 100% in storage. Cultural measures aim to reduce the pest population in the field during the growing, are combined with pheromone traps to prevent crop losses. However, pest damage often results in unacceptable economic losses. In addition, there is currently a lack of enough effective phytosanitary treatments that can be used in the field or approved for storage. In this situation, research into biological control agents has become particularly important. In this context, the study of oophagous natural enemies such as T. achaeae, T. euproctidis and B. tarsalis is of particular interest for the biological control of the Guatemalan potato moth, as they prevent the eggs from hatching. Once the eggs hatch, the larvae migrate to the soil, making it difficult to remove them before they enter the tubers where they are protected. The use of oophagous biocontrol agents therefore removes the pest before the potatoes are damaged. Experimental methodology was applied to evaluate both Trichogramma species to select the best in three biocontrol contexts, laboratory, semi-field and semi-storage, and the predatory mite B. tarsalis under laboratory, semi-field and storage conditions. Although T. euproctidis showed good preliminary results in laboratory studies for both field and storage conditions, semi-field and semi-storage trials suggest that it is not a good biocontrol agent due to its poor ability to locate T. solanivora eggs. In contrast, T. achaeae, although less effective than T. euproctidis under laboratory conditions, proved to be a promising control agent under field conditions. These results highlight the importance of testing natural enemies under semi-field/semi-storage conditions prior to field or storage testing. Indeed, selecting biocontrol agents on the basis of positive laboratory test results alone could lead to wrong decisions and unnecessary expenditure of effort and resources. In the case of B. tarsalis, which has been shown to be a good biocontrol agent in experimental storage, there is a need to improve mite releases (density of mites per release and number of releases) and evaluations in the field. It is important to note that the use of biological control agents, such as the parasitoid T. achaeae and the mite B. tarsalis, are only two of the tools available for integrated pest management. Under field conditions, cultural measures and trapping must be maintained to reduce adult populations and egg laying. In storage, visual inspection and screening of infested potatoes should also be maintained. / Gavara Vidal, J. (2024). Evaluation and selection of biological control agents for the integrated management of the Guatemalan potato moth, Tecia solanivora [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/207355 / Compendio