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La pneumopathie interstitielle (PI) est devenue la principale cause de décès de la sclérodermie systémique (ScS). Au cours de PI, l’activation immunitaire déclenche une forte production du monoxyde d’azote (NO) et l’augmentation de la concentration de NO dans l’air expiré des patients atteints de ScS avec PI suggère que cette méthode pourrait détecter précocement l’alvéolite, afin de traiter à temps la PI pour éviter son évolution vers la fibrose pulmonaire. En utilisant le modèle à deux compartiments séparant le NO alvéolaire (CANO) du NO bronchique, nous avons montré que la CANO est : (1) augmentée chez les patients atteints de ScS comparativement aux volontaires sains; (2) associée à l’alvéolite et (3) corrélée à la sévérité de la PI. De plus, une valeur de CANO = 10,8 ppb permettait d’affirmer la présence de la PI et une valeur = 3,8 ppb, d’écarter l’existence d’une PI avec une valeur prédictive= 95%. Le modèle bi-compartimenté néglige la distribution arborisée des voies aériennes et la diffusion axiale du NO, que prend en compte le nouveau « modèle de la trompette ». Les résultats de CANO des 2 méthodes sont comparables (rho=0,98, p<0.001). Enfin, La capacité des sérums à induire la prolifération des fibroblastes pulmonaires et sa conversion en myofibroblaste est augmentée chez les patients atteints de ScS avec une CANO > 5ppb par rapport à celle des patients atteints de ScS qui ont une CANO = 5 ppb et à celle des volontaires sains. Nos résultats suggèrent une relation possible entre l’inflammation alvéolaire et la fibrose pulmonaire au cours de la ScS / Interstitial lung disease (ILD) has become the main cause of death in systemic sclerosis (SSc). In ILD, immune activation leads to strong nitric oxide (NO) output by inducible NO synthase. Increased the whole fractional rate of NO in exhaled air has been reported in SSc patients with ILD and suggested that exhaled NO can be an accurate none-invasive marker of early alveolar inflammation in order to initiate in time treatment. The two compartment-model method partitioned exhaled NO into alveolar concentration (CANO) and conducting airway flux, We hypothesized that overproduction of NO in the lung eventually leads to ILD in SSc. We have found that CANO is significantly increased in SSc patients as compared with healthy controls. We have also demonstrated that high levels of CANO were related to alveolitis and the severity of ILD in SSc. Moreover, we have found that ILD could be ruled in (positive predictive value > 95%) when CANO = 10.8 ppb, and ruled out when CANO values = 3.8 ppb (negative predictive value > 95%). The two-compartment model neglected the trumpet shape of airway tree and the axial diffusion of NO that the advanced “trumpet model” takes account. We have found that CANO levels assessed by the two models were comparable (rho=0,98, p<0.001). Finally, we have found that the serum ability to induce lung fibroblast proliferation and myofibroblast transition was increased in SSc patients with high levels of CANO (>5ppb) as compared to SSc patients with low levels of CANO (=5ppb) and healthy controls. Our findings suggest a possible link between alveolar inflammation, and lung fibrosis in SSc. 1624 caractères avec espace

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Das Rett-Syndrom ist eine postnatale neurologische Entwicklungsstörung, der eine Mutation im Methyl-CPG-bindenden Protein 2 (MECP2) zugrunde liegt. Es betrifft überwiegend Mädchen und geht mit kognitiven Beeinträchtigungen, motorischen Stereotypien und Atmungsstörungen einher. Es existieren vielfältige Hinweise dafür, dass die Pathogenese des Rett-Syndroms im Zusammenhang mit einer beeinträchtigten Mitochondrienfunktion steht. Genetische Untersuchungen des Rett-Genoms zeigten, dass eine Untereinheit des Komplex III der Atmungskette dysreguliert ist und die innere Mitochondrienmembran ein Protonenleck aufweist. Weiterhin fanden sich Hinweise für erhöhten oxidativen Stress in Blut- und Liquoruntersuchungen. Um den intrazellulären Redox-Status zu quantifzieren, wurde die genetisch kodierte optische Sonde roGFP1 verwendet, die semiquantitative Messungen reaktiver Sauerstoffspezies ermöglichte. Es zeigte sich, dass Mecp2(-/y)-Hirnschnitte bereits unter Ruhebedingungen erhöhtem oxidativen Stress ausgesetzt sind. Auf der Suche nach der Ursache wurden die intrazellulären antioxidativen Schutzenzyme Superoxid-Dismutase und Katalase sowie das Glutathionsystem überprüft. Alle drei Enzymsysteme zeigten Funktionsstörungen und waren nicht in der Lage, extern applizierten oxidativen Stress im gleichen Umfang zu kompensieren wie die Enzyme der Wildtyp-Vergleichsgruppe. Um die zytosolischen Redox-Verhältnisse zu beeinflussen, wurden Untersuchungen mit den Antioxidantien Ascorbat, Trolox und Melatonin vorgenommen. Dabei zeigte sich, dass Antioxidantien eine potentielle pharmakologische Maßnahme darstellen, um die zu oxidativen Verhältnissen verschobene Redox-Homöostase in Mecp2(-/y)-Hippokampi zu senken und folglich zu normalisieren. Vor allem das Vitamin E-Derivat Trolox stellte sich als wirkungsvoller Radikalfänger heraus und bietet sich für weitere detaillierte Untersuchungen hinsichtlich einer therapeutischen Option des Rett-Syndroms an. Die externe Störung der mitochondrialen Funktion durch die Induktion einer transienten Hypoxie sowie die gezielte Inhibition verschiedener Atmungskettenkomplexe zeigte eine deutlich erhöhte Hypoxieempfindlichkeit der Mecp2(-/y)-Hippokampi und war mit einer erhöhten ROS-Produktion verbunden. In der Arbeit gelang es erstmals, die bereits mehrfach postulierte Störung der Redox-Homöostase im Rett-Syndrom direkt auf zellulärer Ebene nachzuweisen. Die erhobenen Befunde liefern mögliche mechanistische Erklärungsansätze für die Störung der synaptischen Plastizität im Rett-Syndrom, da es klare Verbindungen zwischen dem zellulären Redox-Status und dem Kalziumhaushalt gibt, der durch redoxsensitive Proteine mitreguliert wird. Somit konnte eine zentrale Dysregulation der Erkrankung identifziert werden, die unter Umständen auch neue pharmakologische Angriffspunkt aufzeigt, um die Symptomatik des Rett-Syndroms zu mildern.

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Die Expression von natriumabhängigen und natriumunabhängigen Transportern für Sulfat in Nieren und Leber ist für die Sulfathomöostase unabdingbar. Ein natriumunabhängiger Transporter für Sulfat ist der Sulfat-Anionen-Transporter 1, sat-1, der Sulfat im Austausch gegen Oxalat, Bicarbonat, Chlorid und Glyoxylat sowohl in die Zellen aufnehmen als auch in das Blut abgeben kann. In dieser Arbeit wurde die Transportfunktion des Sulfat-Anionen-Transporters 1 der Ratte, rsat-1, untersucht. Das Ziel war eine genauere Kenntnis über den Einfluss von Chlorid, des intrazellulären pH-Wertes und der extrazellulären Calciumkonzentration auf den Sulfattransport durch rsat-1 zu erlangen. Als Expressionssystem für rsat-1 wurden Oozyten des Krallenfrosches Xenopus-laevis verwendet. Elektrophysiologische Versuche, die im „Current-Clamp-Modus“ durchgeführt wurden, ermöglichten die Messung von substratinduzierten Potentialänderungen. Durch radiochemische Versuche konnte die Sulfataufnahme durch sat-1 unter variierenden Bedingungen bestimmt werden. Die Rolle des Chlorids in Hinblick auf den Sulfattransport durch sat-1 konnte nicht gänzlich geklärt werden. Da Thiosulfat und Nitrat in den durchgeführten Versuchen die Aufnahme von [35S]Sulfat über rsat-1 hemmten, könnte das Stickstoffatom den Transport von Sulfat beeinflussen. Intrazellulär an Chlorid verarmte rsat-1-exprimierende Oozyten nahmen in den durchgeführten Versuchen vermehrt [35S]Sulfat auf. Des Weiteren konnte eine Steigerung der [35S]Sulfataufnahme in chloridreduzierten, gluconat- beziehungsweise mannithaltigen Lösungen beobachtet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind mit einer allosterischen oder kompetitiven Hemmung der Aufnahme von Sulfat durch Chlorid vereinbar. Eine genauere Untersuchung des Chloridtransports über sat-1 wäre durch Versuche mit radioaktiv markiertem Iod¹²⁵ möglich, das wie Chlorid transportiert wird. Die intrazelluläre Ansäuerung der Oozyten durch Ammoniumchlorid führte zu einer erhöhten [35S]Sulfataufnahme in die rsat-1-exprimierenden Oozyten. Diese könnte durch eine verminderte Bicarbonatkonzentration an der äußeren Zellmembran mit einer reduzierten kompetitiven Hemmung begründet sein. Ebenso könnte Ammoniumchlorid durch eine protonierende Wirkung eine Konformationsänderung mit einer Affinitätssteigerung von sat-1 für Sulfat zur Folge haben. Mit steigender Calciumkonzentration wurde die Depolarisation rsat-1-exprimierender Oozyten in chloridreduzierten und gluconathaltigen Lösungen geringer. Dies ist mit bereits vorliegenden Daten vereinbar, in denen Xenopus laevis Oozyten in chloridreduzierten Medien depolarisieren.

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La prééclampsie est une maladie fréquente de la grossesse, caractérisée par l'apparition de novo d'une hypertension et d'une protéinurie à partir de la 20ème semaine d'aménorrhée. Ces symptômes s'aggravent au long de la grossesse, conduisant éventuellement à la mort maternelle en l'absence de prise en charge médicalisée. La thérapeutique définitive l'extraction du placenta, et donc du fœtus, ce qui induit une importante prématurité iatrogène. Les causes restent mal définies, mais il est bien admis que des anomalies au niveau de la mise en place du placenta sont au cœur de sa physiopathologie. Un défaut d'invasion trophoblastique des artères spiralées utérines semble être une constante de la maladie. Des données épidémiologiques démontrent qu'il existe une forte composante génétique dans la prééclampsie, et en 2005, un clonage positionnel dans des familles hollandaises, aboutit à l'identification de STOX1 comme le premier gène lié à cette maladie. STOX1 code un facteur de transcription intervenant dans le contrôle de la prolifération et de l'invasion des trophoblastes. Dans notre laboratoire, l'étude de STOX1 a été initiée par surexpression dans des cellules de choriocarcinome humain (modèle de trophoblastes) suivie d'une analyse transcriptomique. Celle-ci a révélé que les altérations d'expression génique observées suite à la surexpression de STOX1 étaient significativement corrélées à celles trouvées dans des placentas prééclamptiques. La création de souris transgéniques exprimant la version humaine de STOX1 sous le contrôle d'un promoteur ubiquitaire a alors été entreprise. Mes travaux de thèse ont principalement consisté à caractériser le phénotype de ces souris. Nous avons décidé de croiser des mâles transgéniques avec des souris sauvages afin de limiter l'expression du transgène à l'unité fœto-placentaire. Ces souris sauvages développent au cours de leur gestation une hypertension sévère, et une protéinurie. Elles constituent donc un nouveau modèle de prééclampsie. De plus, nous avons observé des anomalies que l'on trouve également chez les patientes : une fibrose rénale, une élévation des taux sériques de facteurs pro-angiogéniques (le récepteur soluble du VEGF et l'endogline soluble). Ces souris ont également des marqueurs d'hypertrophie cardiaque, attestant de l'impact sévère de l'hypertension. Pour mieux comprendre comment STOX1 peut induire ce syndrome, nous avons étudié son impact dans le modèle cellulaire surexprimant STOX1 et nous avons pu montré une altération de la gestion du stress oxydatif et de la fonction mitochondriale. En conclusion, nous avons obtenu et caractérisé un modèle de prééclampsie sévère, le seul existant montrant un phénotype hypertensif très marqué et très précoce. Ce modèle est un outil puissant pour découvrir de nouvelles voies impliquées dans la physiopathologie de la prééclampsie, pour rechercher de potentiels marqueurs diagnostiques précoces, tester des approches thérapeutiques innovantes et explorer les mécanismes responsables des conséquences à long terme de la prééclampsie.