Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-03-23Bitstream added on 2014-06-13T18:08:57Z : No. of bitstreams: 1 baptistasaidemberg_nb_me_rcla.pdf: 816123 bytes, checksum: 16394528574d49791508070d14ff8e82 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Os venenos de Vespidae são importantes ferramentas para a defesa dos ninhos. Acidentes com ferroadas de vespas sociais são muito comuns e podem causar diversos sintomas nas vitimas. Esses venenos são ricos em peptídeos policatiônicos, geralmente envolvidos em processos inflamatórios. Os peptídeos mais abundantes encontrados nos venenos das vespas são os peptídeos quimiotáticos e mastoparanos, porém dentre os diversos componentes encontrados no veneno da vespa social A. p. pallipes ainda existem algumas toxinas pouco caracterizadas farmacologicamente. Entre elas encontrou-se os peptídeos Protonectina e Protonectina (1-6) com massas moleculares de 1209 Da (I-L-G-T-I-L-G-L-L-K-G-L-NH2) e 628 Da (I-L-G-T-I-L-NH2), respectivamente. Ao nível molecular, esses peptídeos interagem entre si, resultando na potenciação das atividades funcionais da Protonectina. Considerando-se a importância deste tipo de interação molecular para a indução de processos inflamatórios, os objetivos deste estudo foram: caracterizar a estrutura secundária desses peptídeos individualmente e também a estrutura supramolecular resultante de suas interações, observando os efeitos da mesma sobre as ações de degranulação de mastócitos, quimiotaxia e hemólise. Ambos os peptídeos foram sintetizados manualmente em fase sólida por química Fmoc. A Protonectina é um peptídeo anfifílico, enquanto que a Protonectina (1-6) é muito pequena para assumir estrutura secundária anfifílica. Análises de Dicroísmo Circular, revelaram que na presença de TFE, a Protonectina e Protonectina (1-6) tendem a apresentar estrutura secundária constituída de 36.7% e 17.6% na forma de hélicea, respectivamente. Entretanto, a mistura de ambos peptídeos na proporção de 1:1 resultou em uma estrutura supramolecular que apresentou 48.3% de hélice-a sugerindo, assim, uma possível interação entre esses dois peptídeos...

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A doença de Chagas representa um problema de saúde pública em muitos países e regiões. O tratamento consiste em fármacos tóxicos, com eficácia discutível, principalmente, na fase crônica da doença. Assim, faz-se necessário o planejamento de novos quimioterápicos, mais seguros e eficazes. Os dendrímeros são novas arquiteturas moleculares formadas por um foco central e ramificações partindo desse foco. Apresentam diversas aplicações biológicas como, por exemplo, atuar como transportadores de fármacos. Face ao exposto, o objetivo deste trabalho foi o estudo de condições para ligar o ácido anacárdico (AA) em derivado dendrimérico com potencial ação na doença de Chagas, o qual tem como foco central o ácido succínico (AS) e ramificações compostas por arginina (Arg) e lisina (Lys). Sabe-se que a cruzaína, uma cisteíno-protease do T. cruzi, catalisa a hidrólise de ligação peptídica entre lisina e arginina. A síntese dos compostos em fase sólida forneceu os derivados brutos: (1) pró-fármaco AA-K-R-NH2 e (2) G.05 AA-K(AS)-R-NH2, que foram purificados e caracterizados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e espectrometria de massas. Os compostos purificados AA-K-R-NH2 e AA-K(AS)-R-NH2 apresentaram rendimentos de 34% e 47%, com pureza de 88% e 98%, respectivamente. Os resultados dos experimentos enzimáticos utilizando o AA-K-R-NH2 não foram conclusivos. Acredita-se que a baixa solubilidade e/ou baixa concentração podem ter contribuído para tal. Já na estabilidade química em pH 7,4 (que simula pH sanguíneo), pH 1,2 (que simula pH estomacal) e pH 8,5 (que simula pH intestinal), observou-se que o AA-K(AS)-R-NH2 foi estável durante as 24 h de ensaio. Estes últimos resultados são interessantes, pois espera-se que o pró-fármaco dendrimérico alcance o T. cruzi estruturalmente integro, sofrendo hidrólise e liberação do composto ativo no interior do parasita. / Chagas disease is a public health problem in many countries and regions. The treatment consists of toxic drugs, with debatable efficacy, mainly, in the chronic phase of the disease. Thus, it is necessary to plan new chemotherapeutics, safer and more effective than those drugs. Dendrimers are new molecular architectures composed by a central focus and branching from that focus. They present several biological applications, such as acting as drug carriers. Thereby, the goal of this work was the study of conditions to bind anacardic acid (AA) in a dendrimeric derivative with potential action in Chagas disease, which was composed by a central focus of succinic acid (AS) and branches of arginine (Arg) and lysine (Lys). Cruzain, a T. cruzi cysteine protease, is known to catalyze the peptide-binding hydrolysis between lysine and arginine. Synthesis of the solid phase compounds provided the crude derivatives: (1) prodrug AA-KR-NH2 and (2) G.05 AA-K(AS)-R-NH2, which were purified and characterized by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and mass spectrometry. The purified AA-K-R-NH2 and AA-K(AS)-R-NH2 compounds showed yields of 34% and 47%, with purity of 88% and 98% respectively. The results of the enzymatic experiments using AA-K-R-NH2 were not conclusive. It is believed that the low solubility and/or low concentration may have contributed for this. On the chemical stability at pH 7.4 (which simulates blood pH), pH 1.2 (which simulates stomach pH) and pH 8.5 (which simulates intestinal pH), it was observed that AA-K(AS)R-NH2 was stable for 24 hours. These latter results are interesting because the dendrimeric prodrug is expected to reach structurally integral T. cruzi, undergoing hydrolysis and release of the active compound within the parasite.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-29T13:14:34Z No. of bitstreams: 1 ana-paula-araujo.pdf: 1867740 bytes, checksum: ab9d7b2866753474ebe7ecb95d8e32d9 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-29T13:14:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ana-paula-araujo.pdf: 1867740 bytes, checksum: ab9d7b2866753474ebe7ecb95d8e32d9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A eritropoetina (EPO) é um hormônio produzido, principalmente, pelos rins, que regula a produção de células vermelhas do sangue. Trata-se de uma glicoproteína com 166 aminoácidos, três sítios de N-glicosilação e um de O-glicosilação. Apresenta massa molecular na faixa de 30-34 kDa, sendo aproximadamente 40% correspondente aos glicídeos. A EPO está disponível como agente terapêutico produzido através da tecnologia do DNA recombinante em cultura de células de mamíferos. A EPO humana recombinante (rHuEPO) é usada para o tratamento de anemia associada à insuficiência renal crônica. Devido a relevância médica da rHuEPO, sua produção está sendo nacionalizada através do processo de transferência de tecnologia do Centro de Inmunología Molecular (CIM), de Cuba, para o Instituto de Tecnologia de Imunobiológicos (Bio-Manguinhos)/FIOCRUZ. O controle de qualidade sobre o processo produtivo da rHuEPO e seu produto final é bastante rigoroso. Neste contexto, o mapeamento peptídico é um dos mais importantes ensaios usados no controle em processo da produção de proteínas recombinantes. Este ensaio assegura a integridade da estrutura primária das proteínas ao final das etapas de suas purificações. Sendo assim, o objetivo desta dissertação de mestrado foi definir uma metodologia de mapeamento peptídico da rHuEPO, visando o controle de processo da produção deste biofármaco em Bio-Manguinhos. Previamente, a preparação da rHuEPO fornecida pelo CIM foi avaliada quanto a sua homogeneidade e caracterizadapor eletroforeses em gel de poliacrilamida, cromatografia de fase reversa, cromatofocalização eespectrometria de massa. Para obter os peptídeos da rHuEPO, a hidrólise enzimática desta glicoproteína com a enzima tripsina foi avaliada em diferentes tempos de incubação e com relações enzima/substrato distintas. O fracionamento dos peptídeos foi feito por cromatografia líquida de fase reversa em coluna C18, empregando-se diferentes colunas cromatográficas e gradientes de eluição. As principais frações peptídicas isoladas da cromatografia de fase reversa foram analisadas por espectrometria de massa a fim de comprovar a identidade dos peptídeostrípticos da rHuEPO. A especificidade da metodologia desenvolvida foi avaliada através da comparação dos perfis peptídicos do hidrolisado tríptico da rHuEPO e do quimotripsinogênio A. A hidrólise tríptica usando-se relação enzima/substrato de 1/50 (p/p), concentração de rHuEPO de 1 mg/mL e incubação de 1 hora a 37o C hidrolisou mais de 99% da glicoproteína. As colunas cromatográficas de fase reversa Hi-Pore RP 318, Vydac 218TP C18 e Delta Pak C18 se mostraram aptas para o fracionamento dos peptídeos trípticos da rHuEPO. Em comparação à metodologia usada no CIM, o tempo de incubação de hidrólise foi reduzido em, pelo menos,2 horas e a duração da corrida cromatográfica para obtenção do mapa peptídico diminuiu em, pelo menos, 1 hora e 42 minutos. Na análise por espectrometria de massa das frações isoladas da cromatografia de fase reversa, seis peptídeos trípticos da rHuEPO foram observados. Tais frações peptídicas foram identificadas como pertencentes à EPO humana pelo programa Mascot Search Results. Dessa forma, ficou estabelecida uma metodologia de mapeamento peptídico especifica, simples e rápida para ser utilizada no controle em processo da produção da rHuEPO em Bio-Manguinhos. / Erythropoietin (EPO) is a hormone produced mainly by the kidney that regulates the production of red blood cells. It is a glycoprotein with 166 amino acids, three N-glycosylation and one O-glycosylation sites. It has a molecular weight in the range of 30-34 kDa, being approximately 40% of its content corresponding to carbohydrates. EPO is available as a therapeutic agent produced by recombinant DNA technology in mammaliancell culture. The recombinant human EPO (rHuEPO) is used to treat anemia associated with chronic renal disease. Due to rHuEPO medical relevance, its production technology is a subject of transference from the Centro de Inmunología Molecular(CIM), Cuba, to the Instituto de Tecnologia em Imunonobiologicos(Bio-Manguinhos)/FIOCRUZ. The quality control over production process of rHuEPO and its final product is quite rigorous. In this context, peptidemapping is one of the most important tests used in process control of recombinant proteins production. This test ensures the primary structure integrity of a protein after its purification processes. Thus, the objective of this dissertation was to define a methodology for peptide mapping of rHuEPO aiming to be used in the process control of this biopharmaceutical production in Bio-Manguinhos. Previously, the preparation of rHuEPO provided by CIM was characterized by polyacrylamidegel electrophoresis, reversed phase chromatography, chromatofocusing and mass spectrometry. In order to obtain rHuEPO peptides, the enzymatic hydrolysis of this glycoprotein with the enzyme trypsin was assessed at differents incubation times and enzyme/substrate ratio. Peptides fractionation was performed by reverse phase liquid chromatography, using distincts C18 columns and elution gradients. The main peptide fractions from reversed phase chromatography were analyzed by mass spectrometry to confirm the identity of rHuEPO tryptic peptides. The specificity of the developed methodology was evaluated by comparing peptides profiles from rHuEPO and Chymotrypsinogen A tryptic hydrolysates. The tryptic digestion using enzyme/substrate ratio of 1/50 (w/w), substrate concentration of 1 mg/mL and incubation for 1 hour at 37°C hidrolysated more than 99% of the glicoprotein. The reversed phase columns Hi-Pore RP318, Vydac 218TP C18 e Delta Pak C18 were able to fractionate the rHuEPO tryptic peptides. Compared to the methodology used in CIM, the hydrolysis incubation time was reduced by at least 2 hours and the chromatographic running time to obtain the peptide map was decreased by at least 1 hour and 42 minutes. The mass spectrometry analysis of the fractions isolated from reversed-phase chromatography showed six tryptic peptides of rHuEPO. These peptide fractions were identified as belonging to human EPO by the program Mascot Search Results. Thus it was established an specific, simple and fast peptide mapping methodology to use in process control of rHuEPO in Bio-Manguinhos.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2016-06-06T14:55:01Z No. of bitstreams: 1 Vilma Sobral Bezerra.pdf: 3241045 bytes, checksum: 1dbe7e33df34dacca3124c036d6370bd (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-06T14:55:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vilma Sobral Bezerra.pdf: 3241045 bytes, checksum: 1dbe7e33df34dacca3124c036d6370bd (MD5) Previous issue date: 2011-12-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Dairy proteins have bioactive peptides production great potential, however, their bioactivity is achieved only after enzymatic hydrolysis, which produces substances beneficial to health when incorporated into food or pharmaceuticals. Among them, casein has been used for this purpose. This study aims to determine peptide profile and amino acid sequence of bioactive peptides derived from Moxotó goat milk casein hydrolysis, using proteolytic enzymes such as trypsin, pepsin, papain and a protease extracted from Penicillium aurantiogriseum URM 4622. Enzymatic hydrolysis was performed using a statistical experimental design, which independent variables were pH, enzyme substrate (E: S), temperature and reaction time in Moxotó goat milk casein hydrolysis. Hydrolysis products were visualized in SDS-PAGE electrophoresis. Hydrolysates subjected to ultrafiltration (cut off 3000Da) were used to determine biological properties. Antioxidant activity was evaluated by ABTS + [2,2 '-Azin-bis (3-ethylbenzothiazoline) 6-sulfonic acid] method, using the pool of peptides (permeate <3000Da; retentate >3000Da). Antimicrobial activity was determined by the Clinical and Laboratory Standards Institute. Binding through the zinc solubility of zinc in the sample by Mass Spectrometry Inductively Coupled Plasma. Peptide profile and amino acid sequences were determined by mass spectrometry MALDI-TOF-MS/MS. The best hydrolysis degree (38.27%) was obtained with pepsin enzyme pH 3.0, 1:100 E: S, temperature of 40°C and 5 hours time reaction. However, a high hydrolysis degree precluded the use of these hydrolysates for bioactive peptides obtention. Casein tryptic hydrolysates demonstrated antioxidant activity up to 3242.3 μmol.L-1TROLOX/mg peptide in retentate (> 3000Da). By papain use, we obtained an activity up to 2329.6 μmol.L-1TROLOX /mg of peptide in permeate (<3000Da). The peptides produced by P. auratiogriseum protease action showed activity from 843.17 to 2587.30 μmol.L-1of Trolox / mg of 10 and 29% peptides hydrolysates, respectively, which were compatible with natural antioxidants, such as C vitamin and α-tocopherol. Goat casein tryptic hydrolysates demonstrated antimicrobial activity against Enterococcus faecalis ATCC 6057, Escherichia coli ATCC 2508, Klebisiela pneumoniae ATCC 29665, Bacillus subtilis ATCC 6633. Casein hydrolysates showed IC50 of 4.46 mg/g for zinc binding. Mass spectrometry MALDI TOF MS\MS allowed the visualization of caprine casein peptides in permeate (<3000Da), ranging from 568 to 2923 Da. It also showed LLYQEPVLGPV and HPINHQGLSPEVPNENLLR amino acids sequences for αs1 and β-casein, respectively, from casein tryptic hydrolysates; LLYQEPVLGPV sequences of β-casein, the NPWDQVK αs2 NENLL-casein and-casein in the αS1 casein hydrolysates by papain use; LLYQEPVLGPVRGPFPI β-casein sequence from casein hydrolysates obtained by the use of P. aurantiogriseum URM 4622 protease. The casein hydrolysates bioactive properties are referent to the prevalence of hydrophobic amino acids, which possibility of their use as bioactive peptides. / Proteínas lácteas apresentam grande potencial na produção de peptídeos bioativos. A caseína se destaca na produção de bioativos. Entretanto, a sua bioatividade só é conseguida após hidrólise enzimática, ao qual se produz substâncias benéficas à saúde quando incorporados em alimentos ou produtos farmacêuticos. O objetivo deste trabalho foi o de caracterizar e a avaliar atividades biológicas e determinando o perfil peptídico e a sequência de aminoácidos dos peptídeos bioativos obtidos a partir de hidrólise da caseína do leite de cabra Moxotó, usando enzimas proteolíticas tripsina, pepsina, papaína e protease extraída de Penicillium aurantiogriseum URM 4622. A hidrólise enzimática foi realizada através de planejamento experimental estatístico, os quais as variáveis independentes foram pH, relação enzima substrato (E:S), temperatura e tempo de reação na hidrólise da caseína do leite de cabra Moxotó. Os produtos de hidrólise foram visualizados em eletroforese SDS‑PAGE. Os hidrolisados submetidos à ultrafiltração (Cut off 3000Da) foram utilizados para determição das propriedades biológicas. A atividade antioxidante foi avaliada no pool de peptídeos, permeado (<3000Da) e retentado (>3000Da) usando-se o método ABTS+ [2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolin) 6-ácido sulfônico]. A atividade antimicrobiana foi determinada pelo método do Clinical and Laboratory Standards Institute. O carreamento de zinco através da solubilidade do zinco na amostra através da Espectrometria de Massa em Plasma Indutivamente Acoplado. O perfil peptídico e as sequências de aminoácidos foram determinados por espectrometria de massa MALDI-TOF-MS/MS. O melhor grau de hidrólise (38,27%) foi obtido com a enzima pepsina usando pH 3,0, E:S de 1:100, 40ºC e 5 horas de reação. Entretanto, um alto grau de hidrólise impossibilitou o uso desses hidrolisados para obtenção de peptídeos bioativos. Os hidrolisados trípicos da caseína mostraram atividade antioxidante de até 3.242,3μmol.L-1TROLOX/mg de peptídeo no retentado (>3000Da). Com o uso da papaína, obteve-se uma atividade de até 2.329,6μmol.L-1TROLOX/mg de peptídeo no permeado (<3000Da). Os peptídeos produzidos pela ação da protease produzida por P. auratiogriseum apresentaram atividade de 843,17 a 2.587,30μmol.L-1de TROLOX/mg de peptídeos para os hidrolisados com 10 e 29% respectivamente, os quais foram compatíveis a antioxidantes naturais, como a vitamina C e α-tocoferol. Os hidrolisados trípticos da caseína caprina apresentaram atividade antimicrobiana frente a Enterococcus faecalis ATCC 6057, Escherichia coli ATCC 2508, Klebisiela pneumoniae ATCC 29665, Bacillus subtilis ATCC 6633. Os hidrolisados de caseína mostraram IC50 de 4,46mg/g para carreamento de zinco. A espectrometria de massa MALDI TOF MS permitiu visualizar os peptídeos no permeado (<3000Da) da caseína caprina, na faixa de 568 a 2.923 Da. Mostraram as sequências LLYQEPVLGPV e HPINHQGLSPEVPNENLLR e da β- e αs1-caseina para hidrolisados trípticos da caseína; as sequências LLYQEPVLGPV da β-caseína, NPWDQVK da αs2-caseina e NENLL da αS1-caseína nos hidrolisados da caseína com o uso da papaína e a sequência LLYQEPVLGPVRGPFPI da β-caseina no hidrolisado da caseína com o uso da protease produzida por P. aurantiogriseum URM 4622. As propriedades bioativas dos hidrolisados da caseína referem-se à prevalência de aminoácidos hidrofóbicos, o que possibilita o uso destes como peptídeos bioativos.