A complete initial velocity study of the 6-phosphogluconate dehydrogenase from Candida utilis in both reaction directions suggests a rapid equilibrium random kinetic mechanism with dead-end E:NADP:(ribulose 5-phosphate) and E:NADPH:(6- phosphogluconate) complexes. Initial velocity studies obtained as a function of pH and using NAD as the dinucleotide substrate for the reaction suggest that the 2'-phosphate is critical for productive binding of the dinucleotide substrate. Primary deuterium isotope effects using 3-<i-6-phosphogluconate were obtained for the 6-phosphogluconate dehydrogenase reaction using NADP and various alternative inucleotide substrates.

La Polyarthrite Rhumatoïde est caractérisée par une synovite à l’origine de lésions progressives ostéo-articulaires induites par les formes réactives de l’oxygène (ROS) produites par la NADPH oxydase des polynucléaires neutrophiles (PMN). La NADPH oxydase des phagocytes, est formée d’un centre catalytique membranaire, le cytochrome b558, sur lequel vient s’associer des protéines cytosoliques régulatrices (p67phox, p47phox, p40phox et Rac1/2). Nous avons étudié la spécificité de l’interaction entre la (6-phosphofructokinase 2) et de la 6PGDH (6-phosphogluconate déshydrogénase) et la NADPH oxydase des PMN. D’autre part, nous avons caractérisé les domaines de l’hétérocomplexe S100A8/A9 impliqués dans l’activation de la NADPH oxydase phagocytaire. Par ailleurs, une étude de la signature protéique dans le liquide synovial a été menée afin de rechercher l’empreinte de l’activation du PMN dans la PR.Après stimulation par le PMA, la 6PGDH et la PFK2 co-imunoprécipitent avec les facteurs cytosoliques p67phox, p47phox and p40phox. Les expériences de microscopie confocale suggèrent une co-localisation de ces deux enzymes du métabolisme du glucose avec la NADPH oxydase, dans des micro-domaines membranaires : les radeaux lipidiques. La 6PGDH est impliquée dans l’activation de la NADPH oxydase phagocytaire en élevant la concentration du NADPH cytosolique mais également en augmentant l’affinité de cette enzyme pour son substrat, le NADPH. PFK2 est l’enzyme majeure de la régulation de la glycolyse, voie est essentielle pour la production d’ATP du PMN. L’utilisation du complexe S100A8/A9 et de protéines chimères de fusion nous a permis de révéler que la partie C-terminale de S100A8 est impliquée dans la liaison avec le cytochrome b558 et l’activation de la NADPH oxydase phagocytaire. In vivo, le profil protéique du liquide articulaire de PR a révélé l’empreinte de l’activation du PMN dans cette pathologie avec une surexpression des protéines S100A8 et S100A9. Une production ectopique de S100A8/A9 par les synoviocytes de type fibroblastique a été mise en évidence.En conclusion, la 6PGDH, la PFK2 et l’hétérodimère S100A8/A9 sont de nouveaux partenaires d’activation de la NADPH oxydase des phagocytes. Dans la PR, l’activation des PMNs conduit à la sécrétion de S100A8/A9 qui semblent constituer à la fois des biomarqueurs pertinents, mais également des cibles thérapeutiques potentielles. / Rheumatoid Arthritis (RA) is caused by an inflammation of the synovial membrane leading to progressive joint destruction and deformation, related to the production NADPH oxidase related-reactive oxygen species (ROS) production. The phagocyte NADPH oxidase is a multi-protein complex formed by a catalytic core, i.e. the transmembrane cytochrome b558 and cytosolic regulators (p67phox, p47phox, p40phox and Rac1/2). We aimed at better analyzing the NADPH oxidase activation through the evaluation of the specificity of the interaction with 6PGDH or PFK2 and through the further analysis of the association with the S100A8/A9 heterocomplex. The RA-specific protein profiling was conducted in order to determine whether a PMN activation fingerprint could be revealed among RA specific proteins.Upon PMA stimulation, both 6PGDH and PFK2 co-imunoprecipitated with cytosolic factors p67phox, p47phox and p40phox. At the plasma membrane level, confocal microscopy experiments suggested a co-localization of either 6PGDH or PFK2 with the phagocyte NADPH oxidase in lipid rafts. 6PGDH enhanced the phagocyte NADPH oxidase activity by both improving the availability of cytosolic NADPH content and by increasing the affinity of the NADPH oxidase for its substrate. PFK2 also augmented the NADPH oxidase activity. PFK2 modulated the ATP concentration available for the phosphorylation of the phagocyte NADPH oxidase components and for the NDP Kinase related-Rac activation. The generation of truncated S100A8/S100A9 heterodimer chimera could reveal that the C-terminal region of S100A8 is involved in both the interaction and the activation of the phagocyte NADPH oxidase.In vivo, synovial fluid of RA patients was remarkably labelled with the PMN activation fingerprint. S100A8 and S100A9 proteins clearly distinguished RA synovial fluid from osteoarthritis and non RA-synovial fluids. An ectopic production of S100A8/S100A9 was shown in RA fibroblast like synoviocyte.In conclusion, 6PGDH, PFK2 and S100A8/A9 proteins are surrogate activating partners of the phagocyte NADPH oxidase. In RA, the activation of PMNs leads to the release of S100A8/A9 proteins which may constitute interesting biomarkers and promising therapeutic targets.

Les thiorédoxines (TRX) sont des protéines ubiquistes à activité d’oxydoréductase de ponts disulfure de protéines dites « cibles ». Le génome d’Arabidopsis thaliana code une vingtaine de TRX canoniques dont 10 (divisées en 5 types : f, m, x, y et z) sont localisées dans les plastes. Les TRX f sont connues depuis plus de trente ans pour être des régulateurs centraux du métabolisme photosynthétique, mais les approches expérimentales récentes (protéomique, génétique inverse.) indiquent que ces protéines interviennent dans des métabolismes non photosynthétiques variés, notamment le cycle oxydatif des pentoses phosphate (COPP). Ce travail a consisté à analyser in vitro la capacité des TRX plastidiales à réguler les déshydrogénases du COPP qui assurent la majorité de la production de pouvoir réducteur (sous forme de NADPH) dans des conditions non-photosynthétiques. Les résultats obtenus ont été validés dans un système ferrédoxine/TRX reconstitué et ont permis de proposer un modèle de régulation stricte par certaines TRX de la glucose-6-phosphate déshydrogénase chloroplastique G6PDH1 où la TRX f assure la coordination des cycles réductif (cycle de Calvin) et oxydatif des pentoses phosphate. Des approches biochimiques et biophysiques ont permis de mettre en évidence plusieurs modifications de propriétés catalytiques et structurales faisant suite à la régulation redox de G6PDH1 et d’aborder les déterminants des spécificités de régulations. Ce travail in vitro a été complété par une caractérisation in vivo (basée sur l’utilisation de mutants perte de fonction) de l’importance des TRX y dans le contrôle de l’activité G6PDH racinaire, et les processus de germination. Les résultats obtenus suggèrent que, dans les graines, ce type de TRX interviendrait dans les processus de levée de dormance et de vieillissement via son interconnexion avec les mécanismes de détoxication des formes actives de l’oxygène. / Thioredoxins are ubiquitous thiol-disulfide oxidoreductases on target proteins. In Arabidopsis, many TRX isoforms are found, especially in plastids where 10 isoforms are found and subdivided into five types (f, m, x, y and z type).The f-type TRX is known for decades as a regulator of photosynthetic metabolism, but proteomics and genetics indicate that these proteins might regulate many non photosynthetic metabolic pathways, such as the oxidative pentose phosphate pathway (OPPP).In this work, I have examined in vitro the redox regulation of OPPP dehydrogenases by plastidial TRX, the OPPP being a major source of reducing power (as NADPH) in non-photosynthesizing conditions. Biochemical studies were reproduced in a reconstituted ferredoxin / TRX system, allowing to propose a new function for f-type TRX isoforms co-ordinating both reductive (Calvin cycle) and oxidative pentose phosphate pathways. Biochemical and biophysical approaches revealed several modifications of catalytic and structural properties accompanying the redox regulation of G6PDH1, the first dehydrogenase of the OPPP.In vivo studies, using reverse genetics were developed, to analyse the possible role of y-type TRX in the control of root G6PDH activity and germination physiology. Seeds of y-type TRX mutants display an altered behaviour in dormancy and aging. The possible role of y-type TRX in the control of seed germination through their antioxidant function is discussed.