Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-09-09T20:13:58Z No. of bitstreams: 2 LUANA MARCHI QUADROS.pdf: 486273 bytes, checksum: 3aba5f2bff1f008819318201078a6c61 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Approved for entry into archive by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-09-09T20:14:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 LUANA MARCHI QUADROS.pdf: 486273 bytes, checksum: 3aba5f2bff1f008819318201078a6c61 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-09T20:14:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 LUANA MARCHI QUADROS.pdf: 486273 bytes, checksum: 3aba5f2bff1f008819318201078a6c61 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2015-10-16 / O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é considerado um importante patógeno de bovinos e está amplamente disseminado no rebanho brasileiro. A transmissão do vírus ocorre por contato direto e indireto entre animais infectados e animais susceptíveis, sendo que os animais persistentemente infectados são fundamentais na manutenção do vírus no rebanho. A reprodução experimental da infecção possibilita o estudo dos parâmetros clínicos e virais, bem como o estabelecimento de parâmetros para testes de diagnóstico, de vacinas e a determinação de medidas de controle. Com o objetivo de estudar a patogenicidade de uma amostra brasileira de BVDV-1a 241.10, quatro bovinos foram inoculados pela via intranasal com uma suspensão viral contendo 107,2 TCID50/ml. Um animal não inoculado foi mantido em contato para avaliar a transmissibilidade. Após a inoculação, os animais foram monitorados diariamente para observação de sinais clínicos. Amostras de secreções nasais foram coletadas nos dias -3 ao 15 dias pós-inoculação (pi) e sangue nos dias -2, 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 e 14 pi para detecção da presença viral por isolamento em cultivo celular. A contagem dos leucócitos totais foi realizada em diferentes momentos nos dias -3, 0, 3, 6, 9, 12 e 15 pi. A detecção de anticorpos foi realizada no soro em intervalos de 7 dias até o dia 42 pi. Após a inoculação não foram observados sinais clínicos evidentes, apenas secreção nasal e ocular serosa entre os dias 1 e 5 pi e tosse discreta entre os dias 2 e 4 pi. A temperatura corporal teve um leve aumento entre os dias 4 e 6 pi. O animal controle não desenvolveu nenhum dos sinais observados no grupo infectado. A detecção viral no sangue revelou a presença de viremia entre os dias 4 e 8 pi e nas secreções nasais entre os dias 1 até 10 pi. O vírus não foi isolado no sangue e secreção nasal do animal contato, demonstrando ausência da transmissão. Nos animais inoculados observou-se uma redução na contagem total de leucócitos entre os dias 3 e 12 dpi. Anticorpos neutralizantes foram detectados inicialmente no dia 14 pi em todos os animais inoculados e permaneceram até o dia 42 pi. A detecção de anticorpos anti-p80 não-estrutural ocorreu em dois animais no dia 14 pi e no dia 42 pi todos os animais soroconverteram. O animal controle não desenvolveu anticorpos em nenhum momento. Assim sendo, conclui-se que a amostra de BVDV utilizada na infecção experimental possui baixa patogenicidade e reduzida capacidade de transmissibilidade para os animais em contato. Desta forma, a disseminação da infecção pode ocorrer na população bovina de forma discreta e de difícil percepção. / The bovine viral diarrhea virus (BVDV) is considered an important pathogen of cattle and are widespread in the Brazilian herd. Transmission of the virus occurs by direct and indirect contact between infected and susceptible animals, and the persistently infected animals are essential in the maintenance of virus in the herd. The experimental reproduction of infection allows the study of clinical and viral parameters as well as setting parameters for diagnostic testing of vaccines and the determination of control measures. In order to study the pathogenicity of a sample of Brazilian BVDV-1a 241.10 four cattle were inoculated intranasally with a viral suspension containing 107.2 TCID50 / ml. One non-inoculated cattle was kept in contact with the inoculated cattle to assess the transmissibility. After inoculation, the animals were monitored daily to observe clinical signs. Samples of nasal secretions were collected on days -3 to 15 post-inoculation (pi) and blood on days -2, 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 and 14 pi for detection of viral presence by isolation in cell culture. The total leukocyte count was performed at different moments on days -3, 0, 3, 6, 9, 12, and 15 pi. The detection of antibodies was performed in serum at 7 day intervals until the 42 day post-inoculation. After inoculation no clinical signs were observed, only nasal and ocular serous secretion between days 1 and 5 pi and discreet cough between day 2 and 4 pi. Body temperature increased slightly between day 4 and 6 pi. Animal Control did not develop any of the signs observed in the infected group. The viral detection in the blood showed the presence of viremia between 4 and 8 days pi and nasal secretions between day 1 up to 10 pi. Virus was not isolated in the blood and nasal secretions of the animal contact, demonstrating the absence of transmission. In animals inoculated it was observed there was a reduction in total leukocyte count between day 3 up to 12 dpi. Neutralizing antibodies initially were detected on day 14 pi in all inoculated animals and remained until day 42 post-inoculation. The detection of anti-p80 antibodies occurred in two animals on day 14 post-inoculation and on day 42 post-inoculation all animals seroconverted. Animal Control did not develop antibodies at any moment. Therefore, it is concluded that the BVDV sample used for infection has low pathogenicity and reduced capacity of transmissibility for animal contact. Thus, the spread of infection can occur in the cattle population in a discreetly way and difficult perception.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-11-07T14:11:24Z No. of bitstreams: 1 Tercya Lucidi de Araujo Silva.pdf: 866187 bytes, checksum: b0709898772f562c473a39e1c1defb22 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-07T14:11:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tercya Lucidi de Araujo Silva.pdf: 866187 bytes, checksum: b0709898772f562c473a39e1c1defb22 (MD5) Previous issue date: 2009-08-28 / A major health problems seen in caprinovinocultura of Pernambuco is the occurrence of miscarriages and birth defects, occurring in an endemic form in the creations. The etiology of these disorders in small ruminants has not been fully resolved. The pestiviruses occur in cattle in several countries, including Brazil, Pernambuco state. To check the involvement of pestiviruses as one of the potential participants in the etiology of abortions was estimated, through a seroepidemiological survey, its prevalence in goats and sheep reared in the backwoods of Pernambuco State, the main producing region of the state. For this, were subjected to neutralization test in microplates, using strain-cytopathogenic BVDV-1 (NADL), 814 serum samples from goats and sheep. The prevalence was 10.89% (9.36 ≤ p ≤ 12.42) in goats and 6.98% (5.36 ≤ p ≤ 8.60) in sheep, with no statistically significant difference (χ2, P > 0.05) between species. The samples were stratified according to animal category (parent, player and young) and middle region from which the samples were from (Pernambucano Hinterland and Interior of the San Francisco Pernambucano) with no statistically significant difference (χ2, P> 0.05) between strata. According to information provided by breeders or handlers, abortion occurred in 70.96% (22/31) of farms where a questionnaire was investigative, and birth defects in 83.87% (26/31). The birth defects most commonly reported were: arthrogryposis of the forelimbs, and subsequent cervical agenesis of the hindlimbs, ceguerira, microphthalmia, agnathia, prognathism, cleft palate and malformations of the face. Additionally he was informed that goats and sheep are raised togetherwith cattle in 61.29% of farms. By the results we can conclude that the pestiviruses occur in small ruminants, regardless of age and sex in the Hinterlands Pernambucano of San Francisco and Pernambucano, in low prevalence. / Um dos principais problemas sanitários observados na caprinovinocultura do Estado de Pernambuco é a ocorrência de abortamentos e de defeitos congênitos, que ocorrem de forma endêmica nas criações. A etiologia desses distúrbios em pequenos ruminantes ainda não é totalmente esclarecida. Os Pestivírus ocorrem em bovinos em vários países, incluindo o Brasil, estado de Pernambuco. Para verificar o envolvimento dos Pestivírus como um dos potenciais participantes na etiologia dos abortamentos foi estimada, através de um inquérito soroepidemiológico, a sua prevalência em caprinos e ovinos criados no sertão Pernambucano, principal região produtora do estado. Para isto, foram submetidas ao teste de soroneutralização em microplaca, utilizando cepacitopatogênica de BVDV-1 (NADL), 814 amostras de soros caprinos e ovinos. A prevalência encontrada foi de 10,89% (9,36≤p≤12,42) em caprinos e 6,98 (5,36≤p≤8,60) em ovinos, não havendo diferença estatisticamente significativa (χ2, P>0,05) entre as espécies. As amostras foram estratificadas segundo a categoria animal (matriz, reprodutor ejovem) e mesorregião de onde as amostras eram procedentes (Sertão Pernambucano e Sertão do São Francisco Pernambucano), não apresentando diferença estatisticamente significativa (χ2, P>0,05) entre os estratos. De acordo com as informações disponibilizadas pelos criadores ou tratadores, o aborto ocorreu em 70,96% (22/31) das criações onde foi aplicado um questionário investigativo, e defeitos congênitos em 83,87% (26/31). Os defeitos congênitos mais frequentemente relatados foram: artrogripose de membros anteriores, posteriores e de cervical, agenesia de membros posteriores, ceguerira, microftalmia, agnatismo, prognatismo, lábio leporino e má formação da face. Adicionalmente foi informado que caprinos e ovinos são criados em conjunto com bovinos em 61,29% das criações. Pelos resultados obtidos pode-se concluir que os Pestivírus ocorrem em pequenos ruminantes, independente de idade e sexo, nos Sertões Pernambucano e do São Francisco Pernambucano, em baixa prevalência.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The genus Pestivirus is composed by four important pathogens of livestock: bovine viral diarrhea virus 1 and 2 (BVDV-1 and BVDV-2), classical swine fever virus (CSFV) and border disease virus (BDV) of sheep. An emerging group of pestivirus temptatively called as HoBi-like, BVDV-3, or atypical pestiviruses was first detected and characterized in Europe from a fetal bovine serum (FBS) lot originated in Brazil. HoBi-like viruses share genetic and antigenic similarities with BVDV species. The present thesis is composed by studies that address the emergence of this virus group and its potential impact on BVDV diagnostic and control. Monoclonal antibody binding demonstrated the existence of conserved regions within epitopes in the glycoprotein Erns and the non-structural protein NS2/3 among the pestiviruses species (BVDV-1; BVDV-2; e HoBi-like), whereas high degree of divergence was detected in glycoprotein E2. These findings suggest that panpestiviruses diagnostic tests may rely on the Erns and NS2/3 proteins, and pestiviruses specific species diagnostic tests should target the E2 glycoprotein. The threshold for detection of HoBi-like virus using commercial BVDV antigen capture ELISA was statistically similar to BVDV detection. On the other hand, two BVDV antibody detection ELISA kits failed to detect at least 20% of animals harboring antibodies against HoBi_D32/00. Thus, it is obvious the need for the development of specific diagnostic tests to HoBi-like viruses. Likewise, it was verified that vaccines containing strains of BVDV-1 and BVDV-2 inactivated or modified live (MLV) virus generate suboptimal protection against HoBi-like viruses. Higher levels of protective antibodies against HoBi-like virus were verified using MLV. Nevertheless the geometric mean titer for HoBi-like was 12.9, while 51.1 and 23.5 for BVDV-1 and BVDV-2, respectively. In addition to low levels of protective antibodies, seroconversion was verified in 68% of animals to HoBi-like virus, although reached 100% and 94% against BVDV-1 and BVDV-2, respectively. Regarding to the diagnostic and control of pestiviruses, the trade of FBS may poses as an important route for dissemination of agents contaminating this product. Composed by a homogenate of serum from hundreds to thousands of fetuses, pestiviruses screening in FBS lots are potentially an important source of information regarding the presence and/or dissemination of these viruses in the region where samples were originated from. Therefore, FBS lots originated in North American countries and processed in the United States of America (USA) or Europe were tested. While several lots were detected as positive for BVDV, none of the lots manufactured in the USA were detected as positive for HoBi-like viruses or antibodies against it. However, two FBS lots processed in Europe were positive for HoBi-like viruses, suggesting that the contamination did occur during the pooling or package of these samples in Europe. These results strongly indicate the need for international rules regarding certification of FBS origin, employment of certified diagnostic tests and measures to avoid contamination of FBS during the manufacturing process. Was also verified the need to include specific tests to detect HoBi-like viruses in the FBS quality control routine. Briefly, the studies here presented demonstrated that the available BVDV diagnostic tests frequently fail in detecting HoBi-like viruses and/or differentiate between HoBi-like virus and BVDV species. In addition, the detection of animal harboring antibodies against HoBi-like using commercial diagnostic tests is unreliable. Likewise, in-vitro studies demonstrated that the cross protection against HoBi-like viruses in serum of animals immunized against BVDV-1 and BVDV-2 is limited. Therefore, the detection and control of this emergent group of viruses require the development of specific diagnostic tests and vaccines. / O gênero Pestivirus é composto por quatro espécies virais: vírus da diarréia viral bovina tipos 1 e 2 (BVDV-1 e BVDV-2), vírus da peste suína clássica (CSFV) e vírus da doença da fronteira (BDV). Um novo grupo de pestivírus, provisoriamente denominado de HoBi-like, BVDV-3, ou pestivirus atípicos foi inicialmente identificado na Europa em uma amostra de soro fetal bovino (SFB) importada do Brasil. O vírus (ou grupo de vírus) HoBi-like possui similaridades ao nível genético e antigênico com o BVDV. A presente tese apresenta trabalhos de avaliação do impacto da emergência deste novo grupo de vírus no diagnóstico e controle do BVDV. Utilizando anticorpos monoclonais, verificou-se maior reatividade cruzada entre as espécies de pestivírus (BVDV-1; BVDV-2; e HoBi-like) em epitopos da glicoproteína Erns e proteína não-estrutural NS2/3, comparando com epitopos da glicoproteína E2. Assim, sugere-se que testes panpestivírus devem ser direcionados às proteínas Erns e NS2/3, enquanto testes específicos podem explorar diferenças existentes na glicoproteína E2. Por meio de um teste comercial de ELISA de captura de antígeno, verificou-se que o limiar de detecção do vírus HoBi_D32/00 é estatisticamente similar ao do BVDV. Entretanto, dois kits de ELISA para a detecção de anticorpos contra o BVDV falharam em detectar ao menos 20% dos animais soropositivos para HoBi_D32/00. Sugere-se a necessidade de reformular os testes diagnósticos para BVDV ou desenvolvimento de testes específicos. Da mesma forma, verificou-se que vacinas para BVDV-1 e BVDV-2 contendo antígenos inativados ou atenuados produzem uma proteção cruzada fraca contra o vírus HoBi-like. Os melhores resultados de proteção foram verificados com o uso de vacina viva atenuada, entretanto, o título médio geométrico (GMT) contra vírus HoBi-like foi de 12,9, enquanto para o BVDV-1 e BVDV-2 foram respectivamente, 51,1 e 23,5. Somado aos baixos títulos de anticorpos, a soroconversão verificada para o vírus HoBi-like foi de 68% dos animais, enquanto 100% e 94% para BVDV-1 e BVDV-2, respectivamente. Relacionado ao diagnóstico e controle dos pestivírus, o comércio de SFB possui papel relevante na disseminação de agentes infecciosos. Composto por um homogeneizado do soro de centenas a milhares de fetos bovinos, lotes de SFB possuem alto potencial para a identificação de pestivírus circulantes na região de origem dos animais abatidos. Assim, foram testados lotes de SFB originados na América do Norte e manufaturados nos EUA ou na Europa. Apesar de vários lotes estarem contaminados com BVDV, não foi evidenciada a presença do vírus HoBi-like ou de anticorpos específicos em lotes produzidos nos EUA. Entretanto, foi detectada a presença do agente em dois lotes manufaturados na Europa, indicando a possibilidade de contaminação dessas amostras durante o processo de pooling e embalagem na Europa. Demonstra-se imprescindível a criação de regras internacionais relacionadas à certificação de origem do SFB, a implementação de testes padrão para a detecção de agentes, e adoção de medidas que impeçam a contaminação do produto durante o processamento. Verificou-se também a necessidade de incluir testes específicos para os vírus HoBi-like na rotina de testes utilizada para certificação de qualidade do SFB. Em resumo, os resultados demonstraram que os testes diagnósticos para BVDV frequentemente falham em detectar o vírus HoBi-like ou em diferenciar BVDV de HoBi-like vírus. Testes comerciais para detecção de anticorpos contra BVDV não detectam eficientemente animais expostos ao vírus HoBi-like. Da mesma forma, estudos in-vitro demonstram que a proteção cruzada contra o vírus HoBi-like conferida a animais vacinados para BVDV é limitada. Assim, medidas de detecção e controle para pestivírus devem incluir testes diagnósticos e vacinas específica para o vírus HoBi-like.