Orientador: Raul Cesar Evangelista / Coorientador: Beatriz Stringhetti Ferreira Cury / Banca: Ana Dóris de Castro / Banca: Newton Andréo Filho / Resumo: O revestimento de formas farmacêuticas sólidas com polissacarídeos degradáveis pela microflora colônica representa uma importante e confiável estratégia para obtenção de sistemas de liberação cólon-específica de fármacos. No entanto, a maioria dos polímeros naturais, quando utilizados isoladamente e sem uma modificação prévia, apresenta a desvatangem de ser altamente solúvel em água, o que compromete a proteção oferecida pelo revestimento. Tal efeito pode ser evitado através do emprego do amido resistente, o qual possui estrutura cristalina tridimensional mais ordenada e resistência à degradação enzimática nas porções superiores do TGI. Sua posterior associação com a pectina mostra-se interessante, uma vez que ela permanece como agregados de macromoléculas em meio ácido. Além disso, a associação polimérica resulta em características físico-químicas inexistentes nos poliméros isolados. Devido às pesquisas com amido resistente na área farmacêutica ainda ser muito restrita, um estudo detalhado nesse campo faz-se necessário. Filmes de revestimento foram obtidos através do método de evaporação do solvente, a partir de dispersões de alta amilose retrogradada e pectina, às quais foram adicionados os plastificantes glicerina ou propilenoglicol. A caracterização dos filmes foi realizada por análises de reologia, morfologia, propriedades mecânicas, permeabilidade ao vapor d'água, intumescimento e difratometria de raios X. A avaliação do potencial como sistema de liberação cólon específica de fármacos foi realizada através da digestão enzimática in vitro dos filmes de revestimento em meios com diferentes valores de pH. O conjunto de resultados mostrou que a maioria das dispersões poliméricas apresenta comportamento de sistemas pouco organizados, com presença de comportamento... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Coating of solid dosage forms with polysaccharides that are degraded by colonic microflora represents an important and reliable strategy for obtaining colon specific delivery of drugs. However, most of natural polymers when used isolatedly or without a prior modification presents high water solubility, compromising the protection afforded by the coating. This effect can be avoided using resistant starch, which has more ordered three-dimensional crystalline structure and is resistant to enzymatic degradation in the upper portions of GI tract. The later association with pectin is interesting, since it remains as macromolecules aggregates in acidic medium. Furthermore, polymeric association results physical-chemical properties absent in the isolated polymers. Since resistant starch-related researches in the pharmaceutical field are still very limited, a detailed study in this field is required. Film coating was obtained by the method of solvent casting from retrograded high amylose and pectin dispersions, to which glycerol or propyleneglycol plasticizers were added. Films characterization was accomplished by rheology analysis, morphology, mechanical properties, water vapor permeability, swelling and X-ray diffraction. The potential as a colon specific drug delivery system was evaluated by performing in vitro enzymatic digestion of the coating films in media presenting different pH values. The result set showed that most of the polymeric dispersions has the behaviour of a poorly arranged system, with presence of a predominantly viscous behaviour, since the loss modules were superior to the storage modules. Dispersions containing the same proportion of polymers in the absence of plasticizers, originated more organized systems, whose samples showed less swelling index. Although the pectin have provided greater... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Nesse trabalho, foi estudada a produção de endo e exo-poligalacturonases (PG) por Aspergillus oryzae IPT 301, em biorreatores com agitação mecânica (STR) e airlift de circulação interna e externa em escala de bancada. Utilizando um planejamento experimental, foi definida uma formulação de meio isento de sólidos em suspensão (WBE), com o qual foram obtidas atividades máximas de endo e exo-PG comparáveis com as atingidas com um meio formulado com farelo de trigo integral. Com o meio WBE, a produção de PG foi comparada em STR e airlift de circulação interna. Nesses ensaios, foram alcançadas atividades superiores de endo-PG (91,3 unidades por mililitro de meio, U/mL) e exo-PG (65,2 U/mL) com o STR, enquanto que com o biorreator airlift as atividades máximas de endo-PG e exo-PG foram 86,2 U/mL e 60,6 U/mL, respectivamente. Esses resultados demonstram a viabilidade do emprego da configuração airlift na produção de poligalacturonases por A. oryzae. Em cultivos em STR, foi avaliada a influência da presença, no meio WBE, de diferentes concentrações de pectina (0, 10 e 20 g/L) e glicose (0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 g/L) sobre o processo. Adicionalmente, em meios contendo 20 g/L de pectina e 20, 30 e 50 g/L de glicose, o pH foi controlado em um valor mínimo de 2,7. Nos testes em que o pH foi controlado nesse valor mínimo, foi observado um forte incremento das atividades de endo e exo-PG, destacando-se a concentração de glicose de 30 g/L com a qual atividades enzimáticas de 175,0 U/mL de endo-PG e 103,0 U/mL de exo-PG foram obtidas. Em STR, foram ainda testados meios de cultivo formulados com pectina em sua forma normal (WBE) e pectina que sofreu hidrólise enzimática parcial, com o fim de promover a redução da viscosidade do meio e, dessa forma, favorecer a transferência de oxigênio para o cultivo. Numa das condições testadas (WBE5), o meio foi formulado com metade da pectina parcialmente hidrolisada e com a outra metade não tratada. Nessa condição, atividades de endo-PG de 149,0 U/mL e de exo-PG de 82,2 U/mL foram obtidas, enquanto que com o uso do meio com a pectina integral atividades estatisticamente inferiores 130,0 e 78,0 U/mL, respectivamente foram determinadas. A produção de PG foi avaliada na condição WBE5 e na condição WBE6, com pectina não hidrolisada, em que os sais nutrientes foram adicionados parceladamente ao meio durante o cultivo, em biorreatores STR e airlift de circulação interna e externa. Após 96 h de processo, atividade superior de endo-PG (145,0 U/mL) foi atingida no STR, na condição WBE5, seguindo-se a condição WBE6 (140,0 U/mL) no mesmo reator. Em biorreatores airlift, títulos superiores de endo-PG (116,0 U/mL) e exo-PG (80,4 U/mL) foram atingidos no sistema de circulação externa, na condição WBE6, observando-se, para exo-PG, atividade semelhante à obtida no STR. O processo foi avaliado em meios com diferentes concentrações de KH2PO4, (NH4)2SO4, FeSO4, MnSO4, MgSO4 e ZnSO4. Em análises individuais de cada um desses sais, em ensaios em frascos agitados, evidenciou-se a influência nas concentrações de sulfatos de NH4+, Fe2+, Mn2+, Mg2+, Zn2+ sobre a produção de poligalacturonases. Em STR, sob condições controladas, foi comparada a produção enzimática no meio padrão WBE e com diferentes condições de adição dos sais ao cultivo. Entre as condições avaliadas em STR, as mais altas atividades de endo-PG (175 U/mL) e de exo-PG (86,5 U/mL) foram atingidas quando KH2PO4, (NH4)2SO4, FeSO4, MnSO4, MgSO4 e ZnSO4 foram adicionados parceladamente ao meio durante o processo, com ganho significativo em relação ao meio WBE em que essas atividades alcançaram 130,0 e 78,6 U/mL, respectivamente. Os resultados do presente trabalho demonstram o alto potencial dos biorreatores airlift, como um sistema de relativa simplicidade de construção e operação, para a produção de poligalacturonases em grande escala. / In this work, the production of endo and exo-polygalacturonase (PG) by Aspergillus oryzae IPT 301 was studied in a stirred tank bioreactor (STR) and in airlift bioreactors with internal and external circulation loop. Using a factorial experimental design, a soluble culture medium (WBE) was defined which allowed the production of exo and endo-PG comparable to that obtained in a medium containing suspended wheat bran. With the WBE medium, the production of PG was compared in STR and internal-circulation-airlift bioreactor. In these tests, superior enzymatic activities for both endo-PG (91.3 units per mL of medium, U/mL) and exo-PG (65.2 U/mL) were obtained in the STR, whereas in the airlift reactor the maximum activities were 86.2 U/mL and 60.6 U/mL, respectively. These results indicate the feasibility of airlift reactors for producing polygalacturonases by A. oryzae. In STR cultivations, the influence of different concentrations of pectin (0, 10, and 20 g/L) and glucose (0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 g/L), in WBE medium, on the process was assessed. Furthermore, in media containing 20 g/L pectin and 20, 30, and 50 g/L glucose, tests where pH was controlled to a minimum value of 2.7 were carried out. In tests where pH was controlled to this minimum value, strong improvement of both endo and exo-PG activities was attained, especially in the run with 30 g/L glucose in which enzyme activities of 175.0 U/mL for endo-PG and 103.0 U/mL for exo-PG. In STR, cultivation media formulated with regular pectin (WBE) and with partially enzyme-hydrolysed pectin to reduce the viscosity of medium and as such to improve the oxygen transfer to the culture were evaluated. In one condition (WBE5), the medium was formulated with half of the pectin partially hydrolysed and half of the pectin untreated. In this condition, activities of endo-PG of 149.0 U/mL and exo-PG of 82.2 U/mL were achieved, whereas with the non-hydrolysed-pectin medium statistically inferior activities 130.0 and 78.0 U/mL, respectively were measured. PG production was compared in STR and in both airlift bioreactors (internal and external circulation loop), using the condition WBE5 and a further condition (WBE6), with non-hydrolysed pectin medium, in which the nutrient salts were fed to the medium in lots during the cultivation. After 96 h of process, a higher activity of endo-PG (145.0 U/mL) was attained in STR followed by the condition WBE6 in the same reactor (140.0 U/mL). In airlift bioreactors, superior titres of endo-PG (116.0 U/mL) and exo-PG (80.4 U/mL) were obtained in the condition WBE6, with the external loop configuration, the activity of exo-PG being similar to that measured in STR. The process was evaluated in media with different concentrations of KH2PO4, (NH4)2SO4, FeSO4, MnSO4, MgSO4 e ZnSO4. In individual analysis of each salt, performed in shake-flasks experiments, the influence of the concentrations of NH4+, Fe2+, Mn2+, Mg2+, Zn2+ sulphates on the production of polygalacturonases was evidenced. In STR, under controlled conditions, the enzyme production in WBE medium was compared with different conditions of salt feeding to the culture. Among the conditions tested in STR, the highest activities for endo-PG (175.0 U/mL) and exo-PG (86.5 U/mL) were achieved when KH2PO4, (NH4)2SO4, FeSO4, MnSO4, MgSO4 e ZnSO4 were fed to the medium in lots, with a significant improvement in comparison to the use of WBE medium that resulted in activities of 130.0 and 78.6 U/mL, respectively. The results of this work reveal the high potential of airlift bioreactors as a relatively simple building operating system to be used in large-scale polygalacturonase production.

O cultivo de Aspergillus oryzae IPT-301 em meio líquido foi estudado para avaliar a influência do pH e do suprimento de oxigênio sobre o crescimento fúngico e a formação de pectinases. Definiuse um meio limitante para o crescimento com as seguintes concentrações: farelo de trigo em extrato aquoso, 40g/L; glicose, 5g/L; sulfato de amônio, 5g/L; pectina cítrica (indutor), 20g/L. O indutor foi estudado quanto ao momento de adição ao meio. Com adição em 24h de cultivo, a máxima concentração de biomassa foi atingida em cerca de 70h, quase 48h depois do observado no ensaio controle. A atividade enzimática máxima (27U/mL) foi semelhante à condição de referência (24U/mL), mas a ausência da pectina no início do processo facilitou a mistura e o controle do pH e do oxigênio dissolvido. No caso, reduziram-se a máxima frequência dos agitadores do biorreator (650 para 600rpm) e o período de tempo em que este nível de agitação precisou ser mantido para possibilitar a oxigenação do meio (30h para 12h), o que favoreceria a preservação do micélio. Valores constantes e variáveis de pH do meio foram comparados em ensaios com adição de pectina em 24h e sem controle de oxigênio dissolvido. Verificou-se que o pH constante de 4,0 favoreceu o crescimento, que atingiu 4,5g/L, porém a atividade enzimática foi insignificante (1,4U/mL). Quando o pH decresceu naturalmente até o mínimo de 2,7, foram atingidos concentração de biomassa de 4,0g/L e atividade de pectinases de 24U/mL; na sequência, porém, a atividade baixou para 2U/mL, acompanhando o aumento do pH após 96h de processo. Entretanto, em cultivo em que o pH foi controlado em 2,7 nas horas finais do processo, a atividade enzimática foi preservada. Estes resultados, juntamente com os de ensaios enzimáticos, demonstraram que as pectinases de A. oryzae perdem a estabilidade à medida que o pH aumenta. O ensaio com pH constante em 2,7 foi o único em que a atividade pectinolítica foi superior quando a pectina esteve presente desde o início do cultivo. Possivelmente, a limitação do crescimento celular (máximo de 3,5g/L) favoreceu os mecanismos de transferência e mistura, prolongando a viabilidade celular. Cultivos com pH controlado em 4,0 no período de intenso crescimento celular e em 2,7 para a produção de pectinases (Ensaios T5 e T10) resultaram em elevadas atividades enzimáticas, especialmente quando a pectina foi adicionada em 24h (43U/mL). No caso, as mais efetivas condições de transferência de oxigênio e mistura, aliadas ao pH adequado ao crescimento, permitiram que a biomassa atingisse 6,3g/L e, após a redução do pH a 2,7, a atividade pectinolítica foi incrementada. Ensaios com oxigênio dissolvido em mínimo de 30% da saturação foram conduzidos em duas condições: Ensaio B5 - pH inicial 4,0 e controlado em 2,7 após atingir este valor; Ensaio B6 - pH constante em 4,0 até 24h, seguido de redução para 2,7 e controle neste valor. As concentrações celulares atingidas em B5 (6,0g/L) e em B6 (6,8g/L) foram semelhantes à de T10, mas suas máximas atividades pectinolíticas – 106 e 120U/mL, respectivamente – foram as maiores deste estudo. Estes resultados se deveram, provavelmente, à intensificação do metabolismo fúngico associado à disponibilidade ilimitada de oxigênio. Apesar de o tempo para atingir os picos de biomassa e atividade enzimática ter sido aumentado, a produtividade do Ensaio B6 foi 3,7 vezes maior que a do controle. Os resultados deste trabalho confirmaram que o pH e o suprimento de oxigênio em cultivos de A. oryzae afetam decisivamente tanto o crescimento quanto a produção de pectinases. As condições operacionais definidas possibilitaram a redução do crescimento celular – permitindo, entretanto, a obtenção de atividades enzimáticas elevadas – e, em decorrência, um controle eficiente dos parâmetros estudados. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The cultivation of Aspergillus oryzae IPT-301 in liquid medium was studied to assess the influence of pH and oxygen supply on the fungal growth and the formation of pectinases. A growthlimiting medium was defined with the following concentrations: wheat bran in aqueous extract, 40g/L; glucose, 5g/L; ammonium sulphate, 5g/L; citric pectin (inducer), 20g/L. The inducer was evaluated with respect to the time of addition to the medium. With the addition in 24h of cultivation, maximum biomass concentration was achieved in 70h, almost 48h after reaching the cell growth peak of the control experiment. The maximum enzyme activity (27U/mL) was similar to that of the reference run (24U/mL), but the absence of pectin at the beginning of the process favoured mixing and the control of pH and dissolved oxygen concentration. In this case, the maximum impeller speed in the bioreactor (650 to 600rpm) and the time period that this level of agitation was maintained to provide the best possible medium oxygenation were reduced (30 to 12h), a condition that could favour the preservation of mycelium. Constant and varied medium pH values were evaluated in experiments with the addition of pectin in 24h and without dissolved oxygen concentration control. It was found that a constant pH of 4.0 favoured biomass growth, but the enzyme activity was insignificant (1.4U/mL). When the pH naturally decreased up to a minimum of 2.7, biomass concentration of 4.0g/L and pectinase activity of 24U/mL were attained; in the sequence, however, the activity fell to 2U/mL following the increase of pH observed after 96h. Nevertheless, in the cultivation in which the pH 2.7 was maintained though the final hours of process, the enzyme activity was preserved. These results together with those from enzymatic tests have shown that A. oryzae pectinases loose stability as pH rises. The experiment with constant pH at 2.7 was the only that results in superior pectinase activity with pectin present in the medium from the beginning of the cultivation. Possibly, cell growth limitation (maximum of 3.5g/L) favoured mass transfer and mixing mechanisms and the biomass viability was extended. Cultivations with the pH controlled at 4.0 when the cell growth was more intense and, afterwards, at 2.7 for pectinase production (Experiments T5 and T10) result in high enzyme activities, especially when pectin was added in 24h (43U/mL). In the case, the more effective conditions of oxygen transfer and mixing, allied to the adequate pH for cell growth, allowed that biomass concentration achieved 6.3g/L and, after reducing the pH to 2.7, pectinolytic activity as increased. Experiments with dissolved oxygen concentration at a minimum of 30% of saturation were carried out at two conditions: Experiment B5 - initial pH 4.0 and controlled at 2.7 after reaching this value; Experiment B6 – constant pH up to 24h, followed by reduction to 2.7 and control at this value. The cell concentrations achieved in B5 (6.0g/L) and in B6 (6.8g/L) were similar to that of T10, but their maximum pectinase activities – 106 and 120U/mL, respectively – were the largest in this study. Such results were probably due to the raising fungal metabolism which is associated to the unlimited oxygen availability. Although the time to reach the peaks of biomass and enzyme activity has been increased, the productivity of Experiment B6 was 3.7 times larger than that of the control run. The results of this work have confirmed that, in cultivations of A. oryzae, the pH and the oxygen supply decisively affect both cell growth and pectinase production. The defined operational conditions provided the reduction of cell growth – allowing, however, the achievement of high enzyme activities – and, consequently, an efficient control of the studied parameters.

Orientador: Ranulfo Monte Alegre / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-21T02:22:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hennies_PaulodeTarso_M.pdf: 3761070 bytes, checksum: b7bc37871cd2780660aff2d78b01f95b (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: Estudou-se a produção de pectinase por Penicillum italicum IZ 1584 através de fermentação semi-sólida de bagaço de laranja industrialmente processado. Primeiramente verificou-se a capacidade do fungo em produzir a enzima em um meio líquido contendo pectina como única fonte de carbono e em outro, contendo também sacarose. Este segundo meio proporcionou a maior atividade de pectinase (9,31 x 10-2 UI/ml) após 96 horas de fermentação. A presença de sacarose no meio de cultivo semi-sólido também demonstrou incrementar a produção de pectinase, obtendo-se atividade de 2,33 x 10 -1 UI/g MFU após 9 dias de fermentação. Os sais nutrientes demonstraram ser a variável mais importante para a produção de pectinase na fermentação em meio semi-sólido, quando comparada com as variáveis temperatura de fermentação, concentração de sacarose e pH da solução umidificante. A concentração de sais que proporcionou melhores resultados foi NH4NO3 1,20g/20 g de bagaço de laranja lavado (BLL), KH2PO4 0,08 g/20 g BLL, e MgSO4.7H20 0,12g/20 g BLL. Entretanto quando estas concentrações foram duplicadas, obteve-se 96,5% da atividade de pectinase verificada anteriormente, não havendo portanto diferença significativa nos níveis de atividade pectinolítica produzida. A atividade de pectinase de Penicillium italicum IZ 1584 obtida por fermentação semi-sólida apresentou pH ótimo 5,5 e temperatura ótima de 45°C, na região de pH ácido / Abstract: Pectinase production by Penicillum italicum IZ 1584 was studied in a semi-solid fermentation medium containing processed orange bagasse as substrate. The first step was to verify if the mold was able to release extracelullar pectinase in liquid medium containing pectin as the sole carbon source and in liquid medium containing sucrose and pectin as the carbon source. The highest pectinase activity (9,31 x 10-2 Ul/ml) was obtained when the second medium was fermented for 96 hours. Sucrose was also added to the semi-solid fermentation medium. Pectinase activity was increased relatively to semi-solid medium without sucrose, with 2,33 x 10 -1 Ul/g MFU after a fermentation period of 9 days. Nutrient salts, when compared to temperature, sucrose adition and pH (humidifying solution), showed to be the most important variable for pectinase production in the semi-solid process Best results were obtained with the following concentrations: NH4NO3 1,20 g / 20g washed orange bagasse (BLL), KH2PO4 0,08g/20 g BLL, and MgSO4.7H20 0,12g/20 g BLL. When these concentrations were doubled, 96,5% of the pectinase activity previously observed was verified, showing no significant difference between the salts concentrations on pectinase production. In the acidic region, pectinolytic activity of Penicillum italicum IZ 1584 obtained by semi-solid fermentation showed best activity at pH 5,5 and 45°C / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Orientador: Ranulfo Monte Alegre / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-25T00:32:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rizzatto_MarciaLuzia_M.pdf: 2359270 bytes, checksum: 5478fd798a0355f913b6d8f29070ea82 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: No presente trabalho, estudou-se a produção e produtividade de pectinase por Penicillium italicum IZ 1584 e por Aspergillus niger NRRL 3122 através de fermentação semi-sólida de bagaço de laranja industrialmente processado, em embalagens de polipropileno. Foram feitos ensaios com bagaço de laranja lavado e não lavado. A produção de pectinases com bagaço lavado iniciou-se mais cedo, porém os valores de atividade obtidos com o bagaço não lavado foram maiores para os dois microrganismos, sendo os valores da atividade do P. italicum IZ 1584 (15,1 UIlgMFU) maiores que os do A. niger NRRL 3122 (9,56 UIlgMFU). Em ensaios utilizando bagaço de laranja lavado adicionado de açúcares sacarose, glicose ou frutose, observou-se atividade máxima no meio com sacarose (15,02 UIlgMFU), para o P. italicum IZ 1584, enquanto que os meios com glicose e frutose apresentaram valores próximos de atividade 6,88 UIlgMFU e 6,94 UI/g 1\.1FU, mas menores comparados com o meio com sacarose. O fungo A. niger NRRL 3122 produziu pouca atividade de pectinase nos meios aos quais foram adicionados os açúcares. A atividade máxima foi obtida em meio com glicose (1,98 UI/gMFU), valor próximo do meio com frutose (1,55 UIlgMFU) e o meio com sacarose foi o que apresentou o menor valor de atividade (1,1 UIlgMFU). O fungo P. italicum IZ 1584 mostrou-se mais adequado para a produção de pectinase nos meios de fermentação testados. A produção de pectinase por P. italicum IZ 1584 foi 37% maior que a produção por A. niger NRRL 3122 em bagaço não lavado, 40% em bagaço lavado, 93% em meio com sacarose, 28,8% em meio com glicose e 77,7% em meio com frutose. Em fermentação utilizando misturas de bagaço lavado e não lavado em diferentes proporções, os maiores valores de atividade de pectinase também foram obtidos com o fungo P. italicum IZ 1584. O valor máximo de atividade de pectinase obtido (20,72 UIlgMFU), foi com o meio com 75% de bagaço lavado e 25% de bagaço não lavado, sendo este valor, o maior encontrado neste trabalho / Abstract: The objective of this experimental work was to study the pectinase production and productivity by Penici/lium italicum IZ 1584 and Aspergillus niger NRRL 3122, through solid-state fermentation in a medium containing processed orange bagasse as substrate, in flexible polypropilen packs. The initial experiments studied the medium composed by washed orange bagasse and no washed bagasse as source of carbono The pectinases production with washed bagasse began earlier, however the activity values obtained with no washed bagasse were bigger for the two microorganisms 15.1 UIlgMFU and 9,56 UIlgMFU, respectively, P. italicum IZ 1584 and A. niger NRRL 3122. In the experiments using washed orange bagasse supplemented with sugars (sucrose, glucose or fiutose), a maximum activity was observed in the medium with sucrose (15.02 UIlg MFU) for the P. italicum IZ 1584, while the media with glucose or fiutose presented close values of activity of 6.88 UIlgMFU and 6.94 UIlgMFU, respectively, but they were smaller when compared with the medium with sucrose. The fungus A. niger NRRL 3122 produced small pectinase activity in the media where sugars were added. The maximum activity was obtained in the medium with glucose (1,98 UIlgMFU), with similar value for the medium with fiutose (1.55 UIlgMFU). The medium with sucrose (1.1UI1gMFU), presented the smallest activity value. The fungus P. italicum IZ 1584 showed best pectinase production in the tested fermentation media. The pectinase production by P. italicum IZ 1584 was 370,10 superior to the A. niger NRRL 3122 on no washed bagas se, 40% on washed bagasse, 93% on the medium with sucrose, 28.8% on the medium with glucose and 77% on the medium with frutose. In fermentation using mixtures of washed bagasse and no washed bagasse in different proportions, the biggest values of pectinase activity were also obtained with the fungusP. italicum IZ 1584. The maximum value ofactivity (20.72UI/gMFU) was obtained on a medium with 75% washed bagasse and 25% no washed bagasse. This value was the maximum found in this work / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-13T11:34:47Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 15826 bytes, checksum: 80e9778f9db86d01b847c607230b3867 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T11:34:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 15826 bytes, checksum: 80e9778f9db86d01b847c607230b3867 (MD5) Previous issue date: 2002-04-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O elemento transponível impala, isolado do fungo fitopatogênico Fusarium oxysporum, é capaz de sofrer transposição em Penicillium griseoroseum, porém, com uma baixa frequência. Em trabalho anterior, condições de estresse, testadas com o objetivo de aumentar a transposição de impala em P. griseoroseum, foram eficientes, sendo isoladas 691 colônias revertentes, em que o elemento impala havia sofrido transposição. Neste trabalho, foram feitas a caracterização molecular das linhagens revertentes e a avaliação da produção de enzimas pectinolíticas, com o objetivo de testar a eficiência de impala como ferramenta para a etiquetagem e isolamento de genes que codificam pectinases. As análises por hibridização das linhagens revertentes, utilizando como sonda o elemento impala e o gene niaD de A. nidulans, demonstraram que o tratamento por irradiação foi mais eficiente do que o choque térmico para a ativação da transposição em P. griseoroseum. Nas linhagens revertentes obtidas após a irradiação, um maior número de sítios de reinserção de impala foi observado. Entre as linhagens revertentes provenientes do choque térmico, uma apresentou perda total do elemento impala. Das 650 linhagens revertentes analisadas quanto à produção de pectinases, uma linhagem obtida após choque térmico apresentou atividade significativamente inferior de pectina liase quando comparada à linhagem selvagem. A região flanqueadora do novo sítio de inserção do elemento impala foi amplificada por PCR invertido. O fragmento amplificado de 600pb foi clonado e será utilizado como sonda para o isolamento do gene completo em um banco genômico da linhagem selvagem de P. griseoroseum. Este trabalho demonstra, pela primeira vez, que o elemento impala pode ser usado para a etiquetagem de genes no fungo Penicillium griseoroseum. / The tranposable element impala, isolated from the phytopathogenic fungus Fusarium oxysporum, suffers transposition in Penicillium griseoroseum, albeit at low frequency. In a previous work, stress conditions tested to increase impala transposition in P. griseoroseum have been show to be very efficient, resulting in the production of 691 revertant colonies in which impala had suffered transposition. In this work, a molecular characterization of revertant colonies and the analysis of pectinolytic enzyme were done to test impala efficiency as a tool for tagging and isolating pectinase gene. Hybridization analysis of revertant colonies using impala and the niaD gene of Aspergillus nidulans as probes demonstrated that UV treatment was more efficient than thermal shock for the activation of impala transposition in P. griseoroseum. In the revertant colonies obtained after UV irradiation, a larger number of reinsertion sites was observed. Among the revertants produced by thermal shock, one strain showed total loss of impala. Among 650 revertant colonies analyzed for pectinase production, one isolate obtained after thermal shock treatment presented significantly lower pectin lyase activity than the wild type strain. The flanking region of the new insertion site of impala was amplified by inverted PCR. A 600-pb amplified fragment was cloned and will be used as probe for the isolation of the complete gene from a library of the type strain of P. griseoroseum. ixThis work demonstrates for the first time that the element impala can be used for efficient gene tagging in P. griseoroseum.

A produção de pectinases por Aspergillus niger LB-02-SF foi estudada, em processo submerso, com o objetivo de avaliar condições de processo de obtenção, caracterizar e utilizar as enzimas produzidas. As condições de processo estudadas foram a composição do meio de cultivo, a adição de pectina (indutor enzimático) ao meio após a fase de intenso crescimento celular, a utilização de inóculo vegetativo e estratégias de controle do pH. Adicionalmente, o extrato enzimático bruto foi caracterizado quanto à temperatura e ao pH de reação e utilizado no tratamento de suco de maçã Gala. Com o meio de cultivo formulado, que não contém glicose na composição, foi verificada a redução do crescimento celular, sem afetar a produção de pectinases e facilitando o controle dos parâmetros de processo. A adição de pectina quando o pH atingiu o valor de 2,7 (22 horas) não influenciou o crescimento fúngico, sendo que a concentração celular máxima (11,0 g/L) e o tempo em que ela ocorreu (48 horas) foram semelhantes aos observados na condição controle, com pectina presente no meio desde o início do processo (11,5 g/L em 41 horas). Nesta condição de adição de indutor enzimático, a produção de pectinases foi favorecida, sendo atingida atividade máxima de 14 U/mL, cerca de 40% superior à da condição controle, no mesmo tempo de cultivo (135 horas). A utilização de inóculo vegetativo levou à redução da fase de adaptação do microrganismo ao meio. Concentrações de 5 e 10% (v/v) favoreceram o crescimento celular; no entanto, foram verificadas atividades enzimáticas máximas de 5,5 e 3,8 U/mL, inferiores à obtida com a inoculação por esporos (6,4 U/mL). Além disso, não foi observada redução dos tempos em que os picos de atividade enzimática ocorreram. No cultivo com a queda natural do pH inicial de 4,0 para o mínimo atingido (pH 2,5) e posterior controle neste valor, foi obtida atividade enzimática máxima de 7,5 U/mL, superior às atingidas no cultivo com controle de pH em mínimo de 2,7 e no cultivo com pH não controlado, de 6,4 e 3,5 U/mL, respectivamente. Nos cultivos em frascos sob agitação, valores iniciais de pH de 2,0, 3,0 e 4,0 foram os que proporcionaram a obtenção de maiores valores de fator de produção específica (YP/X). Em cultivos em biorreator com o pH controlado nestes valores durante todo o processo, verificou-se que o crescimento celular foi favorecido em pH 3,0, com a concentração máxima de biomassa (10,2 g/L) sendo atingida cerca de 90 horas antes do pico observado no cultivo com pH 2,0 constante (7,7 g/L). Por outro lado, a produção de pectinases foi favorecida em pH 2,0, com pico de atividade enzimática de 9,5U/mL, superior aos determinados com pH constante de 3,0 e 4,0, de 4,7 e 2,0 U/mL, respectivamente. A estratégia de condução do cultivo que possibilitou a obtenção da maior atividade enzimática, de 13,2 U/mL, foi em pH inicial de 3,0 e mantido até que fosse atingido no meio a concentração de oxigênio dissolvido de 30%, sendo então reduzido para 2,0 pela adição de H2SO4. Nesta condição, o crescimento celular não foi afetado, resultando em maior fator de produção específica (1,26 U/mg). A ação das enzimas pectinolíticas produzidas em cultivo líquido foi favorecida em pH 4,0 e em temperatura de 50ºC. A estabilidade das enzimas formadas é favorecida em pH 3,0, sendo observada a manutenção de 90% da atividade inicial após 120 horas de exposição. Com a exposição do extrato enzimático às temperaturas de 30, 40 e 50ºC, 100% da atividade enzimática inicial foram preservados por até 180 minutos. Na avaliação da ação do extrato enzimático no tratamento de suco de maçã, os resultados foram estatisticamente semelhantes aos observados após o uso de preparação pectinolítica comercial. Após o tratamento enzimático, foi determinado aumento de clarificação de 79%, com a redução da turbidez e da viscosidade em 98 e 10%, respectivamente. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que as condições avaliadas para o processo submerso influenciam efetivamente na produção de pectinases e que estas enzimas têm potencial para serem utilizadas em formulações para a clarificação de sucos de frutas. / Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2016-05-12T13:50:52Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Caroline Reginatto.pdf: 1099356 bytes, checksum: ed0414191326cd7f7caa74b8ce16cdec (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-12T13:50:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Caroline Reginatto.pdf: 1099356 bytes, checksum: ed0414191326cd7f7caa74b8ce16cdec (MD5) Previous issue date: 2016-05-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES. / The production of pectinases by Aspergillus niger LB-02-SF was carried out in submerged process, aiming to evaluate process conditions and to characterize and utilize the produced enzymes. The process conditions evaluated were medium composition, addition of pectin (enzymatic inducer) to the medium after the phase of intense cellular growth, use of vegetative inoculum and strategies to pH control. Additionally, the crude enzyme extract was characterized with respect to temperature and pH of reaction and used in Gala apple juice treatment. By using the cultivation medium formulated, which does not contain glucose, it was verified the decrease of the cellular growth without affecting the pectinase production and facilitating the control of the process parameters. The addition of pectin when the pH reached the value of 2.7 (22 hours) did not influence the fungal growth, noticing that the maximum cellular concentration (11.0 g/L) and the time that it occurred (48 hours) were similar to the ones obtained at the control condition, which had pectin in the medium since the beginning of the process (11.5 g/L at 41 hours). In this condition of enzyme inducer addition, the pectinase production was favored, reaching a maximum activity of 14 U/mL, ca. of 40% superior to that of control condition, at the same cultivation time (135 hours). The use of vegetative inoculum led to a decrease in the adaptation phase of the microorganism to the medium. Concentrations of 5 and 10% (v/v) enhanced the cellular growth; however, maximum enzyme activities of 5.5 and 3.8 U/mL were attained, which are lower than that obtained with spore inoculation (6.4 U/mL). In addition, it was not observed a reduction of the times in which the enzyme activity peaks occurred. In the cultivation with natural decrease of the initial pH 4.0 to the minimum reached (pH 2.5) and further control in this value, it was obtained maximum enzyme activity of 7.5 U/mL, which is higher than the ones obtained in the cultivation with pH controlled at minimum of 2.7 and in the cultivation with no pH control, of 6.4 and 3.5 U/mL, respectively. In shaken flasks cultivations, initial pH values of 2.0, 3.0, and 4.0 resulted in highest values for the specific production factor (YP/X). In bioreactor cultivations with the pH controlled at these values along the process, it was verified that the cellular growth was favored at pH 3.0, with the maximum biomass concentration (10.2 g/L) attained about 90 hours before the peak observed in the run at constant pH 2.0 (7.7 g/L). On the other hand, pectinase production was favored in pH 2.0, with enzyme activity peak of 9.5 U/mL, which is higher than the ones obtained with constant pH of 3.0 and 4.0, of 4.7 and 2.0 U/mL, respectively. The strategy of cultivation conduction that enabled the highest enzyme activity of 13.2 U/mL was the use of initial pH 3.0, its control until the dissolved oxygen concentration in the medium reached 30%, and then decreasing to 2,0 by adding H2SO4. In this condition, the cellular growth was not affected, resulting in high specific production factor (1.26 U/mg). The action of pectinolytic enzymes obtained in liquid cultivation was favored at pH 4.0 and temperature of 50°C. The stability of formed enzymes is favored at pH 3.0, being observed the maintenance of about 90% of the initial activity after 120 min of incubation. At 30, 40 and 50°C, after 180 minutes of exposure, 100% of the initial enzyme activity were maintained. The enzyme extracts obtained were used in enzymatic treatment of Gala apple juice and they had comparable effects to those observed after using commercial pectinolytic preparation. After the enzymatic treatment, it was identified 79% of apple juice clarification, with 98 and 10% of turbidity and viscosity reduction, respectively. The results obtained in this work show that the conditions assessed for submerged process effectively influence pectinase production and that these enzymes have potential to be used in formulations for fruit juices clarification.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:06:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo902_1.pdf: 650323 bytes, checksum: be5ceb89d7f1e3c6db7dfc8287955f93 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / Por possuir a capacidade de crescer e se reproduzir mais rapidamente, determinadas leveduras apresentam importância biotecnológica, como capacidade de fermentação alcoólica e floculação através de características física, química, biológica e produção de enzimas. ß-glicosidases e pectinases possuem ampla aplicação em diversos processos industriais, destacando-se na produção de etanol e clarificação de sucos. Com o objetivo de selecionar e caracterizar quanto à produção de ß-glicosidase e pectinase leveduras estocadas na Coleção de Culturas-Micoteca URM, foram realizados testes de viabilidade e perfil taxonômico em 16 isolados pertencentes às espécies Candida lipolytica, C. peltata, Kluyveromyces marxianus, K. polysporus, Pichia barkeri, P. minuta, P. ohmeri, Rhodotorula glutinis e Saccharomyces cerevisiae. Para verificação da capacidade de produzir ß-glicosidase e pectinase foram utilizados, p-nitrofenil-ß-Dglicopiranosideo e pectina cítrica, respectivamente, como substratos. Todas as culturas testadas mantiveram-se viáveis e preservaram seus aspectos taxonômicos. Produziram ß-glicosidase, os isolados de C. lypolytica URM1120, C. peltata URM4681, K. marxianus URM4404, K. polysporus URM1283, P. ohmeri URM4417, R. glutinis URM5092 e S. cerevisiae URM1460, URM5107 e pectinase, os isolados de K. marxianus URM4405, P. ohmeri URM4417 e S. cerevisiae URM1460. C. peltata URM4681, S. cerevisiae URM5107 e K. marxianus URM4405 se destacam como bons produtores de ß-glicosidase, pectina liase e poligalacturonase respectivamente. O estudo e caracterização dessas enzimas de origem fúngica tornam-se relevantes para aplicações na indústria de alimentos

A produção de pectinases por Aspergillus niger LB-02-SF foi estudada, em processo submerso, com o objetivo de avaliar condições de processo de obtenção, caracterizar e utilizar as enzimas produzidas. As condições de processo estudadas foram a composição do meio de cultivo, a adição de pectina (indutor enzimático) ao meio após a fase de intenso crescimento celular, a utilização de inóculo vegetativo e estratégias de controle do pH. Adicionalmente, o extrato enzimático bruto foi caracterizado quanto à temperatura e ao pH de reação e utilizado no tratamento de suco de maçã Gala. Com o meio de cultivo formulado, que não contém glicose na composição, foi verificada a redução do crescimento celular, sem afetar a produção de pectinases e facilitando o controle dos parâmetros de processo. A adição de pectina quando o pH atingiu o valor de 2,7 (22 horas) não influenciou o crescimento fúngico, sendo que a concentração celular máxima (11,0 g/L) e o tempo em que ela ocorreu (48 horas) foram semelhantes aos observados na condição controle, com pectina presente no meio desde o início do processo (11,5 g/L em 41 horas). Nesta condição de adição de indutor enzimático, a produção de pectinases foi favorecida, sendo atingida atividade máxima de 14 U/mL, cerca de 40% superior à da condição controle, no mesmo tempo de cultivo (135 horas). A utilização de inóculo vegetativo levou à redução da fase de adaptação do microrganismo ao meio. Concentrações de 5 e 10% (v/v) favoreceram o crescimento celular; no entanto, foram verificadas atividades enzimáticas máximas de 5,5 e 3,8 U/mL, inferiores à obtida com a inoculação por esporos (6,4 U/mL). Além disso, não foi observada redução dos tempos em que os picos de atividade enzimática ocorreram. No cultivo com a queda natural do pH inicial de 4,0 para o mínimo atingido (pH 2,5) e posterior controle neste valor, foi obtida atividade enzimática máxima de 7,5 U/mL, superior às atingidas no cultivo com controle de pH em mínimo de 2,7 e no cultivo com pH não controlado, de 6,4 e 3,5 U/mL, respectivamente. Nos cultivos em frascos sob agitação, valores iniciais de pH de 2,0, 3,0 e 4,0 foram os que proporcionaram a obtenção de maiores valores de fator de produção específica (YP/X). Em cultivos em biorreator com o pH controlado nestes valores durante todo o processo, verificou-se que o crescimento celular foi favorecido em pH 3,0, com a concentração máxima de biomassa (10,2 g/L) sendo atingida cerca de 90 horas antes do pico observado no cultivo com pH 2,0 constante (7,7 g/L). Por outro lado, a produção de pectinases foi favorecida em pH 2,0, com pico de atividade enzimática de 9,5U/mL, superior aos determinados com pH constante de 3,0 e 4,0, de 4,7 e 2,0 U/mL, respectivamente. A estratégia de condução do cultivo que possibilitou a obtenção da maior atividade enzimática, de 13,2 U/mL, foi em pH inicial de 3,0 e mantido até que fosse atingido no meio a concentração de oxigênio dissolvido de 30%, sendo então reduzido para 2,0 pela adição de H2SO4. Nesta condição, o crescimento celular não foi afetado, resultando em maior fator de produção específica (1,26 U/mg). A ação das enzimas pectinolíticas produzidas em cultivo líquido foi favorecida em pH 4,0 e em temperatura de 50ºC. A estabilidade das enzimas formadas é favorecida em pH 3,0, sendo observada a manutenção de 90% da atividade inicial após 120 horas de exposição. Com a exposição do extrato enzimático às temperaturas de 30, 40 e 50ºC, 100% da atividade enzimática inicial foram preservados por até 180 minutos. Na avaliação da ação do extrato enzimático no tratamento de suco de maçã, os resultados foram estatisticamente semelhantes aos observados após o uso de preparação pectinolítica comercial. Após o tratamento enzimático, foi determinado aumento de clarificação de 79%, com a redução da turbidez e da viscosidade em 98 e 10%, respectivamente. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que as condições avaliadas para o processo submerso influenciam efetivamente na produção de pectinases e que estas enzimas têm potencial para serem utilizadas em formulações para a clarificação de sucos de frutas. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES. / The production of pectinases by Aspergillus niger LB-02-SF was carried out in submerged process, aiming to evaluate process conditions and to characterize and utilize the produced enzymes. The process conditions evaluated were medium composition, addition of pectin (enzymatic inducer) to the medium after the phase of intense cellular growth, use of vegetative inoculum and strategies to pH control. Additionally, the crude enzyme extract was characterized with respect to temperature and pH of reaction and used in Gala apple juice treatment. By using the cultivation medium formulated, which does not contain glucose, it was verified the decrease of the cellular growth without affecting the pectinase production and facilitating the control of the process parameters. The addition of pectin when the pH reached the value of 2.7 (22 hours) did not influence the fungal growth, noticing that the maximum cellular concentration (11.0 g/L) and the time that it occurred (48 hours) were similar to the ones obtained at the control condition, which had pectin in the medium since the beginning of the process (11.5 g/L at 41 hours). In this condition of enzyme inducer addition, the pectinase production was favored, reaching a maximum activity of 14 U/mL, ca. of 40% superior to that of control condition, at the same cultivation time (135 hours). The use of vegetative inoculum led to a decrease in the adaptation phase of the microorganism to the medium. Concentrations of 5 and 10% (v/v) enhanced the cellular growth; however, maximum enzyme activities of 5.5 and 3.8 U/mL were attained, which are lower than that obtained with spore inoculation (6.4 U/mL). In addition, it was not observed a reduction of the times in which the enzyme activity peaks occurred. In the cultivation with natural decrease of the initial pH 4.0 to the minimum reached (pH 2.5) and further control in this value, it was obtained maximum enzyme activity of 7.5 U/mL, which is higher than the ones obtained in the cultivation with pH controlled at minimum of 2.7 and in the cultivation with no pH control, of 6.4 and 3.5 U/mL, respectively. In shaken flasks cultivations, initial pH values of 2.0, 3.0, and 4.0 resulted in highest values for the specific production factor (YP/X). In bioreactor cultivations with the pH controlled at these values along the process, it was verified that the cellular growth was favored at pH 3.0, with the maximum biomass concentration (10.2 g/L) attained about 90 hours before the peak observed in the run at constant pH 2.0 (7.7 g/L). On the other hand, pectinase production was favored in pH 2.0, with enzyme activity peak of 9.5 U/mL, which is higher than the ones obtained with constant pH of 3.0 and 4.0, of 4.7 and 2.0 U/mL, respectively. The strategy of cultivation conduction that enabled the highest enzyme activity of 13.2 U/mL was the use of initial pH 3.0, its control until the dissolved oxygen concentration in the medium reached 30%, and then decreasing to 2,0 by adding H2SO4. In this condition, the cellular growth was not affected, resulting in high specific production factor (1.26 U/mg). The action of pectinolytic enzymes obtained in liquid cultivation was favored at pH 4.0 and temperature of 50°C. The stability of formed enzymes is favored at pH 3.0, being observed the maintenance of about 90% of the initial activity after 120 min of incubation. At 30, 40 and 50°C, after 180 minutes of exposure, 100% of the initial enzyme activity were maintained. The enzyme extracts obtained were used in enzymatic treatment of Gala apple juice and they had comparable effects to those observed after using commercial pectinolytic preparation. After the enzymatic treatment, it was identified 79% of apple juice clarification, with 98 and 10% of turbidity and viscosity reduction, respectively. The results obtained in this work show that the conditions assessed for submerged process effectively influence pectinase production and that these enzymes have potential to be used in formulations for fruit juices clarification.

Made available in DSpace on 2018-08-01T21:59:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_11388_Dissertação Alan Bragança Zordan.pdf: 5252913 bytes, checksum: f2db64e4adc424da5e235722529acc73 (MD5) Previous issue date: 2017-09-11 / Neste trabalho, descrevemos o estudo através de simulação computacional do efeito da pressão sobre o raio de giração de proteínas pectinases utilizadas na fabricação de sucos industriais. A simulação foi desenvolvida utilizando o pacote de programas GROMACS sob o sistema operacional Linux. As aproximações utilizadas são discutidas com detalhes. Os resultados indicam que para pressões até 900MPa, o raio de giração de todas as proteínas é reduzido com o aumento da pressão em até 3,4 %. Sendo que em 900MPa, a pectina metilesterase reduziu seu raio de giração de 3,4 %, pectina liase reduziu 3,0 %, endopoligalacturonase reduziu 3,2 % por cento e exopoligalacturonase reduziu 2,9 %.