Enzymic systems able to hydrolyze the compounds forming the supporting structure of plant tissues have a major effect upon the texture of fruit products. The objective of this thesis was the development of a theory to explain the textural changes in fresh and processed strawberries. The presence of pectinolytic enzymes and the substrates upon which they act were studied. In addition the activity of cellulase was investigated. The following conclusions were made: 1. An endopolymethylgalacturonase exists in Northwest strawberries which catalyzes the hydrolysis of pectins, pectates and protopectins. 2. The strawberry endopolymethylgalacturonase indicated a maximum activity at pH values between 4.5 and 5.5. 3. The degree of methylation of the substrate did not appear to have an influence upon the activity of the enzymes. This enzyme demonstrated the same rate of action upon Na pectate and citrus pectin. 4. Sodium chloride solutions at concentrations up to 0.50 M and calcium ion at concentration 0.01 M did not show any effect on the activity of the strawberry endopolymethylgalacturonase in citrate buffer at pH 5.0. 5. The strawberry endopolymethylgalacturonase was inactivated after heating at 212°F for approximately 35 minutes in citrate buffer at pH 5.0. 6. Non-enzymic hydrolysis of the strawberry pectic substances occurs and hydrolysis is more pronounced at lower pH values. 7. The pectinesterase activity in Northwest strawberry is low in comparison with tomato fruits. The optimum activity of strawberry P.E. occurred at pH 7.5. 8. While cellulase activity existed in Northwest strawberries, the strawberry cellulase did not hydrolyze the insoluble strawberry cellulose. / Graduation date: 1964

Orientador: Eleonora Cano Carmona / Banca: João Atílio Jorge / Banca: Rubens Monti / Resumo: O fungo Aspergillus giganteus produz uma única poligalacturonase (PG) quando cultivado em meio líquido com pectina de citrus como única fonte de carbono, e pelo menos três pectina liases (PL) quando cultivado em meio líquido com resíduo de laranja como fonte de carbono. A PG de A. giganteus foi purificada em duas etapas: precipitação de proteínas com 70% de saturação com sulfato de amônio e troca aniônica. A PG purificada apresentou massa molar de 69,7±0,07 kDa. A máxima atividade da enzima foi observada em pH 6,0 a 55-60ºC, sendo essa estável em meio neutro e alcalino. A PG apresentou meias-vidas de 115, 18 e 6 min quando incubada a 40, 50 e 55 ºC, respectivamente. A enzima mostrou-se ativa sobre substratos de qualquer grau de metilação, com maior especificidade para substratos de baixa ou nenhuma metilação, apresentando Vmax 669,6 e 602,8 μmol/mg.min, Km 3,25 e 1,16 mg/mL, kcat 770 e 690 s-1 sobre pectina de citrus 34 % esterificada e ácido poligalacturônico, respectivamente. A PG apresentou atividade exo liberando apenas ácido galacturônico como produto de hidrólise. 2-Mercaptoetanol, DTT, Co2+, Mn2+, Mg2+, NH4 + e Na+ agiram como estimulantes da atividade PG. Já Hg2+, EDTA, citrato de sódio, ácido iodoacético, SDS, Ba2+, Cu2+, Pb2+ e Zn2+ inibiram essa atividade enzimática. A principal pectina liase de A. giganteus, a PL I, foi purificada em três etapas: troca aniônica, troca catiônica e filtração em gel. A massa molar da PL I foi estimada em 55,7±1,4 kDa. A máxima atividade da enzima foi obtida em pH 8,5 a 50ºC. A PL I apresentou meias-vidas de 19, 9 e 6 min a 40, 45 e 50ºC, respectivamente. As maiores atividades da PL I foram observadas em pectinas de citrus com 34 e 72% de metilação, nas quais apresentou Vmax 1.488,1 e 1.129,8 U/mg.min, respectivamente, e Km 4,8 mg/mL para ambos os substratos. O padrão de degradação da pectina...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Aspergillus giganteus produces one polygalacturonase (PG) on liquid medium with citrus pectin as the only carbon source, and at least three pectin lyases (PL) with orange waste. Homogenous PG was obtained after two steps: protein precipitation with 70 % ammonium sulphate saturation and anionexchange chromatography. The purified PG showed molecular weight of 69.7±0,07 kDa. The enzyme exhibited maximal activity at pH 6.0 and 55-60 °C, and was stable in neutral and alkaline medium. The half-live for PG at 40, 50 and 55 °C was 115, 18 and 6 min, respectively. The enzyme was active on substrates with any methyl-esterification degree, and hydrolysed better low esterified and not esterified substrates, showing Vmax 669.6 and 602.8 μmol. mg-1.min-1, Km 3.25 and 1.16 mg/mL, kcat 770 and 690 s-1 on 34 % esterified citrus pectin and polygalacturonic acid, respectively. The unique soluble product released in the reaction with pectin and polygalacturonic acid was monogalacturonic acid, and according to this results the enzyme can be classified as exoPG. PG activity enhanced in presence of 2-mercaptoethanol, DTT, Co2+, Mn2+, Mg2+, NH4 + and Na+, and was completely inhibited in presence of Hg2+. EDTA, sodium citrate, iodoacetic acid, SDS, Ba2+, Cu2+, Pb2+ and Zn2+ inhibited enzyme activity. The main PL from A. giganteus was called PL I and was purified after three steps: anion-exchange and cation-exchange chromatographies, and gel filtration. The purified PL I showed molecular weight of 55.7±1.4 kDa. The enzyme exhibited maximal activity at pH 8.5 and 50 °C, and was stable in neutral and acid medium. The half-live for PL I at 40, 45 and 50 °C was 19, 9 and 6 min, respectively. The enzyme was more active on citrus pectins with 34 and 72% of esterification, showing Vmax 1,488.1 and 1,129.8 U. mg-1.min-1, repectively, and Km 4.8 mg/mL on both substrates. The degradation pathern on 34% esterified...(Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientadores: Ranulfo Monte Alegre, Antonio Jose de Almeida Meirelles / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-01T14:56:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_AlvaroSilva_D.pdf: 50549034 bytes, checksum: cd55eea726075aec85a0bc9066722c16 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: As enzimas pectinolíticas degradam as substâncias pécticas e são utilizadas na clarificação de sucos e vinhos. Dentre elas destacam-se a poligalacturonase (PG), pectina-esterase (PE) e pectina-liase (PL). Estas enzimas foram produzidas em fermentação submersa utilizando os microrganismos Aspergillus niger NRRL-3122, Humicola grisea CCT-2664, Penicillium italicum IZ-1584 e Pichia canadensis CCT-2636 em 3 diferentes meios de cultura (contendo pectina, pectina e sacarose e pectina e glicose). A. niger produziu maiores atividades de exo-PG (0,73 U/mL em meio contendo sacarose) e de endo-PG (56,83 U/mL em meio contendo glicose), já a PL foi produzida com maior atividade em meio contendo glicose (0,210 U/mL) utilizando-se P. canadensis e PE em meio contendo apenas pectina como fonte de carbono (0,076 U/mL) utilizando-se H. grisea. Sistemas aquosos bifásicos (SAB) são empregados no processo de purificação e fracionamento de enzimas. Foram formados sistemas Polietileno glicol (PEG)/fosfato de potássio, PEG/citrato de sódio e PEG/maltodextrina usando-se enzimas comerciais e enzimas produzidas através de fermentação com A. niger, estudou-se o efeito da massa molecular do PEG e da adição de NaCI sobre o fator de purificação (FP) em cada fase, a recuperação (R) em cada fase e o coeficiente de partição (K) das enzimas em SAB. Os sistemas com a enzima comercial apresentaram maiores FP em sistema PEG/fosfato na fase de topo, rica em PEG, sem adição de NaCI para PEG de alta massa molecular: PEG-8000 (exo-PG com FP= 16,64 vezes, R=49,1% e K= 1,14) e PEG-10000 (PE com FP=14,27 vezes, R= 49,1% e K=1,14; PL com FP=14,27 vezes, R= 42,3% e K= 0,86 e endo-PG com FP= 16,28 vezes, R=53,5% e K= 0,18). Utilizando-se o caldo de cultura fermentado obteve-se melhores resultados com adição de NaCI em sistemas PEG/citrato com PEG-3350 (PL com FP=13,61 vezes, R= 69,3% e K=1,93; exo-PG com FP=10,52 vezes, R= 53,6% e K= 0,98) e com PEG-10000 (endo-PG com FP= 4,41 vezes, R= 51,3% e K= 0,55) e sem adição de NaCI com PEG-3350 (PE com FP= 6,31 vezes, R= 47,9% e K= 0,62). / Abstract: Pectinolíticas enzymes degrade molecules of pectic substances and are used to clear juices and wines. Among them we stand out poligalacturonase (PG), pectinesterase (PE) and pectinlyase (PL). These enzymes have been produced by submerged fermentation using Aspergillus niger NRRL-3122, Humicola grisea CCT-2664, Penicillium italicum IZ-1584 and Pichia canadensis CCT-2636 microrganisms in 3 different culture media (containing pectin, pectin and sucrose and pectin and glucose). Aspergillus niger has produced the best activities of exo-PG (0.73 U/mL in medium containing sucrose) and of endo-PG (56.83 U/mL in medium containing glucose). PL, through, has been produced better in medium containing glucose (0.210 U/mL) using P. canadensis and PE in medium containing just pectin as carbon source (0.076 U/mL) using H. grisea. Aqueous two-phase systems are used in the process of purifcation and fragmentation of enzymes. There has been formed PEG/phosphate, PEG/citrate and PEG/maltodextrin systems using commercial enzymes and produced by A. niger observing the effect of molecular weight of PEG and in addition of NaCI in the purification factor (FP), yield (R) and partition coefficient (K). The commercial enzyme systems have presented more FP in the upper phase without addition of NaCI in PEG/phosphate system with a high molecular PEG weight: PEG-8000 (exo-PG with FP = 16.64 times, R = 49,1% and K = 1.14) and PEG-10000 (PE with FP=14,27 times, R = 49,1% and K=1,14; PL with FP=14,27 times, R = 42,3% and K = 0.86 and endo-PG with FP = 16.28 times, R = 53,5% and K = 0.18). Using the fermented broth of culture there has been better results in addition of NaCI in the systems PEG/citrato with PEG-3350 (PL with FP=13,61 times, R = 69,3% and K=1,93; exo-PG with FP=10,52 times, R = 53,6% and K = 0.98) and with PEG-10000 (endo-PG with FP = 4,41 times, R = 51,3% and K = 0.55) and without addition of NaCI with PEG-3350 (PE with FP = 6,31 times, R = 47,9% and K =0.62). / Doutorado / Doutor em Engenharia de Alimentos

Pectinmethylesterase (PME) activity in fresh cucumber fruit was determined. The effects of several cationic species, temperature, pH, and acetic acid on the activity of cucumber PME was investigated. The efficacy of blanching, infiltration with CaCl₂ or acetic acid, and fermentation with 0 and 40 mM CaCl₂ on inhibition of cucumber PME activity were evaluated. Over 50% of PME activity was present in the skin and 75% occurred within the outer 3 mm of the fruit. Maximum stimulation of PME occurred at 125 mM NaCl, 200 mM KCl, and 5 mM CaCl₂. Higher levels of each cation demonstrated inhibition of PME activity. 50% inhibition was observed at 750 mM NaCl, 800 mM KCl, and 200 mM CaCl₂. Optimum pH was 8.0 and acid pH conditions greatly reduced activity. PME exhibited no activity at pH 4.0. PME activity responded typically to temperature variations with maximum activity occurring at 50°C. The temperature coefficient Q¹⁰ for PME activity between 10 and 40°C was 1.24. PME activity was slightly stimulated by increased levels of acetic acid and reached its maximum at 1.5% acetic acid at pH 7.5. No inhibitory effect on PME was detected at acetic acid levels of 0 to 2.0%. Inhibition of PME by NaCl and CaCl₂ was reversible. High levels of NaCl (1 M) stabilized PME activity while incubation of PME activity in low levels of NaCl (0.24 M) resulted in loss of activity over time. Both high (500 mM) and low (5 mM) levels of CaCl₂ imparted stability to PME activity. No detectable PME activity remained in cucumbers after 15 days of fermentation. Addition of CaCl2 (40 mM equilibrated) to the fermentation brine caused a rapid reduction in PME activity during the first 6 to 12 hours after brining. After 24 hours of brining there was no difference in PME activity due to CaCl₂ addition. Acetic acid infiltration at high levels (>10%) effectively reduced the pH of skin tissue to near 4 and resulted in complete inhibition of PME activity. The most effective treatment for controlling cucumber PME activity was rapid pH reduction by acetic acid infiltration and resulting in PME inhibition. Infiltration with very high CaCl₂ levels (>500 mM) may also be beneficial toward accomplishing PME inhibition. Rapid inactivation prior to brining or within 6 to 12 hours after brining is necessary to achieve effective control of cucumber PME activity. / Graduation date: 1989

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by giuliana silveira (giulianagphoto@gmail.com) on 2016-04-12T18:33:25Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ProduçãoPurificaçãoCaracterização.pdf: 1800894 bytes, checksum: 81ba847b0ec8fcfae1907bb11bb2a53e (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2016-04-12T19:06:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ProduçãoPurificaçãoCaracterização.pdf: 1800894 bytes, checksum: 81ba847b0ec8fcfae1907bb11bb2a53e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-12T19:06:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ProduçãoPurificaçãoCaracterização.pdf: 1800894 bytes, checksum: 81ba847b0ec8fcfae1907bb11bb2a53e (MD5) Previous issue date: 2016 / Os objetivos deste trabalho foram cultivar o fungo Chrysoporthe cubensis em diferentes fontes de carbono de baixo custo, para induzir a produção da poligalacturonase, purificar e caracterizar a enzima, para identificar propriedades funcionais interessantes para possíveis aplicações biotecnológicas. O fungo foi cultivado em meio semi sólido (67% de umidade), com farelo de trigo, casca de maracujá e casca de laranja, além disso os resíduos de frutas foram misturados ao farelo nas proporções 1:1, 3:1 e 9:1 (farelo: resíduo de fruta). O fungo apresentou maior produção da poligalacturonase em meio composto por farelo de trigo e casca de maracujá (3:1), com atividade de 41.49 U/g de substrato, sendo 1,32 vezes maior do que no cultivo em farelo de trigo puro. O extrato enzimático bruto foi purificado a partir da cromatografia de troca iônica DEAE-Sepharose, seguida por cromatografia em gel filtração em coluna Sephacryl S-200, exibindo atividade específica de 1117,45U/mg, com aumento de 28,34 vezes e rendimento final de 29,2 %. A massa molecular da poligalacturonase, obtida através de SDS-PAGE 12% foi de, aproximadamente, 40,74Kd. A enzima apresentou pH e temperatura ótimos de 3,5 e 50°C, repectivamente, e meia vida de 4,05 minutos a 50°C. A enzima se manteve estável na faixa de pH de 2,5 a 8,5, apresentando acima de 80% da atividade após 1h. O substrato preferencial da enzima foi o ácido poligalacturônico e o km e Vmax foi de 0,766 mg.mL-1 e 1,88U/mL, respectivamente. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a PG de C. cubensis é uma enzima importante dentro do complexo hidrolítico secretado pelo fungo quando cultivado em SSF, em meio contendo resíduos agroindustriais. __________________________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT : The aims of this study were to cultivate the fungi Chrysoporthe cubensis on differents inexpensive carbon sources, to induce polygalacturonase production, purify and characterize the enzyme to identify interesting functional properties for potential biotechnological applications. The fungi was grown in semi solid (67% moisture) with wheat bran, passion fruit peel and orange peel, in addition, the waste fruits were mixed with the meal in the ratios 1: 1, 3: 1 and 9: 1 (bran: fruit residue). The fungus showed increased production of polygalacturonase in medium composed of wheat bran and passion fruit peel (3: 1), activity of 41.49 U / g substrate, being 1.32 times higher than that in pure culture in wheat bran. The crude extract enzyme was purified from the ion exchange chromatography DEAE-Sepharose, followed by gel filtration chromatography on Sephacryl S200 column exhibiting specific activity 1117,45U / mg, an increase of 28.34 fold and final yield of 29 ,2 %. The molecular weight of the polygalacturonase obtained by SDS-12% PAGE was approximately 40,74Kd. The enzyme showed pH 3.5 and temperature to 50 ° C, respectively, and a half life of 4.05 minutes at 50 ° C. The enzyme remained stable in the pH range of 2.5 to 8.5, with over 80% of activity after one hour of incubation. The preferred enzyme substrate was polygalacturonic acid and the Km and Vmax was 0.766 mg.mL-1and 1,88 U/mL, respectively. The results of this study indicate that C. cubensis PG is an important enzyme in the hydrolytic complex secreted by the fungus when grown in SSF, in medium containing organic residues.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-06-18Bitstream added on 2014-06-13T19:12:09Z : No. of bitstreams: 1 meneguin_ab_me_arafcf.pdf: 924510 bytes, checksum: c7719c1aa2118e915e7737ccc43d4dc2 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O revestimento de formas farmacêuticas sólidas com polissacarídeos degradáveis pela microflora colônica representa uma importante e confiável estratégia para obtenção de sistemas de liberação cólon-específica de fármacos. No entanto, a maioria dos polímeros naturais, quando utilizados isoladamente e sem uma modificação prévia, apresenta a desvatangem de ser altamente solúvel em água, o que compromete a proteção oferecida pelo revestimento. Tal efeito pode ser evitado através do emprego do amido resistente, o qual possui estrutura cristalina tridimensional mais ordenada e resistência à degradação enzimática nas porções superiores do TGI. Sua posterior associação com a pectina mostra-se interessante, uma vez que ela permanece como agregados de macromoléculas em meio ácido. Além disso, a associação polimérica resulta em características físico-químicas inexistentes nos poliméros isolados. Devido às pesquisas com amido resistente na área farmacêutica ainda ser muito restrita, um estudo detalhado nesse campo faz-se necessário. Filmes de revestimento foram obtidos através do método de evaporação do solvente, a partir de dispersões de alta amilose retrogradada e pectina, às quais foram adicionados os plastificantes glicerina ou propilenoglicol. A caracterização dos filmes foi realizada por análises de reologia, morfologia, propriedades mecânicas, permeabilidade ao vapor d’água, intumescimento e difratometria de raios X. A avaliação do potencial como sistema de liberação cólon específica de fármacos foi realizada através da digestão enzimática in vitro dos filmes de revestimento em meios com diferentes valores de pH. O conjunto de resultados mostrou que a maioria das dispersões poliméricas apresenta comportamento de sistemas pouco organizados, com presença de comportamento... / Coating of solid dosage forms with polysaccharides that are degraded by colonic microflora represents an important and reliable strategy for obtaining colon specific delivery of drugs. However, most of natural polymers when used isolatedly or without a prior modification presents high water solubility, compromising the protection afforded by the coating. This effect can be avoided using resistant starch, which has more ordered three-dimensional crystalline structure and is resistant to enzymatic degradation in the upper portions of GI tract. The later association with pectin is interesting, since it remains as macromolecules aggregates in acidic medium. Furthermore, polymeric association results physical-chemical properties absent in the isolated polymers. Since resistant starch-related researches in the pharmaceutical field are still very limited, a detailed study in this field is required. Film coating was obtained by the method of solvent casting from retrograded high amylose and pectin dispersions, to which glycerol or propyleneglycol plasticizers were added. Films characterization was accomplished by rheology analysis, morphology, mechanical properties, water vapor permeability, swelling and X-ray diffraction. The potential as a colon specific drug delivery system was evaluated by performing in vitro enzymatic digestion of the coating films in media presenting different pH values. The result set showed that most of the polymeric dispersions has the behaviour of a poorly arranged system, with presence of a predominantly viscous behaviour, since the loss modules were superior to the storage modules. Dispersions containing the same proportion of polymers in the absence of plasticizers, originated more organized systems, whose samples showed less swelling index. Although the pectin have provided greater... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador : Prof. Dr. David Alexander Mitchell / Coorientador : Profª. Drª. Nadia Krieger / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 18/11/2015 / Inclui referências: f. 38-44;63-68;112-114;120-126 / Resumo: Biorrefinaria é um novo conceito que abrange as instalações industriais que utilizam a biomassa como matéria-prima para a produção de intermediários químicos, combustíveis e energia, analogamente às refinarias de petróleo. Uma matéria prima que apresenta oportunidades para ser utilizada no Brasil é a polpa cítrica, que é o resíduo do processamento do suco de laranja. Este resíduo é produzido em grandes quantidades no Brasil, que é o maior produtor mundial de sucos. Atualmente, a polpa cítrica não tem valor comercial importante, já que os custos de secagem comprometem as margens de revenda como ração animal, que é a destinação típica para este resíduo. Por outro lado, a polpa cítrica é uma fonte de limoneno e pectina, que já têm processos de extração estabelecidos, e os carboidratos da polpa podem ser transformadas em etanol e alguns ácidos com alto valor agregado, como o ácido D-galacturônico, o ácido L-galactônico, o ácido múcico e o ácido ascórbico. O objetivo geral desta tese de doutorado foi propor soluções para três problemas das biorrefinarias de polpa cítrica, a falta de conhecimento sobre a hidrólise enzimática da pectina, o custo alto das pectinases que são usadas na hidrólise enzimática da pectina e a incapacidade de Saccharomyces cerevisiae produzir etanol a partir do ácido galacturônico liberado. Na primeira parte do trabalho, a hidrólise enzimática da pectina foi caracterizada, com intuito de entender a lentidão na liberação dos açúcares. Ficou demonstrado, pela primeira vez, que existe uma desaceleração significativa na liberação de açúcares redutores já nos primeiros minutos de hidrólise de pectina por complexos pectinolíticos. Foi mostrado que, com esta falta de linearidade no início da reação, o tempo de incubação escolhido para um ensaio tem grande efeito na atividade medida. De fato, é destacada a necessidade de estabelecer um protocolo padrão para a determinação da atividade pectinolítica, em termos da temperatura, da concentração de pectina e do tempo de incubação. Somente com esta padronização vai ser possível comparar processos de produção de pectinases realizados por grupos diferentes. Na segunda parte do trabalho, foi desenvolvido um processo, em escala piloto, para a produção de pectinases em fermentação em estado sólido, com intuito de baixar o custo destas enzimas. O processo foi realizado com 15 Kg (base seca) de um substrato composto por polpa cítrica e bagaço de cana, na razão de 51,6 a 48,4, (m/m). O uso de uma proporção alta de bagaço propiciou um leito de alta porosidade e, desta maneira, o problema de superaquecimento do leito, que é comum em processos de fermentação em estado sólido, foi completamente evitado. Também foi demonstrado que, no final da fermentação, o sólido pode ser secado e adicionado diretamente a uma solução de pectina para efetuar sua hidrólise; desta maneira, os custos de recuperação e concentração das pectinases são evitados. Na terceira parte do trabalho, foi construída uma linhagem de S. cerevisiae capaz de consumir o ácido D-galacturônico. Isto foi conseguido pela integração de uma via heteróloga, proveniente de fungos filamentosos, de catabolismo de ácido D-galacturônico. Este estudo representa o primeiro passo na construção de uma cepa de S. cerevisiae capaz de produzir etanol a partir de ácido D-galacturônico, sendo que este açúcar chega a compor cerca de 18% do total de açúcares em hidrolisados de polpa cítrica. Palavras-chave: Biorrefinarias, polpa cítrica, ácido D-galacturônico, etanol, pectinases, escalonamento, fermentação no estado sólido. / Abstract: Biorefineries are industrial installations that utilize biomass as a raw material for the production of chemicals, fuels and energy, in a manner analogous to petroleum refineries. One raw material that has the potential to be utilized in Brazil is citrus pulp, the residue of the processing of orange juice. This residue is produced in large quantities in Brazil, which is the world's largest producer of orange juice. Currently, citrus pulp has no significant commercial value; it is typically used as a supplement for cattle feed, but the drying costs mean that the return is minimal. However, citrus pulp is a source of limonene and pectin, for which extraction processes are already established. Further, the carbohydrates in the pulp can be processed into ethanol and some acids with high added value, such as D-galacturonic acid, L-galactonic acid, mucic acid and ascorbic acid. The overall objective of this thesis was to propose solutions to three problems faced by citrus pulp biorefineries: the lack of knowledge about enzymatic hydrolysis, the high cost of the pectinases that are used in the enzymatic hydrolysis of pectin and the inability of Saccharomyces cerevisiae to produce ethanol from the galacturonic acid released in such hydrolysis processes. In the first part of the work, the enzymatic hydrolysis of pectin was characterized, with the aim of understanding why the release of sugars is so slow. For the first time, it was demonstrated that there is a significant deceleration in the release of reducing sugars within the first minutes of pectin hydrolysis by pectinases. It was shown that, with this lack of linearity at the start of the reaction, the incubation time that is chosen for an assay of pectinase activity has a large effect on the activity that is measured. In fact, the thesis raises the need to establish a standard protocol for the determination of pectinolytic activity, in terms of temperature, pectin concentration and time of incubation. Only with such standardization will it be possible to compare pectinase production processes proposed by different research groups. In the second part of the work, a pilot-scale process was developed for the production of pectinases in solid-state fermentation, with the aim of lowering the cost of these enzymes. The process was conducted with 15 kg (dry basis) of a substrate composed of citrus pulp and sugarcane bagasse, in a ratio of 51.6 to 48.4 (by mass). The use of a high proportion of bagasse ensured the bed had a high porosity and, consequently, the problem of overheating of the bed, which is common in solid-state fermentation processes, was completely avoided. It was also shown that, at the end of the fermentation, the solid can be dried and added directly to a pectin solution to effect its hydrolysis; thereby avoiding the need to recover and concentrate the pectinases. In the third part of the work, a strain of S. cerevisiae was constructed that is capable of consuming D-galacturonic acid. This was achieved by integration of a heterologous pathway for the catabolism of D-galacturonic acid from filamentous fungi. This study represents the first step in the construction of a strain of S. cerevisiae capable of producing ethanol from D-galacturonic acid, which represents about 18% of the total sugars in citrus pulp hydrolysates. Keywords: Biorefineries, citrus pulp, D-galacturonic acid, ethanol, pectinases, scale-up, solid-state fermentation.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-06-11Bitstream added on 2014-06-13T19:56:04Z : No. of bitstreams: 1 pedrolli_db_me_rcla.pdf: 676301 bytes, checksum: a4723de4ae9b6c5b9f1e2619ab7118b5 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O fungo Aspergillus giganteus produz uma única poligalacturonase (PG) quando cultivado em meio líquido com pectina de citrus como única fonte de carbono, e pelo menos três pectina liases (PL) quando cultivado em meio líquido com resíduo de laranja como fonte de carbono. A PG de A. giganteus foi purificada em duas etapas: precipitação de proteínas com 70% de saturação com sulfato de amônio e troca aniônica. A PG purificada apresentou massa molar de 69,7±0,07 kDa. A máxima atividade da enzima foi observada em pH 6,0 a 55-60ºC, sendo essa estável em meio neutro e alcalino. A PG apresentou meias-vidas de 115, 18 e 6 min quando incubada a 40, 50 e 55 ºC, respectivamente. A enzima mostrou-se ativa sobre substratos de qualquer grau de metilação, com maior especificidade para substratos de baixa ou nenhuma metilação, apresentando Vmax 669,6 e 602,8 μmol/mg.min, Km 3,25 e 1,16 mg/mL, kcat 770 e 690 s-1 sobre pectina de citrus 34 % esterificada e ácido poligalacturônico, respectivamente. A PG apresentou atividade exo liberando apenas ácido galacturônico como produto de hidrólise. 2-Mercaptoetanol, DTT, Co2+, Mn2+, Mg2+, NH4 + e Na+ agiram como estimulantes da atividade PG. Já Hg2+, EDTA, citrato de sódio, ácido iodoacético, SDS, Ba2+, Cu2+, Pb2+ e Zn2+ inibiram essa atividade enzimática. A principal pectina liase de A. giganteus, a PL I, foi purificada em três etapas: troca aniônica, troca catiônica e filtração em gel. A massa molar da PL I foi estimada em 55,7±1,4 kDa. A máxima atividade da enzima foi obtida em pH 8,5 a 50ºC. A PL I apresentou meias-vidas de 19, 9 e 6 min a 40, 45 e 50ºC, respectivamente. As maiores atividades da PL I foram observadas em pectinas de citrus com 34 e 72% de metilação, nas quais apresentou Vmax 1.488,1 e 1.129,8 U/mg.min, respectivamente, e Km 4,8 mg/mL para ambos os substratos. O padrão de degradação da pectina... / Aspergillus giganteus produces one polygalacturonase (PG) on liquid medium with citrus pectin as the only carbon source, and at least three pectin lyases (PL) with orange waste. Homogenous PG was obtained after two steps: protein precipitation with 70 % ammonium sulphate saturation and anionexchange chromatography. The purified PG showed molecular weight of 69.7±0,07 kDa. The enzyme exhibited maximal activity at pH 6.0 and 55-60 °C, and was stable in neutral and alkaline medium. The half-live for PG at 40, 50 and 55 °C was 115, 18 and 6 min, respectively. The enzyme was active on substrates with any methyl-esterification degree, and hydrolysed better low esterified and not esterified substrates, showing Vmax 669.6 and 602.8 μmol. mg-1.min-1, Km 3.25 and 1.16 mg/mL, kcat 770 and 690 s-1 on 34 % esterified citrus pectin and polygalacturonic acid, respectively. The unique soluble product released in the reaction with pectin and polygalacturonic acid was monogalacturonic acid, and according to this results the enzyme can be classified as exoPG. PG activity enhanced in presence of 2-mercaptoethanol, DTT, Co2+, Mn2+, Mg2+, NH4 + and Na+, and was completely inhibited in presence of Hg2+. EDTA, sodium citrate, iodoacetic acid, SDS, Ba2+, Cu2+, Pb2+ and Zn2+ inhibited enzyme activity. The main PL from A. giganteus was called PL I and was purified after three steps: anion-exchange and cation-exchange chromatographies, and gel filtration. The purified PL I showed molecular weight of 55.7±1.4 kDa. The enzyme exhibited maximal activity at pH 8.5 and 50 °C, and was stable in neutral and acid medium. The half-live for PL I at 40, 45 and 50 °C was 19, 9 and 6 min, respectively. The enzyme was more active on citrus pectins with 34 and 72% of esterification, showing Vmax 1,488.1 and 1,129.8 U. mg-1.min-1, repectively, and Km 4.8 mg/mL on both substrates. The degradation pathern on 34% esterified...(Complete abstract click electronic access below)

Nesse trabalho, foi estudada a produção de endo e exo-poligalacturonases (PG) por Aspergillus oryzae IPT 301, em biorreatores com agitação mecânica (STR) e airlift de circulação interna e externa em escala de bancada. Utilizando um planejamento experimental, foi definida uma formulação de meio isento de sólidos em suspensão (WBE), com o qual foram obtidas atividades máximas de endo e exo-PG comparáveis com as atingidas com um meio formulado com farelo de trigo integral. Com o meio WBE, a produção de PG foi comparada em STR e airlift de circulação interna. Nesses ensaios, foram alcançadas atividades superiores de endo-PG (91,3 unidades por mililitro de meio, U/mL) e exo-PG (65,2 U/mL) com o STR, enquanto que com o biorreator airlift as atividades máximas de endo-PG e exo-PG foram 86,2 U/mL e 60,6 U/mL, respectivamente. Esses resultados demonstram a viabilidade do emprego da configuração airlift na produção de poligalacturonases por A. oryzae. Em cultivos em STR, foi avaliada a influência da presença, no meio WBE, de diferentes concentrações de pectina (0, 10 e 20 g/L) e glicose (0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 g/L) sobre o processo. Adicionalmente, em meios contendo 20 g/L de pectina e 20, 30 e 50 g/L de glicose, o pH foi controlado em um valor mínimo de 2,7. Nos testes em que o pH foi controlado nesse valor mínimo, foi observado um forte incremento das atividades de endo e exo-PG, destacando-se a concentração de glicose de 30 g/L com a qual atividades enzimáticas de 175,0 U/mL de endo-PG e 103,0 U/mL de exo-PG foram obtidas. Em STR, foram ainda testados meios de cultivo formulados com pectina em sua forma normal (WBE) e pectina que sofreu hidrólise enzimática parcial, com o fim de promover a redução da viscosidade do meio e, dessa forma, favorecer a transferência de oxigênio para o cultivo. Numa das condições testadas (WBE5), o meio foi formulado com metade da pectina parcialmente hidrolisada e com a outra metade não tratada. Nessa condição, atividades de endo-PG de 149,0 U/mL e de exo-PG de 82,2 U/mL foram obtidas, enquanto que com o uso do meio com a pectina integral atividades estatisticamente inferiores 130,0 e 78,0 U/mL, respectivamente foram determinadas. A produção de PG foi avaliada na condição WBE5 e na condição WBE6, com pectina não hidrolisada, em que os sais nutrientes foram adicionados parceladamente ao meio durante o cultivo, em biorreatores STR e airlift de circulação interna e externa. Após 96 h de processo, atividade superior de endo-PG (145,0 U/mL) foi atingida no STR, na condição WBE5, seguindo-se a condição WBE6 (140,0 U/mL) no mesmo reator. Em biorreatores airlift, títulos superiores de endo-PG (116,0 U/mL) e exo-PG (80,4 U/mL) foram atingidos no sistema de circulação externa, na condição WBE6, observando-se, para exo-PG, atividade semelhante à obtida no STR. O processo foi avaliado em meios com diferentes concentrações de KH2PO4, (NH4)2SO4, FeSO4, MnSO4, MgSO4 e ZnSO4. Em análises individuais de cada um desses sais, em ensaios em frascos agitados, evidenciou-se a influência nas concentrações de sulfatos de NH4+, Fe2+, Mn2+, Mg2+, Zn2+ sobre a produção de poligalacturonases. Em STR, sob condições controladas, foi comparada a produção enzimática no meio padrão WBE e com diferentes condições de adição dos sais ao cultivo. Entre as condições avaliadas em STR, as mais altas atividades de endo-PG (175 U/mL) e de exo-PG (86,5 U/mL) foram atingidas quando KH2PO4, (NH4)2SO4, FeSO4, MnSO4, MgSO4 e ZnSO4 foram adicionados parceladamente ao meio durante o processo, com ganho significativo em relação ao meio WBE em que essas atividades alcançaram 130,0 e 78,6 U/mL, respectivamente. Os resultados do presente trabalho demonstram o alto potencial dos biorreatores airlift, como um sistema de relativa simplicidade de construção e operação, para a produção de poligalacturonases em grande escala. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-05-23T18:29:35Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Roselei Claudete Fontana.pdf: 2842746 bytes, checksum: 81128a000dba545ee34696c43a9146fb (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-23T18:29:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Roselei Claudete Fontana.pdf: 2842746 bytes, checksum: 81128a000dba545ee34696c43a9146fb (MD5) / In this work, the production of endo and exo-polygalacturonase (PG) by Aspergillus oryzae IPT 301 was studied in a stirred tank bioreactor (STR) and in airlift bioreactors with internal and external circulation loop. Using a factorial experimental design, a soluble culture medium (WBE) was defined which allowed the production of exo and endo-PG comparable to that obtained in a medium containing suspended wheat bran. With the WBE medium, the production of PG was compared in STR and internal-circulation-airlift bioreactor. In these tests, superior enzymatic activities for both endo-PG (91.3 units per mL of medium, U/mL) and exo-PG (65.2 U/mL) were obtained in the STR, whereas in the airlift reactor the maximum activities were 86.2 U/mL and 60.6 U/mL, respectively. These results indicate the feasibility of airlift reactors for producing polygalacturonases by A. oryzae. In STR cultivations, the influence of different concentrations of pectin (0, 10, and 20 g/L) and glucose (0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 g/L), in WBE medium, on the process was assessed. Furthermore, in media containing 20 g/L pectin and 20, 30, and 50 g/L glucose, tests where pH was controlled to a minimum value of 2.7 were carried out. In tests where pH was controlled to this minimum value, strong improvement of both endo and exo-PG activities was attained, especially in the run with 30 g/L glucose in which enzyme activities of 175.0 U/mL for endo-PG and 103.0 U/mL for exo-PG. In STR, cultivation media formulated with regular pectin (WBE) and with partially enzyme-hydrolysed pectin to reduce the viscosity of medium and as such to improve the oxygen transfer to the culture were evaluated. In one condition (WBE5), the medium was formulated with half of the pectin partially hydrolysed and half of the pectin untreated. In this condition, activities of endo-PG of 149.0 U/mL and exo-PG of 82.2 U/mL were achieved, whereas with the non-hydrolysed-pectin medium statistically inferior activities 130.0 and 78.0 U/mL, respectively were measured. PG production was compared in STR and in both airlift bioreactors (internal and external circulation loop), using the condition WBE5 and a further condition (WBE6), with non-hydrolysed pectin medium, in which the nutrient salts were fed to the medium in lots during the cultivation. After 96 h of process, a higher activity of endo-PG (145.0 U/mL) was attained in STR followed by the condition WBE6 in the same reactor (140.0 U/mL). In airlift bioreactors, superior titres of endo-PG (116.0 U/mL) and exo-PG (80.4 U/mL) were obtained in the condition WBE6, with the external loop configuration, the activity of exo-PG being similar to that measured in STR. The process was evaluated in media with different concentrations of KH2PO4, (NH4)2SO4, FeSO4, MnSO4, MgSO4 e ZnSO4. In individual analysis of each salt, performed in shake-flasks experiments, the influence of the concentrations of NH4+, Fe2+, Mn2+, Mg2+, Zn2+ sulphates on the production of polygalacturonases was evidenced. In STR, under controlled conditions, the enzyme production in WBE medium was compared with different conditions of salt feeding to the culture. Among the conditions tested in STR, the highest activities for endo-PG (175.0 U/mL) and exo-PG (86.5 U/mL) were achieved when KH2PO4, (NH4)2SO4, FeSO4, MnSO4, MgSO4 e ZnSO4 were fed to the medium in lots, with a significant improvement in comparison to the use of WBE medium that resulted in activities of 130.0 and 78.6 U/mL, respectively. The results of this work reveal the high potential of airlift bioreactors as a relatively simple building operating system to be used in large-scale polygalacturonase production.

O cultivo de Aspergillus oryzae IPT-301 em meio líquido foi estudado para avaliar a influência do pH e do suprimento de oxigênio sobre o crescimento fúngico e a formação de pectinases. Definiuse um meio limitante para o crescimento com as seguintes concentrações: farelo de trigo em extrato aquoso, 40g/L; glicose, 5g/L; sulfato de amônio, 5g/L; pectina cítrica (indutor), 20g/L. O indutor foi estudado quanto ao momento de adição ao meio. Com adição em 24h de cultivo, a máxima concentração de biomassa foi atingida em cerca de 70h, quase 48h depois do observado no ensaio controle. A atividade enzimática máxima (27U/mL) foi semelhante à condição de referência (24U/mL), mas a ausência da pectina no início do processo facilitou a mistura e o controle do pH e do oxigênio dissolvido. No caso, reduziram-se a máxima frequência dos agitadores do biorreator (650 para 600rpm) e o período de tempo em que este nível de agitação precisou ser mantido para possibilitar a oxigenação do meio (30h para 12h), o que favoreceria a preservação do micélio. Valores constantes e variáveis de pH do meio foram comparados em ensaios com adição de pectina em 24h e sem controle de oxigênio dissolvido. Verificou-se que o pH constante de 4,0 favoreceu o crescimento, que atingiu 4,5g/L, porém a atividade enzimática foi insignificante (1,4U/mL). Quando o pH decresceu naturalmente até o mínimo de 2,7, foram atingidos concentração de biomassa de 4,0g/L e atividade de pectinases de 24U/mL; na sequência, porém, a atividade baixou para 2U/mL, acompanhando o aumento do pH após 96h de processo. Entretanto, em cultivo em que o pH foi controlado em 2,7 nas horas finais do processo, a atividade enzimática foi preservada. Estes resultados, juntamente com os de ensaios enzimáticos, demonstraram que as pectinases de A. oryzae perdem a estabilidade à medida que o pH aumenta. O ensaio com pH constante em 2,7 foi o único em que a atividade pectinolítica foi superior quando a pectina esteve presente desde o início do cultivo. Possivelmente, a limitação do crescimento celular (máximo de 3,5g/L) favoreceu os mecanismos de transferência e mistura, prolongando a viabilidade celular. Cultivos com pH controlado em 4,0 no período de intenso crescimento celular e em 2,7 para a produção de pectinases (Ensaios T5 e T10) resultaram em elevadas atividades enzimáticas, especialmente quando a pectina foi adicionada em 24h (43U/mL). No caso, as mais efetivas condições de transferência de oxigênio e mistura, aliadas ao pH adequado ao crescimento, permitiram que a biomassa atingisse 6,3g/L e, após a redução do pH a 2,7, a atividade pectinolítica foi incrementada. Ensaios com oxigênio dissolvido em mínimo de 30% da saturação foram conduzidos em duas condições: Ensaio B5 - pH inicial 4,0 e controlado em 2,7 após atingir este valor; Ensaio B6 - pH constante em 4,0 até 24h, seguido de redução para 2,7 e controle neste valor. As concentrações celulares atingidas em B5 (6,0g/L) e em B6 (6,8g/L) foram semelhantes à de T10, mas suas máximas atividades pectinolíticas – 106 e 120U/mL, respectivamente – foram as maiores deste estudo. Estes resultados se deveram, provavelmente, à intensificação do metabolismo fúngico associado à disponibilidade ilimitada de oxigênio. Apesar de o tempo para atingir os picos de biomassa e atividade enzimática ter sido aumentado, a produtividade do Ensaio B6 foi 3,7 vezes maior que a do controle. Os resultados deste trabalho confirmaram que o pH e o suprimento de oxigênio em cultivos de A. oryzae afetam decisivamente tanto o crescimento quanto a produção de pectinases. As condições operacionais definidas possibilitaram a redução do crescimento celular – permitindo, entretanto, a obtenção de atividades enzimáticas elevadas – e, em decorrência, um controle eficiente dos parâmetros estudados. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-06-16T13:00:04Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Lenara Meneghel Santa Catharina.pdf: 2002637 bytes, checksum: 6291a4802d64eabed73c3db13116f5b5 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-06-16T13:00:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Lenara Meneghel Santa Catharina.pdf: 2002637 bytes, checksum: 6291a4802d64eabed73c3db13116f5b5 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The cultivation of Aspergillus oryzae IPT-301 in liquid medium was studied to assess the influence of pH and oxygen supply on the fungal growth and the formation of pectinases. A growthlimiting medium was defined with the following concentrations: wheat bran in aqueous extract, 40g/L; glucose, 5g/L; ammonium sulphate, 5g/L; citric pectin (inducer), 20g/L. The inducer was evaluated with respect to the time of addition to the medium. With the addition in 24h of cultivation, maximum biomass concentration was achieved in 70h, almost 48h after reaching the cell growth peak of the control experiment. The maximum enzyme activity (27U/mL) was similar to that of the reference run (24U/mL), but the absence of pectin at the beginning of the process favoured mixing and the control of pH and dissolved oxygen concentration. In this case, the maximum impeller speed in the bioreactor (650 to 600rpm) and the time period that this level of agitation was maintained to provide the best possible medium oxygenation were reduced (30 to 12h), a condition that could favour the preservation of mycelium. Constant and varied medium pH values were evaluated in experiments with the addition of pectin in 24h and without dissolved oxygen concentration control. It was found that a constant pH of 4.0 favoured biomass growth, but the enzyme activity was insignificant (1.4U/mL). When the pH naturally decreased up to a minimum of 2.7, biomass concentration of 4.0g/L and pectinase activity of 24U/mL were attained; in the sequence, however, the activity fell to 2U/mL following the increase of pH observed after 96h. Nevertheless, in the cultivation in which the pH 2.7 was maintained though the final hours of process, the enzyme activity was preserved. These results together with those from enzymatic tests have shown that A. oryzae pectinases loose stability as pH rises. The experiment with constant pH at 2.7 was the only that results in superior pectinase activity with pectin present in the medium from the beginning of the cultivation. Possibly, cell growth limitation (maximum of 3.5g/L) favoured mass transfer and mixing mechanisms and the biomass viability was extended. Cultivations with the pH controlled at 4.0 when the cell growth was more intense and, afterwards, at 2.7 for pectinase production (Experiments T5 and T10) result in high enzyme activities, especially when pectin was added in 24h (43U/mL). In the case, the more effective conditions of oxygen transfer and mixing, allied to the adequate pH for cell growth, allowed that biomass concentration achieved 6.3g/L and, after reducing the pH to 2.7, pectinolytic activity as increased. Experiments with dissolved oxygen concentration at a minimum of 30% of saturation were carried out at two conditions: Experiment B5 - initial pH 4.0 and controlled at 2.7 after reaching this value; Experiment B6 – constant pH up to 24h, followed by reduction to 2.7 and control at this value. The cell concentrations achieved in B5 (6.0g/L) and in B6 (6.8g/L) were similar to that of T10, but their maximum pectinase activities – 106 and 120U/mL, respectively – were the largest in this study. Such results were probably due to the raising fungal metabolism which is associated to the unlimited oxygen availability. Although the time to reach the peaks of biomass and enzyme activity has been increased, the productivity of Experiment B6 was 3.7 times larger than that of the control run. The results of this work have confirmed that, in cultivations of A. oryzae, the pH and the oxygen supply decisively affect both cell growth and pectinase production. The defined operational conditions provided the reduction of cell growth – allowing, however, the achievement of high enzyme activities – and, consequently, an efficient control of the studied parameters.