Débutée en 2005, l'ère du pangénome a connu un important essor ces dernières années, notamment grâce aux progrès des techniques de séquençage haut débit. Le pangénome, qui est divisé en deux grandes parties, le core génome et le génome accessoire, offre un grand éventail d'utilisation. Au cours de ces trois dernières années, nous avons étudié cette gamme de possibilités en nous basant sur des pathogènes humains tel que Coxiella burnetii, Kingella kingae et Bacillus anthracis. Ainsi, outre la découverte d'une nouvelle espèce de Kingella et l'étude de quelques génomes spécifiques, nous nous sommes attardés sur le lien entre pangénome et pathogénicité, sur l'importance des SNPs (Single Nucleotide Polymorphism), ainsi que sur la corrélation entre pangénome et taxonomie et donc, par extension, nous avons étudié la notion d'espèce bactérienne. / The pangenome area began in 2005 and had known a huge increase thanks to the improvement of the Next Generation Sequencing methods. The pangenome, which is divided into two parts, the core and the accessory genome, offer a large panel of uses. During the last three years, we have studied all these possibilities. We based our work on human pathogens as Coxiella burnetii, Kingella kingae and Bacillus anthracis. Thus, in addition to the discovery of a new Kingella species and the study of some specific genomes, we studied in details the link between pangenome and pathogenicity, the importance of SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) and the correlation between pangenome and taxonomy. Finally, we worked on the bacterial species definition.

La pathogénicité des bactéries a toujours été attribuée à des facteurs de virulence et les bactéries pathogènes sont considérées comme étant mieux armées, comparé à des bactéries ne provoquant pas de maladies. Selon les premières études génomiques, le fait de supprimer un certain nombre de gènes des bactéries pathogènes, limiterait leur capacité à infecter leurs hôtes. Au contraire, des études de génomique comparatives récentes, démontrent que la spécialisation des bactéries dans les cellules eucaryotes est associée à une perte de gènes massive, en particulier pour les endosymbiontes allopatriques qui sont isolés depuis longtemps dans une niche intracellulaire. En effet, les bactéries sympatriques, extracellulaires, ont souvent des génomes plus grands et présentent une résistance et une plasticité plus importante. Ces bactéries constituent, de fait, plutôt des complexes d’espèces que de vraies espèces. Certaines bactéries spécialistes, comme les bactéries pathogènes, arrivent à s’échapper de ces complexes et à coloniser une niche, bénéficiant alors d’un nom d’espèce. Leur spécialisation leur permet de devenir allopatriques et leurs pertes de gènes favorisent une évolution réductive. Ces observations nous ont conduits à réaliser une étude afin de quantifier le taux de perte de gènes lors de l’évolution de ces bactéries extracellulaires vers celle de bactéries spécialistes intracellulaires. Notre objectif était de vérifier que ce qui caractérise l’évolution des bactéries intracellulaires est bien la réduction génomique, en prenant en compte tous les événements possibles de gains de gènes. Par ailleurs, dans une étude neutre comparant les 12 espèces pandémiques les plus dangereuses pour l’homme avec les espèces non-épidémiques les plus proches, nous avons voulu identifier des spécificités génomiques associées à la capacité virulente de bactéries pathogènes et démontrer que, à part les toxines et les modules toxine-antitoxine, ce qui caractérise ces espèces ce ne sont pas les facteurs de virulence, mais la perte des gènes de régulation. Au final, les bactéries pathogènes ont un répertoire virulent dans lequel les gènes absents sont aussi importants que les gènes présents. / The virulence of pathogenic bacteria has been attributed to virulence factors and pathogenic bacteria are considered to have more genes compared to bacteria that do not cause disease. According to the first genomic studies, removing a certain number of genes from pathogenic bacteria impairs their capacity to infect hosts. However, more recent studies have demonstrated that the specialization of bacteria in eukaryotic cells is associated with massive gene loss, especially for allopatric endosymbionts that have been isolated for a long time in an intracellular niche. Indeed, bacteria living in sympatry often have bigger genomes and exhibit greater resistance and plasticity and constitute species complexes rather than true species. Specialists, including specific pathogenic bacteria, escape these bacterial complexes and colonize a niche; thereby gaining a species name. Their specialization allows them to adopt allopatric lifestyle and experience reductive genome evolution. These observations led us to design a study to quantify the rate of gene losses during the evolution of free-living bacteria to intracellular specialists. Our objective was to verify that what characterizes the evolution of intracellular bacteria is genomic reduction, taking under consideration all possible gene gain events. Furthermore, in another neutral study comparing the 12 most dangerous pandemic bacteria to Humans to their closest non-epidemic species, we wished to identify any genomic specificities associated to the virulent capacity of pathogenic bacteria and demonstrate that, besides toxins and surprisingly, toxin-antitoxin modules, pathogenic bacteria are not characterized by more virulence factors, but rather by a loss of regulatory genes. Finally, virulent bacteria exhibit a genomic repertoire in which absent genes are as important as present ones.

L’étude, la détection et l’identification de pathogènes est une problématique majeure pour la sécurité alimentaire et la médecine. Cependant, les pathogènes bactériens présents à de faibles concentrations nécessitent souvent une période de plus de 36h pour être identifiés par les méthodes standards. Ce délai est extrêmement contraignant pour des domaines où la rapidité du diagnostic est un facteur clé. Il y a donc une forte demande pour le développement d’outils pour mieux comprendre le comportement bactérien et ainsi développer des techniques de détection plus rapides et plus performantes.Les systèmes d’imagerie SPR sont largement utilisés pour l’analyse d’interactions moléculaires, car ils permettent une mesure en parallèle, en temps réel et sans marquage, tout en étant faciles d’utilisation et compatibles avec des milieux complexes. Cette technique a montré son efficacité pour l'étude et la détection de bactéries en utilisant les interactions moléculaires avec les anticorps, mais les délais de détection restent pénalisants.Dans ce contexte, un nouveau système d’imagerie permettant l’étude et la détection spécifique de pathogènes bactériens performant est développé en mettant à profit les avancées récentes en imagerie SPR optimisée en résolution. Notre système permet d'améliorer les temps de détection de pathogènes en milieux modèles grâce à sa capacité à détecter des bactéries individuelles. Il peut également être utilisé pour l'étude de l'interaction entre bactéries et surfaces spécifiques. Des premiers tests montrent que notre instrument est capable de caractériser le comportement bactérien de plusieurs souches bactériennes en interaction avec des surfaces fonctionnalisées par des espèces chimiques différentes / The study, detection and identification of pathogens is a major issue for food safety and medicine. However, bacterial pathogens present at low concentrations often require a period of more than 36 hours to be identified by standard methods. This delay is extremely constraining for areas where rapid diagnosis is a key factor. There is therefore a strong demand for the development of tools to better understand bacterial behavior and thus develop faster and more efficient detection techniques.SPR imaging systems are widely used for the analysis of molecular interactions, as they allow parallel, real-time and unlabeled measurement, while being easy to use and compatible with complex media. This technique has proven effective in the study and detection of bacteria using molecular interactions with antibodies, but detection times remain penalizing.In this context, a new imaging system allowing the study and specific detection of high-performance bacterial pathogens is being developed, taking advantage of recent advances in SPR imaging optimized in resolution. Our system improves pathogen detection times in model environments through its ability to detect individual bacteria. It can also be used to study the interaction between bacteria and specific surfaces. Initial tests show that our instrument is capable of characterizing the bacterial behaviour of several bacterial strains in interaction with surfaces functionalized by different chemical species.

La résistance croissante et alarmante aux antimicrobiens chez de nombreuses bactéries pathogènes humaines telles que Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae et Pseudomonas aeruginosa représente un problème majeur de santé publique. Ce problème est aggravé par l’apparition de souches multirésistantes et par le nombre limité d’antibiotiques en développement. Il devient donc impératif de s’affairer à protéger l’efficacité des molécules disponibles. Par ailleurs, une meilleure compréhension du mode d’action des antibiotiques et de la réponse induite par ceux-ci pourrait être bénéfique pour identifier de nouvelles cibles bactériennes pour le développement d’adjuvants chimio-thérapeutiques. Notre étude de la réponse transcriptomique par la technique d’ARN-Seq de trois souches de S. pneumoniae sensibles à la pénicilline (PEN) a montré un nouveau lien entre le métabolisme de la glutamine et la sensibilité à la PEN. En effet, les gènes des opérons glnRA et glnPQ impliqués dans la synthèse et l’absorption de la glutamine étaient parmi les gènes les plus sous-exprimés chez les trois souches traitées avec la PEN. Nous avons aussi détecté une augmentation des concentrations intracellulaires de la glutamine à la suite du traitement à la PEN. En outre, l’inhibition chimique de la glutamine synthétase codée par glnA sensibilise S. pneumoniae à la PEN, et ceci a aussi été observé chez des isolats cliniques résistants à la PEN. En résumé, une combinaison d’études transcriptomique et métabolomique a démontré que la PEN interfère avec le métabolisme de la glutamine, suggérant des stratégies qui pourraient être exploitées en bithérapie. Chez les bactéries à Gram négatif, la résistance aux carbapénèmes devient de plus en plus menaçante pour la santé mondiale. L'efficacité de l’imipénème (IMP) diminue avec l'apparition de la résistance. Notre criblage chimiogénomique chez E. coli, K. pneumoniae et P. aeruginosa a mis en évidence des réponses communes et spécifiques à l’IMP à chaque espèce. Une analyse comparative de 145 mutants a montré que les gènes les plus mutés codaient pour des protéines impliquées dans la biogenèse de la membrane et de l'enveloppe cellulaires, la transcription et la transduction de signal. iii Nos résultats ont montré que le gène rpoD codant pour un facteur sigma d'ARN polymérase était muté chez les trois espèces et le rôle de ce gène dans la résistance a été validé expérimentalement chez E. coli. En outre, de nombreux gènes codant pour des amidases, transférases et transglycosidases ont conféré un faible niveau de résistance aux entérobactéries, alors que les mutations d'OprD étaient fréquentes chez P. aeruginosa, mais divers systèmes de transduction de signal à deux composants étaient également susceptibles d'être impliqués dans la résistance à l'IMP. De façon intéressante, certains gènes identifiés tels que rpoD, slt codant pour une transglycosylase lytique, ainsi que les histidines kinases sont déjà envisagés comme des cibles thérapeutiques prometteuses. Finalement, cette étude a confirmé le pouvoir de diverses approches omiques quant à la compréhension des modes d’action des antibiotiques et à la prédiction des mécanismes de résistance développés contre eux. Ceci nous permettra de mettre en place des stratégies pour protéger l’efficacité des antibiotiques actuellement utilisés mais aussi celle de nouvelles molécules développées.

L’évolution de l’industrie porcine québécoise et canadienne caractérisée par une densification des troupeaux a, dans les dernières décennies, mené à une augmentation du confinement dans les bâtiments d’élevage. Les éleveurs de carrières occupent ces bâtiments pour une partie considérable de leur journée de travail, s’exposant ainsi à cet environnement confiné. Les porcheries sont reconnues comme étant des environnements fortement contaminés en poussières et bioaérosols. De plus, des effets néfastes sur la santé des occupants sont soupçonnés dans ces nouveaux bâtiments. Cette étude vise à détecter la présence et à quantifier six pathogènes humains, à mesurer la concentration en poussières et à détecter la présence de gènes de résistance d’importance en médecine humaine dans l’air des porcheries du Québec. Pour ce faire, dix porcheries québécoises ont été visitées et des échantillons d’air ont été prélevés dans chacune d’elle. Les six pathogènes à l’étude ont été investigués par des méthodes traditionnelles de culture et par biologie moléculaire. La concentration des poussières et suspension a été mesurée par gravimétrie ainsi que par lecture directe du diamètre aérodynamique de ces dernières. Les gènes de résistance ont été détectés par biologie moléculaire. Les résultats obtenus renforcent l’hypothèse que les porcheries en environnements tempérés comme celles du Québec et du Canada abritent de fortes concentrations en bioaérosols pouvant potentiellement avoir des effets néfastes sur la santé des travailleurs agricoles. / Changes in the swine industry of the Province of Quebec and Canada characterized by larger herds as lead to an increase in confinement levels inside pig buildings. Swine workers occupy these buildings several hours per day, exposing themselves to this confined environment. Pig buildings are environments well known to be heavily contaminated by dust and bioaerosols. Moreover, adverse effects on the health of the occupants are suspected. The present study aims at detecting and quantifying six human pathogens, measuring airborne dust concentrations, and detecting resistance genes of medical importance in the air of swine confinement buildings in the Province of Quebec. To do so, ten pig buildings were visited and air samples were collected in each of them. Human pathogens were investigated using classic culture methods as well as molecular biology. Airborne dust concentrations were calculated using gravimetric methods and a direct measurement of the aerodynamic diameter or particles. Resistance genes were detected by molecular biology. Results obtained during this study reinforce the hypothesis that swine confinement buildings in temperate environments such as the Province of Quebec host high concentrations of bioaerosols which can potentially have adverse effects on the workers’ health.

Les souches bactériennes à Gram négatif sont répertoriées comme étant celles qui causent le plus de toxi-infections alimentaire au Canada. Parmi les aliments incriminés, la viande de volailles demeure le plus connu des véhicules de transmission de ces pathogènes. Le contrôle de la flore pathogène chez la volaille consiste non seulement de réduire le taux de mortalité en élevage mais également d'assurer une meilleure qualité microbiologique à l'arrivé aux abattoirs et par conséquent de produire des denrées salubres sans danger pour le consommateur. L'antibiothérapie et ± l'antibioprévention ¿ sont actuellement les seuls moyens utilisés pour contrer les problèmes sanitaire et économique liés aux pathogènes aviaires. Cependant le recours aux antibiotiques a connue ses limites, en raison de l'émergence de nouvelles souches pathogènes multi-résistantes causée par l'utilisation abusive de ces composés dans le secteur avicole. Récemment, de nouvelles stratégies de prévention ont été proposées comme alternatives aux antibiotiques pour réduire l'incidence des pathogènes entériques chez la volaille. Parmi ces stratégie, le recours aux probiotiques semble offrir les résultats les plus prometteurs. L'objectif général de ce projet de recherche était d'isoler et de caractériser à partir du microbiote colique de la volaille des souches ayant un fort potentiel d'utilisation comme probiotique en aviculture. Plusieurs isolats provenant de contenus intestinaux de volailles ont été isolées et caractérisées sur le plan microbiologique et biologique. Parmi ces isolats, vingt quatre isolats ayant démontré une activité inhibitrice contre des pathogènes Gram négatifs ont été utilisées. Sept de ces souches ont été retenues par la suite en raison de leur forte activité inhibitrice. Une caractérisation préliminaire des substances inhibitrices produites par ces souches a permis de retenir trois isolats produisant des composés de nature protéique, thermostable et de faible poids moléculaire très apparentés à des bactériocines.

La résistance aux antibiotiques est l'une des principales menaces à la médecine moderne selon l'Organisation mondiale de la santé. Des études effectuées sur l'eau d'usines de traitement des eaux usées (UTE) ont montré qu'elles sont une importante source de gènes de résistance aux antibiotiques (GRA). Cependant, l'air entourant les bassins de traitement d'eaux usées a peu été étudié. Les bioaérosols émis lors de ces traitements ont le potentiel de propager des GRA sur de très longues distances. Ce projet a comme objectif de préciser le rôle des bioaérosols émis par les bassins extérieurs de traitement des eaux usées dans la propagation des gènes de résistance aux antibiotiques. Des échantillons d'air ont été prélevés en amont et en aval de bassins extérieurs de boues activées et de bassins extérieurs d'aération d'eaux usées. Des échantillons ont également été prélevés à proximité de bassins de décantation intérieurs. Ces échantillons d'air ont été récoltés avec un SASS 3100 Dry Air Sampler ainsi qu'avec un SASS 4100 Two-Stage Aerosol Collector. Les bactéries totales ont été quantifiées par amplification PCR. La PCR quantitative a aussi été réalisée pour 38 gènes de résistance aux antibiotiques et éléments génétiques mobiles sur chaque échantillon. Les gènes conférant des résistances aux Bêta-lactamines, aux tétracyclines, aux sulfamides ainsi qu'aux macrolides ont été retrouvés dans l'air entourant les bassins de traitement des eaux usées. Les bassins de boues activées semblent émettre plus de GRA que les étangs aérés. / Antibiotic resistance is one of the main threats to modern medicine according to the World Health Organization. Studies carried out on water from sewage treatment plants have shown that they are an important source of antibiotic resistance genes (ARGs). However, the air surrounding wastewater treatment ponds has been little studied. The bioaerosols emitted during these treatments have the potential to spread GRAs over very long distances. This project aims to precise the role of bioaerosols emitted by outdoor wastewater treatment ponds in the spread of antibiotic resistance genes. Air samples were taken upstream and downstream of outdoor activated sludge ponds and outdoor wastewater aeration ponds. Samples were also taken near indoor settling ponds. There air samples were collected with a SASS 3100 Dry Air Sampler as well as with a SASS 4100 Two-Stage Aerosol Collector. Total bacteria were quantified by PCR amplification. Quantitative PCR was also performed for 38 antibiotic resistance genes and mobile genetic elements on each sample. Genes conferring resistance to beta-lactams, tetracyclines, sulfamides and macrolides have been found in the air surrounding wastewater treatment ponds. Activated sludge seems to emit more ARGs than aerated ponds.

Les séquences d'insertion sont des parasites moléculaires d'ADN codant uniquement pour leur machinerie de transposition et sont retrouvées majoritairement dans les génomes et les plasmides des procaryotes. Le séquençage génomique massif de la dernière décennie nous a permis de détecter chez des souches bactériennes cliniques plusieurs gènes de résistance aux antibiotiques associés aux séquences d'insertion sous forme de transposons composés. Il a été suggéré que les séquences d'insertion jouent un rôle prépondérant dans l'évolution bactérienne et qu'elles possèdent un pouvoir recruteur permettant de sélectionner, réorganiser et propager des gènes conférant un avantage sélectif à l'hôte. Nous avons partiellement caractérisé le potentiel recruteur de deux séquences d'insertion associées à des gènes de résistance, la séquence IS26 de Proteus vulgaris et la séquence ISJO de Salmonella typhimurium, en observant les étapes de recrutement d'un gène chromosomique et leurs distributions épidémiologiques en consultant les banques de données. / Insertion sequences are DNA molecular parasites encoding exclusively their transposition function, and are mainly found within the genomes and plasmids of prokaryotic organisms. The massive genomic sequencing we have witnessed in the last decade has allowed us to detect in clinical bacterial isolates many antibiotic resistance genes associated with insertion sequences in the form of composite transposons. It has been suggested that insertion sequences may act as a primary modulator of bacterial evolution, and that they possess a recruitment capacity allowing them to select, reorganize and spread genes encoding adaptation functions for their hosts. We have partially characterized the recruitment potential of two insertion sequences well known for their association with antibiotic resistance genes, IS10 from Salmonella typhimurium and 1S26 from Proteus vulgaris, by observing the steps involved in the recruitment process of a chromosomal gene and their epidemiological distribution by consulting various databanks.

La résistance croissante et alarmante aux antimicrobiens chez de nombreuses bactéries pathogènes humaines telles que Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae et Pseudomonas aeruginosa représente un problème majeur de santé publique. Ce problème est aggravé par l’apparition de souches multirésistantes et par le nombre limité d’antibiotiques en développement. Il devient donc impératif de s’affairer à protéger l’efficacité des molécules disponibles. Par ailleurs, une meilleure compréhension du mode d’action des antibiotiques et de la réponse induite par ceux-ci pourrait être bénéfique pour identifier de nouvelles cibles bactériennes pour le développement d’adjuvants chimio-thérapeutiques. Notre étude de la réponse transcriptomique par la technique d’ARN-Seq de trois souches de S. pneumoniae sensibles à la pénicilline (PEN) a montré un nouveau lien entre le métabolisme de la glutamine et la sensibilité à la PEN. En effet, les gènes des opérons glnRA et glnPQ impliqués dans la synthèse et l’absorption de la glutamine étaient parmi les gènes les plus sous-exprimés chez les trois souches traitées avec la PEN. Nous avons aussi détecté une augmentation des concentrations intracellulaires de la glutamine à la suite du traitement à la PEN. En outre, l’inhibition chimique de la glutamine synthétase codée par glnA sensibilise S. pneumoniae à la PEN, et ceci a aussi été observé chez des isolats cliniques résistants à la PEN. En résumé, une combinaison d’études transcriptomique et métabolomique a démontré que la PEN interfère avec le métabolisme de la glutamine, suggérant des stratégies qui pourraient être exploitées en bithérapie. Chez les bactéries à Gram négatif, la résistance aux carbapénèmes devient de plus en plus menaçante pour la santé mondiale. L'efficacité de l’imipénème (IMP) diminue avec l'apparition de la résistance. Notre criblage chimiogénomique chez E. coli, K. pneumoniae et P. aeruginosa a mis en évidence des réponses communes et spécifiques à l’IMP à chaque espèce. Une analyse comparative de 145 mutants a montré que les gènes les plus mutés codaient pour des protéines impliquées dans la biogenèse de la membrane et de l'enveloppe cellulaires, la transcription et la transduction de signal. iii Nos résultats ont montré que le gène rpoD codant pour un facteur sigma d'ARN polymérase était muté chez les trois espèces et le rôle de ce gène dans la résistance a été validé expérimentalement chez E. coli. En outre, de nombreux gènes codant pour des amidases, transférases et transglycosidases ont conféré un faible niveau de résistance aux entérobactéries, alors que les mutations d'OprD étaient fréquentes chez P. aeruginosa, mais divers systèmes de transduction de signal à deux composants étaient également susceptibles d'être impliqués dans la résistance à l'IMP. De façon intéressante, certains gènes identifiés tels que rpoD, slt codant pour une transglycosylase lytique, ainsi que les histidines kinases sont déjà envisagés comme des cibles thérapeutiques prometteuses. Finalement, cette étude a confirmé le pouvoir de diverses approches omiques quant à la compréhension des modes d’action des antibiotiques et à la prédiction des mécanismes de résistance développés contre eux. Ceci nous permettra de mettre en place des stratégies pour protéger l’efficacité des antibiotiques actuellement utilisés mais aussi celle de nouvelles molécules développées.

Le phénomène de multirésistance aux antibiotiques chez les bactéries à Gram positif causant des infections sévères du sang est un problème mondial grandissant. La détection du niveau de sensibilité aux antibiotiques avec des tests phénotypiques requière un minimum de 48 h avant l'obtention des résultats. Il est donc nécessaire de développer des tests de diagnostic rapides, sensibles, spécifiques et ubiquitaires pour améliorer le traitement des septicémies. Ce mémoire de maîtrise présente le développement d'un test de diagnostic moléculaire permettant la détection rapide des gènes de résistance aux antibiotiques cliniquement importants associés aux bactéries à Gram positif causant des septicémies. Ce test comprend 4 essais PCR multiplex combinés à une hybridation microfluidique sur puces à ADN intégrées à un disque compact. Les corrélations obtenues entre les résultats génotypiques et phénotypiques étaient de 98% pour les P-lactamines et de 100% pour la vancomycine, la clindamycine et la gentamicine. Cette approche moléculaire pourrait éventuellement être utilisée pour le diagnostic clinique afin de guider l'antibiothérapie des patients atteints d'une septicémie.