Thesis (Ph. D.) Oregon Graduate Center.

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Thesis (Ph. D.)--OGI School of Science & Engineering at OHSU, 2003. / Includes bibliographical references (leaves 129-151).

Magíster en Bioquímica, Especialización en Bioquímica Ambiental / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento / En la actualidad el uso de combustibles alternativos al petróleo ha tomado auge por el agotamiento de los combustibles fósiles y por el daño al medio ambiente que éstos provocan. Por esta razón la búsqueda de nuevos combustibles ha adquirido gran relevancia. La producción de etanol a partir de biomasa, conocido como bioetanol, surgió como una posible solución al problema de los combustibles; sin embargo, la materia prima para su producción proviene de cultivos de origen alimenticio, utilizando para esto grandes zonas de cultivo, lo que genera una gran controversia. Debido a esto surgió el bioetanol de segunda generación, que utiliza para su producción biomasa lignocelulósica. Esta biomasa se encuentra en grandes cantidades, principalmente como desechos de la industria del papel y de residuos agrícolas. Para la producción de bioetanol desde material lignocelulósico, son necesarias dos etapas adicionales en comparación con la producción de bioetanol de primera generación: una etapa de pretratamiento del material lignocelulósico, y una etapa de hidrólisis de la celulosa. Para la segunda etapa se utilizan celulasas, enzimas que hidrolizan la celulosa para la generación de azúcares simples. El problema es el alto costo de producción asociado a la utilización de estas enzimas. Las investigaciones se han enfocado en el mejoramiento de las celulasas para optimizar el proceso de la hidrólisis de celulosa, con el fin de disminuir los costos de producción del bioetanol de origen lignocelulósico. En la etapa de hidrólisis de la celulosa actúan tres celulasas en forma sinérgica: endoglucanasas, celobiohidrolasas y ß-glucosidasas. Phanerochaete chrysosporium es un hongo que produce varias celulasas, entre ellas el complejo enzimático CBH-I constituido por varias celobiohidrolasas, que constituye el 12% de proteínas totales secretadas por este hongo. El objetivo general de este trabajo es estudiar el rol de CBH-I del hongo P. chysosporium en el proceso de hidrólisis del material lignocelulósico de Nothofagus pumilio (lenga), utilizando una fracción altamente enriquecida con CBH-I proveniente de P. chrysosporium y distintas concentraciones de una endoglucanasa comercial de T. viride, con el fin de obtener un mejor rendimiento de sacarificación que el preparado comercial de T. reesei. Se eligió lenga por ser la segunda especie nativa más abundante en Chile y que presenta residuos abundantes, cuya biomasa puede ser ocupada para la producción de bioetanol de segunda generación Se comparó la sacarificación de lenga por el tratamiento con extractos enzimáticos provenientes del hongo P. chrysosporium versus un preparado comercial de T. reesei. Al comparar la sacarificación, no se observaron grandes diferencias, solo se observó un aumento significativo en la sacarificación por T. reesei a las 48 horas de incubación con 40 μg de proteínas por mg de sustrato. Para determinar si era factible mejorar el proceso de sacarificación del material lignocelulósico, que utiliza enzimas comerciales del organismo T. reesei y estudiar el rol de CBH-I en la sacarificación, se aisló y purificó CBH-I desde un cultivo P. chrysosporium y se realizaron experimentos de comparación de la sacarificación entre CBH-I con una endoglucanasa de T. viride versus el preparado comercial de T. reesei, además se estudió la acción conjunta entre CBH-I y la endoglucanasa comercial T. viride. CBH-I en combinación con una endoglucanasa de T. viride produce una sacarificación mayor que el preparado comercial de T. reesei a las 72 horas de incubación. Se observó sinergismo a concentraciones menores de celulasas (20 μg/ml), encontrándose una disminución de la cooperación a concentraciones mayores (100 μg/ml). Se concluye que CBH-I proveniente de P. chrysosporium podría ser una alternativa para preparaciones enzimáticas comerciales para la degradación de lignocelulosa Además, con el fin de producir celobiohidrolasas CBH-I en mayor cantidad, se realizaron experimentos de expresión de proteínas recombinantes en el organismo E. coli Rosetta-gamiTMB. Para esto se ocuparon dos secuencias génicas de CBH-I aisladas desde el hongo P. chrysosporium denominadas CBH-I cel 7-1 y CBH-I cel 7-2. El uso del sistema de E. coli Rosetta-gami™B, permitió producir CBH-I cel 7-1, aunque en forma inactiva. No se produjo CBH-I cel 7-2 recombinante

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:05:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4553_1.pdf: 555608 bytes, checksum: 9cb94ebf40323d8ad913699e17a82f12 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / Investigações foram realizadas comparativamente sobre a habilidade de biossorção de cobre e zinco pela biomassa de Phanerochaete chrysosporium UCP 963 e Cunninghamella elegans UCP 596. A remoção dos metais pesados foi avaliada utilizando-se diferentes quantidades de biomassa (120 mg e 240 mg), viva e inativada, adicionadas a solução de cobre e de zinco (4 e 6 mM), pH 5.0 sob agitação de 150 rpm, à temperatura de 28 ºC, por 480 minutos. A amostra de C. elegans demonstrou habilidade de remoção dos metais pesados na concentração de 4 mM com rendimentos de 104 mg.g-1 (55% de remoção) para o cobre, 94,44 mg.g-1 (51% de remoção) de zinco, e na concentração de 6 mM zinco removeu 129,71 mg.g-1 (53%) e cobre 171 mg.g-1 (57%), todos os tratamentos foi utilizado 120 mg da biomassa. A biomassa inativada de P. chrysosporium foi mais eficiente na remoção de cobre na concentração de 6 mM com resultados de 134,18 mg.g-1 (45% de remoção) e em ambas concentrações de zinco (4 e 6 mM) apresentando uma sorção de 73-101 mg.g-1 (59-63 %), respectivamente, durante 480 minutos. Os resultados demonstram que tanto a utilização da biomassa inativada e/ou viva de P. chrysosporium e C. elegans apresentam habilidade no processo de remoção de cobre e zinco, possibilitando uma futura aplicação na sorção de metais pesados em ambientes contaminados

Orientador: Nelson Eduardo Duran Caballero / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-26T11:34:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kunz_Airton_D.pdf: 4294963 bytes, checksum: a713adb790fb0d093c8ee32a9e636223 (MD5) Previous issue date: 1999 / Doutorado

Seminario de Título para optar al Título de Ingeniera en Biotecnología Molecular. / Actualmente, el uso de enzimas celulasas, debido a su capacidad de degradar celulosa, ha crecido enormemente y ha sido reportado en industrias como la alimentaria, cervecera y vitivinícola, en la industria alimentaria animal, industrias textil y de detergentes, papelera, y de biocombustibles. En la naturaleza estas enzimas son producidas por hongos y bacterias, y son principalmente secretadas al medio extracelular. Estas enzimas pertenecen a una familia compuesta de al menos tres grupos: exo-celobiohidrolasas (CBH), endo-β-1,4 glucanasa (EG) y β-glucosidasa (BG), las cuales forman parte de un complejo catalítico que actúa de manera sinérgica, en compañía de otras enzimas, degradadando la biomasa. Debido al requerimiento de degradar celulosa por parte de diferentes industrias y ante las condiciones en las cuales se realiza este proceso, como la alta temperatura, el diseño de nuevas enzimas, realizando modificaciones sobre secuencias de proteínas mesófilas ya existentes sugiere ser una buena alternativa. En un estudio anterior, con el fin de generar un método bioinformático predictivo para termoestabilización de proteínas, se analizó el efecto de la temperatura sobre la estructura de la exo-celobiohidrolasa I Cel7C del hongo Phanerochaete chrysosporium usando métodos de dinámica molecular. Como resultado de esto se propuso la introducción de tres puentes disúlfuro, cada uno para una proteína Cel7CDC mutante diferente, los que deberían aumentar la rigidez de la estructura a altas temperaturas, y por lo tanto, su termoestabilidad. Con el objetivo de corroborar experimentalmente el método de predicción bioinformática utilizado, en este trabajo se implementó uno de los tres puentes disúlfuros propuestos para Cel7CDC. Para esto se realizó mutación sitio dirigida mediante la técnica de PCR con partidores que contenían la mutación en su interior, con objeto de generar dos mutaciones puntuales en el gen codificante. Con esto se reemplazó la fenilalanina 325 y la glicina 379 de la cadena aminoacídica de la proteína madura, por cisteínas. Las variantes del gen generadas fueron clonadas en los vectores pBluescript II SK (+) y fueron perpetuadas en E. coli TOP10, y también en el vector pPIC9k para ser expresadas en P. pastoris KM71. Se realizó la transformación y la selección de las variantes de P. pastoris se llevó a cabo por prototrofía en ausencia de histidina y luego con concentraciones crecientes de G418 según protocolos de selección del vector pPIC9k. La selección fue verificada mediante PCR de colonias y secuenciación. La expresión se llevó a cabo según el manual de expresión en P. pastoris con el vector, y tras ser analizadas mediante ensayos de actividad y zimogramas, no se encontró actividad asociada a ellas.

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P. chrysosporium est un champignon saprophyte capable de dégrader de nombreux xénobiotiques, ce qui le rend particulièrement intéressant pour des applications en bioremédiation. Plusieurs publications mettent en avant l'importance de la maîtrise de l'homéostasie métallique dans la production de certaines enzymes lignolytiques. La présence de manganèse est en effet nécessaire à la production des manganèses peroxydases, alors qu'à l'inverse une carence permettra la production de lignines peroxydases. Cependant, la caractérisation de transporteurs impliqués dans le contrôle de l'homéostasie métallique n'a fait l'objet de recherches poussées que chez le champignon modèle S. cerevisiae. L'analyse des transporteurs putatifs de manganèse de 26 espèces fongiques représentant 20 ordres fongiques a permis de constituer un répertoire de 281 transporteurs de manganèse. L'analyse phylogénétique a permis de mettre en évidence que des processus de duplication, mais également de délétion, avaient eu lieu en particulier chez S. cerevisiae. Cependant ce dernier ne possède pas de transporteurs de manganèse appartenant à la famille des Cation Diffusion Facilitator. Dans le génome de P. chrysosporium, onze transporteurs de manganèse appartenant à différentes familles de gènes ont été identifiés. Le niveau d'expression de ces différents gènes a été étudié notamment en condition lignolytique. Ces transporteurs ont également été clonés afin de vérifier leurs fonctions par complémentation en système hétérologue. Cette étude a permis de mettre en évidence les transporteurs de manganèse putatifs de nombreux organismes fongiques, ainsi que l'absence d'une famille de transporteurs impliquée dans les mouvements de manganèse chez S. cerevisiae / P. chrysosporium is a saprophytic fungus able to degrade many xenobiotics which makes it particularly attractive for applications in bioremediation. Several publications highlight the importance of metal homeostasis in the production of lignolytics enzymes. Indeed the presence of manganese is required for the production of manganese peroxidase. Conversely, deficiency allows the production of lignins peroxidases. Characterization of transporters involved in the control of manganese homeostasis has been only researched in the model S. cerevisiae. Analysis of putative manganese transporters of 26 fungal species representing 20 orders of fungus was used to form a repertory of 281 transporters of manganese. Phylogenetic analysis allowed to highlight that duplication process, but also deletion, had occurred particularly in S. cerevisiae. However this one is devoid of transporters belonging to the manganese Cation Diffusion Facilitator. Eleven transporters belonging to gene families in which manganese transporters have been found were identified in the P. chrysosporium?s genome. Expression level of these genes was examined particularly in ligninolytic condition. Transporters have also been cloned in order to verify their functions by complementation in heterologous system. This study allowed to identify putative manganese transporters of numerous fungal organisms and the lack of a transporters family involved in the manganese transport in S. cerevisiae

Thesis (MSc)- Stellenbosch University, 2001. / ENGLISH ABSTRACT: Wood is composed of three main components: cellulose, hemicellulose and lignin. Cellulose is the main structural polymer, whereas the function of lignin in plants is to impart rigidity to the cells, to waterproof the vascular system, and to protect the plant against pathogens. A group of microorganisms, called white-rot fungi, are able to selectively degrade the lignin and hemicellulose from wood leaving the cellulose virtually untouched. The most widely studied fungus of this group is the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium, which has become a model organism in studies of lignin degradation. Lignin is a large, heterogenous and water insoluble polymer and therefore the enzymes needed to degrade it have to be extracellular and non-specific. There are a number of enzymes that are involved in the degradation of lignin, including lignin peroxidases, manganese dependent peroxidases and laccases. Laecases are blue copper oxidases that require molecular oxygen to function, whereas lignin peroxidases and manganese peroxidases are heme proteins that require hydrogen peroxide. Phanerochaete chrysosporium has all three of these enzymes, as well as a system for producing the hydrogen peroxide that is necessary for peroxidases to function. For both scientific and industrial purposes, it is important to obtain linkage maps of the positions of genes in the genome of an organism. Most fungi, including P. chrysosporium, lack easily identifiable phenotypical markers that can be used to map the position of genes relative to each other on the genome. Previous methods of mapping genes in P. chrysosporium involved auxotrophic mutants, radioactivity, or the use of hazardous chemicals. Here we describe an automated DNA-sequencing based mapping technique that eliminates many of the problems associated with previous techniques. Portions of the genes to be mapped were amplified from homokaryotic single basidiospore cultures using gene specific primers using the polymerase chain reaction (PCR) technique. The PCR products were sequenced to determine the segregation of alleles. Two previously mapped lignin peroxidases, lipA and lipC, were used to develop this method, and the results obtained corresponded to the known genetic linkage. A newly characterised 13-glucosidase encoding gene from P. chrysosporium was also mapped. Linkage was found between the 13-glucosidase gene and a histone (Hl) encoding gene. In P. chrysosporium the lignin peroxidase isozymes are encoded by a family of at least ten genes. Previous studies with P. chrysosporium BKM-F-1767 in defined media, wood and soil have shown differential expression of the lignin peroxidase isozymes. In this investigation the levels of expression of lignin peroxidases in P. chrysosporium ME446 cultures grown in nitrogen or carbon limited defined liquid media, as well as on aspen wood chips were determined by competitive reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-peR). These results were compared to those previously obtained from P. chrysosporium BKM-F-1767 to evaluate strain specific variation in the expression of lignin peroxidases. The results indicate that, although there were many similarities in the patterns of lignin peroxidase expression, there were also enough differences to conclude that there were strain specific variations in the temporal expression of the lignin peroxidases. To conclude, a fast and cost effective method for mapping genes in P. chrysosporium was developed. Also, we showed that strain specific variation in temporal expression of lignin peroxidases occurs. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Hout bestaan uit drie hoof komponente nl. sellulose, hemisellulose en lignien. Sellulose is die hoof strukturele polimeer, terwyl die funksie van lignin in plante is om die selle te versterk, die vaskulêre sisteem waterdig te hou, en die plant teen patogene te beskerm. 'n Groep mikroërganisms, bekend as witvrotswamme, kan lignien en hemisellulose selektief uit die hout verwyder, terwyl die sellulosevesels oorbly. Vanuit hierdie groep swamme is die meeste navorsing op die basidiomiseet Phanerochaete chrysosporium gedoen Lignien is 'n groot, heterogene polimeer en is onoplosbaar in water. Die ensieme wat benodig word om lignien afte breek is daarom nie-spesifiek en kom ekstrasellulêr voor. 'n Aantal ensieme is by die afbraak van lignien betrokke, insluitend lignienperoksidase, mangaanperoksidase en lakkase. Lakkase is 'n blou koperoksidase wat suurstof benodig vir aktiwiteit. Lignienperoksidase en mangaanperoxidase is heemproteïene en benodig waterstofperoksied. Phanerochaete chrysosporium het al drie van hiedie ensieme, sowel as 'n sisteem wat waterstofperoksied produseer. Vir beide wetenskaplike en nywerheidsdoeleindes is koppelingskaarte wat die posisie van gene in die genoom van 'n organisme aandui noodsaaklik. Die meeste swamme, P. chrysosporium ingesluit, het geen fenotipiese merkers wat maklik van mekaar onderskei kan word nie, en dit is dus moeilik om 'n kaart van die ligging van gene op die genoom te bepaal. Vorige metodes om gene in P. chrysosporium te karteer het auksotrofiese mutante, radioaktiwiteit of gevaarlike chemikalieë gebruik. Ons beskryf 'n metode wat van automatiese DNA-volgordebepaling gebruik maak en wat baie van die tekortkominge van die ou metodes oorkom. Dele van die gene is met geen-spesifieke PKR-amplifikasie uit kulture van homokariotiese enkel basidiospore verkry en die DNA-volgorde is bepaal om die segregasie van die allele te ondersoek. Twee gene waarvoor 'n koppelingskaart alreeds uitgewerk is, fipA en lipt), was gebruik om hierdie metode te ontwikkel. Die resultate stem ooreen met die bekende genetiese koppeling tussen hierdie gene. 'n Geen wat onlangs in P. chrysosporium ontdek is, nl. I3-glucosidase, is ook met hierdie metode gekarteer. Koppeling is met 'n histoon (Hl) geen gevind. Die lignienperoksidase isoensieme in P. chrysosporium word deur 'n familie van ten minste tien gene gekodeer. Vorige navorsing met P. chrysosporium BKM-F-1767 in gedefineerde media, hout en grond het getoon dat 'n variasie in die uitdrukking van lignienperoxidase isoensieme voorkom. In hierdie ondersoek is 'n kultuur van P. chrysosporium ME446 in stikstof- of koolstof-beperkende vloeibare media opgegroei, as ook op aspen houtblokkies. Die vlak van uitdrukking van die lignienperoksidases is deur middel van die omgekeerde transkripsie polimerasekettingreaksie (RT-PKR) bepaal. Die resultate vir P. chrysosporium ME446 is vergelyk met vorige resultate van P. chrysosporium BKM-F-1767 om te bepaal of stamspesifieke variasies in die uitdrukking van lignienperoksidases voorkom. Daar is 'n aanduiding dat, alhoewel soortgelyke patrone in die vlakke van lignienperoksidase uitdrukking voorkom, daar ook noemenswaardige verskille is. Hieruit kan afgelui word dat stamverwante variasie van lignienperokisdase uitdrukking voorkom. Ten slotte, ons het 'n vinnige, goedkoop metode om die gene in P. chrysosporium te karteer ontwikkel. Ons het ook bewys dat stam-spesifieke variasie in die uitdrukking van die lignienperoxidase gene voorkom.