<p>Млеко магарице је тек последњих година доспело у фокус научних истраживања, иако су његова благотоворна терапеутска и козметичка својства позната још од античких времена. Упркос томе што знање о функционалности млека магарице константно расте, његов антимикробни потенцијал остаје најмање истражен. Литературни подаци о микробиологији и евентуалној антимикробној активности млека магарице балканске расе која егзистира на подручју Србије и околних балканских земаља су јако лимитирани. Ово млеко се традиционално конзумира без претходне топлотне обраде, што покреће низ питања која се односе на здравствену безбедност конзумирања млека у сировом стању. Предмети истраживања ове докторске дисертације били су утврђивање микробиолошког квалитета сировог млека магарице балканске расе, као и испитивање његове антибактеријске активности према одабраним сојевима Escherichia coli, Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes и Klebsiella pneumoniae. У циљу утврђивања главних носилаца антибактеријског дејства, као и самог модела антибактеријског деловања, у одабраним узорцима овог млека намењеним извођењу антибактеријских испитивања, извршено је одређивање садржаја антимикробних протеина - лизозима и лактоферина, као и садржаја калцијума. У узорцима млека магарице предвиђеним за испитивање антибактеријске активности према S. aureus и L. monocytogenes, одређен је садржај масних киселина са документованом антибактеријском активношћу према Грам<br />позитивним бактеријама. Присуство L. monocytogenes и Salmonella spp. није утврђено ни у једном од 137 испитаних узорака сировог млека магарице, док је број E. coli, колиформних бактерија, Enterobacteriaceae, квасаца и плесни и суспектног B. cereus био испод границе детекције методе. Према резултатима добијеним у овој докторској дисертацији сви испитани узорци сировог млека магарице балканске расе су задовољавали захтеве европских регулатива 92/46/ЕЕC и EC 853/2004 и са микробиолошког аспекта су у потпуности били безбедни за директно конзумирање без претходне топлотне обраде. Сирово млеко магарице балканске расе је показало различиту антибактеријску активност према Грам позитивним и Грам негативним бактеријским сојевима тестираним у оквиру ове докторске дисертације, чији интензитет је зависио од нивоа контаминације узорака млека тестираним патогеном и температуре инкубирања. Температура инкубирања од +15 &deg;C је у односу на +9 &deg;C била генерално повољнија за активност антибактеријских супстанци у млеку магарице према свим тестираним патогенима, али је антибактеријски потенцијал узорака млека магарице на +15 &deg;C био лимитиран бржим умножавањем испитаних бактерија на овој температури. То је посебно важило за узорке са већим нивоима контаминације (103 и 104 cfu/ml). Антибактеријска активност сировог млека магарице према L. monocytogenes и S. aureus се нa свим радним температурама састојала од продужeња лаг фазе и инхибирања бактеријског раста, док се у случају S. Enteritidis, S. Typhimurium, E. coli АTCC 8739, E. coli АTCC 10536 и K. pneumoniae она огледала у редукцији њиховог почетног броја и/или продужењу лаг фазе. Резултати ове докторске дисертације су указали на калцијум зависну природу антибактеријске активности сировог млека магарице према S. Enteritidis, S. Typhimurium и оба тестирана соја E. coli. Најснажнију антибактеријску активност према K. pneumoniae показали су узорци млека магарице, који су поред великог садржаја лизозима имали и велики садржај лактоферина, па би у овом случају основни механизам антибактеријског деловања млека магарице могао бити синергизам лизозима и лактоферина. Лизозим је највероватније главни носилац антибактеријске активности млека магарице балканске расе, обзиром да је у односу на други антимикробни агенс &ndash; лактоферин у тестираним узорцима млека магарице детектован у вишеструко већој концентрацији. Известан допринос антибактеријској активности млека<br />магарице балканске расе према L. monocytogenes и S. aureus могле би да дају и масне киселине са документованим антибактеријским дејством према Грам позитивним бактеријама (линолна, лауринска и олеинска киселина), које су у анализираним узорцима млека магарице у збиру чиниле од 40,3 до 54,7% од укупних масних киселина.</p> / <p>Mleko magarice je tek poslednjih godina dospelo u fokus naučnih istraživanja, iako su njegova blagotovorna terapeutska i kozmetička svojstva poznata još od antičkih vremena. Uprkos tome što znanje o funkcionalnosti mleka magarice konstantno raste, njegov antimikrobni potencijal ostaje najmanje istražen. Literaturni podaci o mikrobiologiji i eventualnoj antimikrobnoj aktivnosti mleka magarice balkanske rase koja egzistira na području Srbije i okolnih balkanskih zemalja su jako limitirani. Ovo mleko se tradicionalno konzumira bez prethodne toplotne obrade, što pokreće niz pitanja koja se odnose na zdravstvenu bezbednost konzumiranja mleka u sirovom stanju. Predmeti istraživanja ove doktorske disertacije bili su utvrđivanje mikrobiološkog kvaliteta sirovog mleka magarice balkanske rase, kao i ispitivanje njegove antibakterijske aktivnosti prema odabranim sojevima Escherichia coli, Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes i Klebsiella pneumoniae. U cilju utvrđivanja glavnih nosilaca antibakterijskog dejstva, kao i samog modela antibakterijskog delovanja, u odabranim uzorcima ovog mleka namenjenim izvođenju antibakterijskih ispitivanja, izvršeno je određivanje sadržaja antimikrobnih proteina - lizozima i laktoferina, kao i sadržaja kalcijuma. U uzorcima mleka magarice predviđenim za ispitivanje antibakterijske aktivnosti prema S. aureus i L. monocytogenes, određen je sadržaj masnih kiselina sa dokumentovanom antibakterijskom aktivnošću prema Gram<br />pozitivnim bakterijama. Prisustvo L. monocytogenes i Salmonella spp. nije utvrđeno ni u jednom od 137 ispitanih uzoraka sirovog mleka magarice, dok je broj E. coli, koliformnih bakterija, Enterobacteriaceae, kvasaca i plesni i suspektnog B. cereus bio ispod granice detekcije metode. Prema rezultatima dobijenim u ovoj doktorskoj disertaciji svi ispitani uzorci sirovog mleka magarice balkanske rase su zadovoljavali zahteve evropskih regulativa 92/46/EEC i EC 853/2004 i sa mikrobiološkog aspekta su u potpunosti bili bezbedni za direktno konzumiranje bez prethodne toplotne obrade. Sirovo mleko magarice balkanske rase je pokazalo različitu antibakterijsku aktivnost prema Gram pozitivnim i Gram negativnim bakterijskim sojevima testiranim u okviru ove doktorske disertacije, čiji intenzitet je zavisio od nivoa kontaminacije uzoraka mleka testiranim patogenom i temperature inkubiranja. Temperatura inkubiranja od +15 &deg;C je u odnosu na +9 &deg;C bila generalno povoljnija za aktivnost antibakterijskih supstanci u mleku magarice prema svim testiranim patogenima, ali je antibakterijski potencijal uzoraka mleka magarice na +15 &deg;C bio limitiran bržim umnožavanjem ispitanih bakterija na ovoj temperaturi. To je posebno važilo za uzorke sa većim nivoima kontaminacije (103 i 104 cfu/ml). Antibakterijska aktivnost sirovog mleka magarice prema L. monocytogenes i S. aureus se na svim radnim temperaturama sastojala od produženja lag faze i inhibiranja bakterijskog rasta, dok se u slučaju S. Enteritidis, S. Typhimurium, E. coli ATCC 8739, E. coli ATCC 10536 i K. pneumoniae ona ogledala u redukciji njihovog početnog broja i/ili produženju lag faze. Rezultati ove doktorske disertacije su ukazali na kalcijum zavisnu prirodu antibakterijske aktivnosti sirovog mleka magarice prema S. Enteritidis, S. Typhimurium i oba testirana soja E. coli. Najsnažniju antibakterijsku aktivnost prema K. pneumoniae pokazali su uzorci mleka magarice, koji su pored velikog sadržaja lizozima imali i veliki sadržaj laktoferina, pa bi u ovom slučaju osnovni mehanizam antibakterijskog delovanja mleka magarice mogao biti sinergizam lizozima i laktoferina. Lizozim je najverovatnije glavni nosilac antibakterijske aktivnosti mleka magarice balkanske rase, obzirom da je u odnosu na drugi antimikrobni agens &ndash; laktoferin u testiranim uzorcima mleka magarice detektovan u višestruko većoj koncentraciji. Izvestan doprinos antibakterijskoj aktivnosti mleka<br />magarice balkanske rase prema L. monocytogenes i S. aureus mogle bi da daju i masne kiseline sa dokumentovanim antibakterijskim dejstvom prema Gram pozitivnim bakterijama (linolna, laurinska i oleinska kiselina), koje su u analiziranim uzorcima mleka magarice u zbiru činile od 40,3 do 54,7% od ukupnih masnih kiselina.</p> / <p>Donkey&#39;s milk has recently become a very popular topic among scientific community although it has been used for therapeutic and cosmetic purposes since ancient times. Even though the number of investigations concerning donkey&#39;s milk functionality has increased, the studies on its antimicrobial potential are limited. Especially, there is a lack in literature data on microbiological quality and antibacterial activity of donkey&#39;s milk obtained from Domestic Balkan breed originated in Serbia and other countries in Balkan region. The fact that this milk is traditionally consumed without heat treatment launches a series of issues concerning its safety.<br />The aim of this thesis was to determine microbiological quality of Domestic Balkan donkey&#39;s milk, as well as to investigate its antibacterial activity against the selected strains of Escherichia coli, Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes and Klebsiella pneumonia. In order to determine the major antibacterial substances, as well as the model of antibacterial activity, the content of antimicrobial proteins (lysozyme and lactoferrin) and calcium was determined. The amount of fatty acids which are known to be effective against Gram-positive bacteria was determined in milk samples tested for antibacterial activity against S. aureus и L. monocytogenes. The presence of L. monocytogenes and Salmonella spp. was not detected in any of the 137 raw donkey&#39;s milk samples, while the levels of E. coli, coliform bacteria, Enterobacteriaceae, yeast and molds and suspect Bacillus cereus were below the limit of detection of the assays. According to obtained results, all examined Domestic Balkan donkeys&#39; raw milk samples were<br />in accordance with the EU regulations 92/46/ЕЕC and EC 853/2004 in terms of their<br />microbiological quality, thus being completely safe for direct consumptions, without thermal treatment. Raw Domestic Balkan donkey&#39;s milk has expressed different antibacterial activities against Gram-positive and Gram-negative bacteria strains tested in this thesis, with the intensities which depended on contamination level and incubation temperature. In comparison to temperature of +9 &deg;C, the incubation temperature of +15 &deg;C was more favourable for activity of antibacterial substances in donkey&#39;s milk against all tested pathogens. However, the antibacterial potential of donkey&#39;s milk samples at +15 &deg;C was limited with rapid multiplication of bacteria at this temperature. This was especially pronounced in samples characterized with higher contamination levels (103 and 104 cfu/ml). Antibacterial activity of raw donkey&#39;s milk against L. monocytogenes and S. aureus at all tested temperatures reflected in prolonged lag phase and inhibition of bacterial growth, while the activity against S. Enteritidis, S. Typhimurium, E. coli АTCC 8739, E. coli АTCC 10536 and K. pneumonia comprised reduction of initial bacterial numbers and/or prolongation of lag phase.<br />Results obtained in this thesis have indicated on calcium dependent antibacterial activity of raw donkey&#39;s milk against S. Enteritidis, S. Typhimurium and both E. coli strains. The most pronounced antibacterial activity against K. pneumonia was found in donkey&#39;s milk samples which besides high content of lysozyme had high content of lactoferrin, thus indicating that the basic antibacterial mechanism of donkey&#39;s milk might be the synergism between lysozyme and lactoferrin. Lysozyme was probably the substance with the highest antimicrobial activity in Domestic Balkan donkey&#39;s milk, since it was detected in significantly higher concentrations than lactoferrin. The fatty acids which are known to be effective against Gram-positive bacteria (linoleic, lauric and oleic) and which comprised from 40.3 to 54.7% of total fatty acids in tested samples, may also contribute to antimicrobial activity of Domestic Balkan donkey&#39;s milk against L. monocytogenes and S. aureus.</p>

A exposição humana a microrganismos patogênicos e suas toxinas em alimentos constitui um grave problema de saúde pública. O uso indiscriminado de antimicrobianos convencionais promove o aumento da resistência dos microrganismos às principais moléculas existentes no mercado. Além disso, as limitações do uso de substâncias químicas em matérias primas alimentares têm estimulado pesquisas para o desenvolvimento de metodologias eco-amigáveis para evitar a multiplicação de fungos e/ou eliminar suas toxinas. O Staphylococcus aureus é uma das principais bactérias patogênicas que apresenta taxas elevadas de resistência aos antimicrobianos, e por este motivo tem sido objeto de estudo de pesquisas que tentam identificar novos compostos bioativos para o combate de infecções. O Aspergillus parasiticus é um dos principais fungos produtores de aflatoxinas, substâncias carcinogênicas que contaminam diversos tipos de cereais antes e após o processamento. Estudos recentes demonstraram que extratos de plantas possuem atividade antimicrobiana e antifúngica, além de potencial para degradação de micotoxinas. Neste contexto, o presente estudo teve por objetivos avaliar a atividade antimicrobiana in vitro de extratos brutos e liofilizados de folhas de maracujá, araçá, alecrim e orégano sobre células planctônicas de S. aureus e A. parasiticus, bem como verificar a capacidade dos referidos extratos em degradar in vitro a aflatoxina B1 (AFB1), ocratoxina A (OTA) e zearalenona (ZEA). Os efeitos antibacterianos e antifúngicos dos extratos foram avaliados através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida / fungicida mínima (CBM/CFM). Os ensaios de degradação da micotoxinas foram realizados em diferentes tempos de incubação (12-48 h) a 37º C, utilizando-se cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para determinação das concentrações das micotoxinas. O maracujá não demonstrou atividade antimicrobiana tanto para S. aureus quanto para A. parasiticus. Dos quatro extratos estudados, o araçá demonstrou o maior efeito antibacteriano, cujos valores de CIM para extratos bruto e liofilizado foram 0.39 mg/mL e 0.45 mg/mL, respectivamente. Os menores valores de CIM para A. parasiticus foram obtidos com o orégano liofilizado (8.33 mg/mL) e o araçá bruto (3.215 mg/mL). Contudo, não foi possível identificar valores de CFM para o fungo analisado. Não houve efeito de degradação de OTA e ZEA por nenhum dos extratos avaliados. Todos os extratos reduziram a concentração de AFB1 após 48 h de incubação. A maior porcentagem (60.3%) de redução de AFB1 foi obtida com o extrato de alecrim após 48 h de incubação. A atividade antimicrobiana demonstrada pelos extratos das plantas avaliadas indica um potencial para sua aplicação no combate a bactérias patogênicas e fungos toxigênicos. Este é o primeiro estudo realizado com extratos dessas quatro espécies de plantas que evidenciou a capacidade de redução in vitro de AFB1. / Human exposure to pathogenic microorganisms and their toxins in food is a serious public health problem. The indiscriminate use of conventional antimicrobials increases the resistance of microorganisms to the main molecules available in the market. In addition, limitations on the use of chemical substances in food raw materials have stimulated researches for the development of eco-friendly methodologies to avoid the multiplication of fungi and/or eliminate their toxins. Staphylococcus aureus is one of the major pathogenic bacteria with high rates of antimicrobial resistance, and for this reason it has been the subject of research studies aiming to identify new bioactive compounds to combat infections. Aspergillus parasiticus is one of the main aflatoxin-producing fungi, which are carcinogenic substances that contaminate many types of cereals before and after processing. Recent studies have demonstrated that plant extracts have antimicrobial and antifungal activity, as well as potential for degradation of mycotoxins. In this context, the objective of the present study was to evaluate the in vitro antimicrobial effects of crude and lyophilized extracts of leaves from sweet passion fruit, araçá, rosemary and oregano on planktonic cells of S. aureus and A. parasiticus. The in vitro degradation of aflatoxin B1 (AFB1), ochratoxin A (OTA) and zearalenone (ZEN) by the crude extracts was also investigated. The antimicrobial and antifungal effects were evaluated by determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal / fungicidal concentration (MBC / MFC). Mycotoxin detoxification assays were conducted at different incubation times (12-48h) at 37 °C. The concentrations of mycotoxins were determined by high performance liquid chromatography (HPLC). Sweet passion fruit had no antimicrobial activity on S. aureus or A. parasiticus. Out of the four extracts evaluated, araçá showed the highest antimicrobial effect with MIC of 0.39 mg/mL and 0.45 mg/mL for crude and lyophilized extracts, respectively. The lowest MIC values for A. parasiticus were obtained with lyophilized oregano (8.33 mg/mL) and crude araçá (3.215 mg/mL). However, no MFC values were obtained for the analyzed fungi. Although OTA e ZEN were not degraded by any extract evaluated, all extracts reduced the concentration of AFB1 after 48 h of incubation. The highest percentage of AFB1 reduction (60.3%) was obtained with rosemary extract after 48h of incubation. The antimicrobial activity demonstrated by extracts of the evaluated plants indicates a potential for application against pathogenic bacteria and toxigenic fungi. This is the first study carried out with extracts of these four plants species that demonstrated the in vitro ability for AFB1 reduction.

A cana-de-açúcar tem elevada importância econômica e agrícola. Bactérias diazotróficas possuem importante papel nos níveis de nitrogênio combinado no solo. Tornando estas bactérias as maiores fontes naturais de nitrogênio reduzido. Os gêneros bacterianos escolhidos são endofíticos, diazotróficos, isolados de cana-de-açúcar. Utilizou-se células de cana-de-açúcar na forma de calo como um modelo da interação bactéria-planta. Os experimentos com misturas bacterianas, avaliaram se dois gêneros seriam capazes de interagir, e nas contribuições às células vegetais. Pseudomonas sp. e Pantoea sp., sofreram inibição do crescimento e Enterobacter sp. foi estimulado. Pseudomonas sp. mostrou ser uma fraca competidora. Quando associadas, a morte de Pseudomonas sp. foi estimulada por Pantoea sp.. Os efeitos do calo na nitrogenase foram observados pontualmente e os no crescimento por períodos maiores. Conteúdos de EROs auxiliaram nos resultados de patogenicidade das linhagens. / The sugarcane has a high economic and agricultural importance. Diazotrophs play an important role in combined nitrogen levels in the soil. Making these bacteria the highest natural sources of reduced nitrogen. The bacterial genera chosen were endophytic diazotroph isolated from sugarcane. Was used cell sugarcane in the form callus as a template of the bacteria-plant interaction. The experiments with bacterial mixtures, evaluated whether two genres would be able to interact, and contributions to plant cells. Pseudomonas sp. and Pantoea sp. suffered growth inhibition and Enterobacter sp. was stimulated. Pseudomonas sp. proved to be a weak competitor. When attached, the death of Pseudomonas sp. was stimulated by Pantoea sp .. The effects of nitrogenase were observed in callus punctually and growth for longer periods. Contents of ROS helped for the pathogenicity of strains.

Orientador: Ary Fernandes Júnior / Resumo: As doenças infecciosas, incluindo aquelas transmitidas por alimentos, causadas por micro-organismos ainda representam uma grande preocupação, especialmente devido ao surgimento de bactérias resistentes aos antimicrobianos atualmente em uso. Várias substâncias provenientes de plantas exibem atividades inibitórias sobre micro-organismos, sendo uma estratégia empregada para buscas de novos fármacos que interfiram nos mecanismos de resistência. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito inibitório de cinco compostos voláteis majoritários encontrados em óleos essenciais de algumas plantas (eugenol, cinamaldeído, terpineol, geraniol e citronelol) sobre bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (padrões ATCC e isolados clínicos) para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) pela metodologia da microdiluição (Resazurin Microtiter Assays-REMA). Além disto, foram testadas combinações entre os compostos e drogas antimicrobianas de uso convencional para verificação de sinergismo e a influência de concentrações subinibitórias dos compostos na produção de enterotoxinas estafilococócicas dos tipo A, B, C e D. A fim de ilustrar o efeito dessas substâncias nas células bacterianas de E. coli e MRSA e na formação do septo divisional em X. citri, foram feitas imagens por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e microscopia de fluorescência, respectivamente. O composto que apresentou melhor atividade antimicrobiana sobre as linhagens bacterianas testadas foi o cinamaldeído com ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

No presente estudo, um conjunto de três experimentos foram conduzidos com o objetivo de avaliar a ocorrência de Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes em três lacticínios (A, B e C) localizados na região sudeste do Brasil de dezembro 2013 a abril de 2015 (Experimento 1), a eficiência do tratamento com ácido peracético (APA) e jato de plasma a frio (PF) para inativar os isolados em diferentes tempos (Experimento 2) e a capacidade dos isolados produzir biofilmes na superfície de poliestireno e de aço inoxidável, juntamente com inativação e remoção de células aderidas pelo APA (Experimento 3). No Experimento 1, foram analisadas amostras de leite e queijo, superfícies com e sem contato com alimentos. L. monocytogenes foi isolada em apenas uma amostra (0,3%, N = 349) de ralo no laticínio B, enquanto seis (1,7%, n = 349) S. aureus foram isolados de luvas de manipuladores em laticínio A, salmoura no laticínio B e superfície do queijo, utensílio, bota e mão esquerda de trabalhador no lacticínio C. Apesar das incidências desses dois agentes patogênicos de origem alimentar nos lacticínios avaliados foram baixo, sua presença também indica a necessidade de controle estratégias para impedir a sua persistência e contaminação cruzada. No Experimento 2, tratamento com APA (0,5%) e jato de PF foram aplicados diretamente sobre suspensões de isolados de S. aureus e L. monocytogenes. A inativação bacteriana (aproximadamente de 7 ciclos log) foi alcançada em 120 seg. com o tratamento com APA para todos os isolados, enquanto que o tratamento com plasma a frio reduziu aproximadamente 2 ciclos log nas superficies. Outros estudos usando tratamentos de plasma a frio mais longos são necessários para a total descrição da cinética desta tecnologia para a inativação de importantes patógenos de origem alimentar. No Experimento 3, o tratamento com APA (0,5%) em diferentes tempos (0-controle, 15, 30, 60 e 120 seg.) foi avaliada para a remoção de células aderidas de quatro isolados de S. aureus e um isolado de L. monocytogenes em microplacas de poliestireno, assim como para a inativação de biofilmes dos isolados em aço inoxidável. O tratamento com APA removeu (p&lt;0,05) células aderidas de todos os isoladoas estudados S. aureus da superfície, sem diferenças (p&gt; 0,05) no indice de formação de biofilmes nos tempos de tratamento. No entanto, nenhum efeito (p&gt; 0,05) foi observado em células aderidas de L. monocytogenes. A microscopia de epifluorescência mostrou que todas as bactérias testadas foram parcialmente e completamente inativadas após 15 seg e 30 seg. respectivamente. Os resultados indicam um potencial para a utilização de APA contra biofilmes formados por S. aureus e L. monocytogenes, e da necessidade de novos estudos com a PF para determinar os parâmetros ideais para a inativação dos patógenos de origem alimentar. / In the present study, a set of three experiments were conducted aiming to evaluate the occurrence of Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes in three dairy plants (A, B and C) from Southeast region of Brazil from December 2013 to April 2015 (Experiment 1), the efficiency of peracetic acid (PAA) and cold plasma (CP) jet treatment to inactivate the isolates at different times (Experiment 2) and the ability of the isolates to produce biofilms on polystyrene and stainless steel surface, along with inactivation and removal of biofilms by PAA (Experiment 3). In Experiment1, samples of milk and cheese, food contact surfaces and non-food contact were analyzed. L. monocytogenes was isolated in only one sample (0.3%, N=349) of drain sponge swab in dairy plant B, while 6 (1.7%, N=349) S. aureus strains were isolated from handlers\' glove in dairy plant A, brine in dairy plant B and cheese surface, cheese utensil, worker\'s boot and worker\'s left hand in dairy plant C. Although the incidences of those two food-borne pathogens in the dairy plants evaluated were low, their presence also indicates the need for control strategies to prevent their persistence and cross-contamination. In Experiment 2, PAA (0.5%) and CP jet treatment were applied directly on suspensions of S. aureus and L. monocytogenes strains. Reduction of bacterial load (nearly 7 log cycles) was achieved with 15 sec. of PAA treatment of all strains, whereas CP treatment reduced approximately 2 log cycles after 2 min. Hence, plasma treatment has a potential for reducing the bacterial load on surfaces, although further studies using longer CP treatment times are necessary to fully describe the kinetics of this technology for inactivation of important food pathogens. In Experiment 3, PAA (0.5%) treatment at different times (0-control, 15, 30, 60 and 120 sec.) was evaluated for removing of adherent cells of 4 strains of S. aureus and one strain of L. monocytogenes on polystyrene plates, as well as for inactivation of biofilms of those strains on stainless steel. PAA treatment removed (p&lt;0.05) all the S. aureus cells from the surface, with no difference (p&gt;0.05) in the reduction of the biofilm-forming index at the treatment times. However, no effect (p&gt;0.05) was observed on L. monocytogenes adhered cells. Epifluorescence microscopy showed that all bacterial strains tested were partially and completely inactivated after 15 sec. and 30 sec., respectively. Results indicate a potential use of PAA against biofilms formed by S. aureus and L. monocytogenes, and the need of further studies with CP to determinate the ideal parameters for inactivation of food-borne pathogens.

Amostras de biofilme de biomassa suspensa de tanque de aeração de lodo ativado, de córrego contaminado com esgoto e de vários pontos de planta de tratamento de água foram analisadas com relação à presença de bactérias indicadoras e patogênicas. Nos testes presuntivos foram detectados todos os microrganismos-alvo (Coliformes, Salmonella spp, Klebsiella spp., Staphylococcus spp., Pseudomonas spp., Enterococcus spp., Vibrio spp., Clostridium spp., Shigella spp., Aeromonas spp., Campylobacter spp. e Legionella spp.), porém nos testes confirmatórios por PCR e teste bioquímico somente as espécies E. coli, Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Typhi, K. pneumoniae, V. cholerae, A. hydrophila, e L. pneumophila foram confirmadas para algumas cepas selecionadas dos testes presuntivos. S. flexneri foi somente confirmada por teste bioquímico e S. aureus somente por PCR. Nenhuma amostra de C. jejuni foi confirmada por nenhum dos testes. Estes resultados demonstram que os meios seletivos para testes presumptivos não se mostraram confiáveis uma vez que muitas amostras presuntivas não foram confirmadas por PCR ou teste bioquímico específico. Estes resultados demonstram o potencial de biofilmes como reservatório de patógenos. / Biofilm samples from activated sludge reactors, surfaces from water treatment plants and water samples from a creek contaminated with raw sewage were analyzed for the presence of microbial indicator bacteria and pathogens. All target organisms (Coliforms, Salmonella spp, Klebsiella spp., Staphylococcus spp., Pseudomonas spp., Enterococcus spp., Vibrio spp., Clostridium spp., Shigella spp., Aeromonas spp., Campylobacter spp. and Legionella spp.) were detected by using presumptive testing media. Only a small proportion of positive colonies from presumptive tests were confirmed as pathogenic strains of E. coli, Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Typhi, K. pneumoniae, V. cholerae, A. hydrophila, and L. pneumophila in confirmatory testing by selective PCR and biochemical tests. S. flexneri was only confirmed in biochemical tests, S. aureus only by PCR and no colony of C. jejuni was confirmed positive by either PCR or biochemical testing. Presumptive media are therefore not safe means for assessing pathogen load in biofilm samples. These results demonstrate the importance of microbial biofilms as reservoirs for microbial pathogens.

A exposição humana a microrganismos patogênicos e suas toxinas em alimentos constitui um grave problema de saúde pública. O uso indiscriminado de antimicrobianos convencionais promove o aumento da resistência dos microrganismos às principais moléculas existentes no mercado. Além disso, as limitações do uso de substâncias químicas em matérias primas alimentares têm estimulado pesquisas para o desenvolvimento de metodologias eco-amigáveis para evitar a multiplicação de fungos e/ou eliminar suas toxinas. O Staphylococcus aureus é uma das principais bactérias patogênicas que apresenta taxas elevadas de resistência aos antimicrobianos, e por este motivo tem sido objeto de estudo de pesquisas que tentam identificar novos compostos bioativos para o combate de infecções. O Aspergillus parasiticus é um dos principais fungos produtores de aflatoxinas, substâncias carcinogênicas que contaminam diversos tipos de cereais antes e após o processamento. Estudos recentes demonstraram que extratos de plantas possuem atividade antimicrobiana e antifúngica, além de potencial para degradação de micotoxinas. Neste contexto, o presente estudo teve por objetivos avaliar a atividade antimicrobiana in vitro de extratos brutos e liofilizados de folhas de maracujá, araçá, alecrim e orégano sobre células planctônicas de S. aureus e A. parasiticus, bem como verificar a capacidade dos referidos extratos em degradar in vitro a aflatoxina B1 (AFB1), ocratoxina A (OTA) e zearalenona (ZEA). Os efeitos antibacterianos e antifúngicos dos extratos foram avaliados através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida / fungicida mínima (CBM/CFM). Os ensaios de degradação da micotoxinas foram realizados em diferentes tempos de incubação (12-48 h) a 37º C, utilizando-se cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para determinação das concentrações das micotoxinas. O maracujá não demonstrou atividade antimicrobiana tanto para S. aureus quanto para A. parasiticus. Dos quatro extratos estudados, o araçá demonstrou o maior efeito antibacteriano, cujos valores de CIM para extratos bruto e liofilizado foram 0.39 mg/mL e 0.45 mg/mL, respectivamente. Os menores valores de CIM para A. parasiticus foram obtidos com o orégano liofilizado (8.33 mg/mL) e o araçá bruto (3.215 mg/mL). Contudo, não foi possível identificar valores de CFM para o fungo analisado. Não houve efeito de degradação de OTA e ZEA por nenhum dos extratos avaliados. Todos os extratos reduziram a concentração de AFB1 após 48 h de incubação. A maior porcentagem (60.3%) de redução de AFB1 foi obtida com o extrato de alecrim após 48 h de incubação. A atividade antimicrobiana demonstrada pelos extratos das plantas avaliadas indica um potencial para sua aplicação no combate a bactérias patogênicas e fungos toxigênicos. Este é o primeiro estudo realizado com extratos dessas quatro espécies de plantas que evidenciou a capacidade de redução in vitro de AFB1. / Human exposure to pathogenic microorganisms and their toxins in food is a serious public health problem. The indiscriminate use of conventional antimicrobials increases the resistance of microorganisms to the main molecules available in the market. In addition, limitations on the use of chemical substances in food raw materials have stimulated researches for the development of eco-friendly methodologies to avoid the multiplication of fungi and/or eliminate their toxins. Staphylococcus aureus is one of the major pathogenic bacteria with high rates of antimicrobial resistance, and for this reason it has been the subject of research studies aiming to identify new bioactive compounds to combat infections. Aspergillus parasiticus is one of the main aflatoxin-producing fungi, which are carcinogenic substances that contaminate many types of cereals before and after processing. Recent studies have demonstrated that plant extracts have antimicrobial and antifungal activity, as well as potential for degradation of mycotoxins. In this context, the objective of the present study was to evaluate the in vitro antimicrobial effects of crude and lyophilized extracts of leaves from sweet passion fruit, araçá, rosemary and oregano on planktonic cells of S. aureus and A. parasiticus. The in vitro degradation of aflatoxin B1 (AFB1), ochratoxin A (OTA) and zearalenone (ZEN) by the crude extracts was also investigated. The antimicrobial and antifungal effects were evaluated by determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal / fungicidal concentration (MBC / MFC). Mycotoxin detoxification assays were conducted at different incubation times (12-48h) at 37 °C. The concentrations of mycotoxins were determined by high performance liquid chromatography (HPLC). Sweet passion fruit had no antimicrobial activity on S. aureus or A. parasiticus. Out of the four extracts evaluated, araçá showed the highest antimicrobial effect with MIC of 0.39 mg/mL and 0.45 mg/mL for crude and lyophilized extracts, respectively. The lowest MIC values for A. parasiticus were obtained with lyophilized oregano (8.33 mg/mL) and crude araçá (3.215 mg/mL). However, no MFC values were obtained for the analyzed fungi. Although OTA e ZEN were not degraded by any extract evaluated, all extracts reduced the concentration of AFB1 after 48 h of incubation. The highest percentage of AFB1 reduction (60.3%) was obtained with rosemary extract after 48h of incubation. The antimicrobial activity demonstrated by extracts of the evaluated plants indicates a potential for application against pathogenic bacteria and toxigenic fungi. This is the first study carried out with extracts of these four plants species that demonstrated the in vitro ability for AFB1 reduction.

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The rate at which bacterial pathogens are becoming resistant to antibiotics is quite alarming, and therefore much attention has been focussed on this area. The mechanism whereby the bacterial cells acquire resistance is studied in order to determine how this process works as well as to determine if any future resistance mechanisms can be circumvented. In this study three different genera and the antibiotics that are resistant to them were used, namely, penicillin resistant Streptococcus, vancomycin resistant Enterococcus and methicillin resistant Staphylococcus. The results prove that the active sites SXXK, SXN and KT(S) G in the penicillin resistance Streptococcus plays a major role in resistance. It is seen in this study that the SXXK active site is found in all the resistant and most of the intermediate strains, therefore proving to be an important component of the cell wall resistance. It was subsequently noticed the greater the number of mutations found in the sequences the higher the resistance. Three dimensional structures showed the actives sites and their binding pockets. The results also show the change in conformation with a mutation in the active site. The results also proved that the Penicillin Binding Protein (PBP) genes essential for resistance are PBP Ia, PBP 2b and PBP 2x. The results obtained, for the vancomycin resistance in Enterococcus study, proved that the VanC and VanE cluster are very much alike and VanE could have evolved from VanC. There is also close similarity between the different ligase genes. The VanX 3D structure shows the position of the critical amino acids responsible for the breakdown of the D-Ala-D-Ala precursors, and the VanA ligase 3D structure shows the amino acids responsible the ligation of the D-Ala-D-Lac precursors. The analysis performed on the methicillin resistance in Staphylococcus study showed that the genes used to confer resistance are very similar between different strains as well as different species. / Thesis (M.Sc.)-University of KwaZulu-Natal, Pietermaritzburg, 2005.