O Schistosoma mansoni, parasita responsável pela esquistossomose (barriga dágua), doença que afeta cerca de 300 milhões de pessoas em todo mundo, não possui a via de síntese de purinas, dependendo integralmente da via de salvação de purinas para seu suprimento dessas bases. Uma vez que a terapia se resume a administração de um único fármaco, o praziquantel, diversos casos de resistência do parasita a esse medicamento foram reportadas, sendo assim esta via tem sido citada como alvo potencial para o desenvolvimento de novos fármacos contra a doença. As enzimas adenosina kinase (AK), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT), adenilsuccinato liase (ADSL) e adenilsuccinato sintetase (ADSS) são enzimas chave desta via. Este trabalho faz parte de um projeto maior que visa a obtenção de todas as estruturas das enzimas envolvidas na via de salvação de purinas de Schistosoma mansoni. O cDNA correspondente às enzimas foi amplificado e clonado no vetor de expressão pOPIN; as enzimas AK isoforma 1, HGPRT isoforma 1 e ADSL foram expressas em E. coli Lemo21(DE3) e HGPRT isoforma 3 em E. coli B834(DE3); purificadas em coluna de cobalto agarose por afinidade, concentradas e cristalizadas no kit de cristalização Morpheus (Molecular Dimensions) no Oxford Protein Production Facility (OPPF) em Harwell UK. As coletas de dados por difração de raio-X foram realizadas no Síncrotron Diamond Light Source (DLS) - UK. Foram coletadas duas estruturas de ADSL, a 2.36Å de resolução em complexo com AMP e 2.14Å na forma Apo. A análise das estruturas revelou uma estrutura tetramérica bastante conservada entre as ADSLs, sendo este estado de oligomerização requerido, uma vez que resíduos de três das quatro subunidades compõem o sítio ativo. Apesar do sítio ativo ser altamente conservado entre SmADSL e ADSL humana, a interface dimérica dessas enzimas tem se apresentado suficientemente distintas, o que pode representar um potencial alvo para o desenvolvimento de um inibidor. O ensaio de atividade enzimática de ADSL revelou uma reação endotérmica, indicando que a contribuição da entropia relacionada a grande quantidade de moléculas de água presentes no sítio ativo é importante para a reação cinética. Após diversos experimentos de otimização dos cristais de HGPRT1 e aproximadamente 200 cristais testados, foi obtida uma estrutura em complexo com IMP a 2.8Å de resolução. A análise da estrutura revelou uma estrutura tetramérica. Apesar das subunidades não compartilharem o sítio ativo, este estado de oligomerização é requerido, uma vez que resíduos que compõem o sítio ativo também estão envolvidos em interações na interface dimérica, orientando o resíduo invariável Arg206 na direção do sítio ativo. Foram identificadas quatro mutações na região do sítio ativo entre SmHGPRT e HGPRT humana: Ile149Met, Pro176Arg, Val189Ile e Arg192Lys. Desta forma, a obtenção das estruturas contribui para o entendimento bioquímico desta via essencial para o parasita e de como este pode ser seletivamente privado de recursos. / Schistosoma mansoni is the parasite responsible for schistosomiasis, disease that affects about 300 million people worldwide, and does not have the purine de novo pathway, depending entirely on the purine salvage pathway to supply its demands on purines. Currently, both direct treatment and most disease control initiatives, rely on chemotherapy using a single drug, praziquantel. Concerns over the possibility of resistance developing to praziquantel, has stimulated efforts to develop new drugs for the treatment of schistosomiasis. The purine salvage pathway has been reported as a potential target for developing new drugs against schistosomiasis. Adenosine kinase (AK), hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT), adenylosuccinate lyase (ADSL), adenylosuccinate synthetase (ADSS) are key enzymes in this pathway. This work is part of a larger project aimed at obtaining all the structures of enzymes involved in purine salvage pathway of Schistosoma mansoni. The cDNA corresponding to the enzymes was amplified and cloned in vector pOPIN, AK isoform 1, HGPRT isoform 1 and ADSL were expressed in E. coli Lemo 21 (DE3) and HGPRT isoform 3 in E. coli B834(DE3); purified in cobalt agarose column, concentrated and crystallized in several conditions of the Morpheus (Molecular Dimensions) crystallization kit at the Oxford Protein Production Facility (OPPF) in Harwell UK. The data collection by xray diffraction were performed at Diamond Light Source UK. Two ADSL structures were obtained, ADSL in complex with AMP at 2.36Å resolution and ADSL Apo form at 2.14Å The analysis revealed a tetrameric structure highly conserved between ADSLs, and this oligomerization state is required since residues three of the four subunits comprise the active site. Despite the active site being highly conserved between human ADSL and SmADSL, the dimeric interface of these enzymes it has been shown sufficiently distinct, which may represent a potential target for the development of an inhibitor. The ADSL enzymatic activity assay showed an endothermic reaction, indicating the contribution of the entropy related to the large quantity of water molecules present in the active site is important for the reaction kinetics. After several optimization experiments of HGPRT1 crystals and about 200 crystals tested was obtained a structure in complex with IMP at 2.8Å resolution. The structure analysis revealed a tetrameric structure. Despite the subunits do not share the active site, this oligomerization state is required, since residues that make up the active site are also involved in interactions in dimeric interface, guiding the invariable residue Arg206 toward the active site. Four mutations were identified in the region of the active site between SmHGPRT and human HGPRT: Ile149Met, Pro176Arg, Val189Ile e Arg192Lys. These structures increase the important structural information available about the Schistosoma mansoni purine salvage pathway and how it can be selectively private resources.

Submitted by Luciana Sebin (lusebin@ufscar.br) on 2016-10-11T12:04:16Z No. of bitstreams: 1 DissACMF.pdf: 2760486 bytes, checksum: 27824647d350872bddb22f28a9206da8 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-20T13:38:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissACMF.pdf: 2760486 bytes, checksum: 27824647d350872bddb22f28a9206da8 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-20T13:38:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissACMF.pdf: 2760486 bytes, checksum: 27824647d350872bddb22f28a9206da8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-20T13:38:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissACMF.pdf: 2760486 bytes, checksum: 27824647d350872bddb22f28a9206da8 (MD5) Previous issue date: 2016-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / The mansoni schistosomiasis is the most important of human helminthiasis. Despite advances in its control this disease continues to spread to new geographical areas. It currently affects more than 250 million people. However, limited options are available for and Praziquantel is the drug of choice. Various authors have been searching new drugs and vaccines to control schistosomiasis. This study aimed to evaluate the effects of a prior immunization with recombinant enzymes of Schistosoma mansoni: Adenosine Kinase (AK) and Hypoxanthine-guanine Phosphoribosyltransferase (HGPRT), which are important for parasite purine metabolism, as well as a MIX of these enzymes, and subsequent challenge with cercariae of the parasite in the control of murine infection. Female Balb/c mice were divided into 5 groups. The groups were enzyme-immunized in three doses and 15 days after the last immunization, animals were infected with S. mansoni. After infection in the 47º day egg count were carried in mice faeces and in the 48º day mice were sacrificed for evaluation of leukocyte numbers (blood and peritoneal cavity), worm burden, antibodies production, cytokines quantification and histopathological analysis of the liver of these animals. Our results strongly suggest that, immunization with a MIX originated in these animals reduction in the number of eggs in faeces by 46% when compared with the animals of the infected group. Animals of the groups immunized with AK, HGPRT and/or MIX seem to induce a reduction in the number of eosinophils in the peritoneal cavity when compared to the animals of the infected group. Concerning worm burden, the animals of the MIX group presented greater reduction (31.27%) when compared to the animals of the infected group. The animals of the immunized groups, AK, HGPRT and/or MIX were capable of producing IgG1 antibodies and IgE anti the enzymes and anti the parasite proteins. The animals of the immunized group MIX showed a slight increase in IL-4 production and observed reduction of IL-10, and in the HGPRT group induced a slight increase on IFN-γ production when in compared with the infected group. In addition, the animals of the AK group showed a decrease in the number of hepatic granulomas in tissue (44,55%) and the eggs present in liver (42,31%). Therefore, it suggests that immunization with these enzymes can contributes to schistosomiasis control, as well as it might helps to modulate experimental infection inducing reduction of physiopathology of this parasitosis. / A esquistossomose mansônica é a mais importante das helmintíases humanas. Apesar dos avanços no seu controle continua se espalhando para novas áreas geográficas. Atualmente afeta mais de 250 milhões de pessoas. Entretanto, opções limitadas estão disponíveis para o tratamento da doença e o único fármaco de escolha é o Praziquantel. Assim, vários estudos têm sido propostos para encontrar novos fármacos e vacinas para combater a esquistossomose. Dessa forma, o presente estudo teve como proposta avaliar os efeitos da imunização prévia com as enzimas recombinantes de Schistosoma mansoni Adenosina Quinase (AK) e Hipoxantina-Guanina Fosforibosiltransferase (HGPRT), que participam do metabolismo de purinas do parasito, bem como com o MIX das duas enzimas, e posterior desafio com cercárias do parasito, para o controle da infecção murina. Camundongos fêmea Balb/c foram divididos em 5 grupos. Os grupos imunizados receberam três doses das enzimas e após 15 dias da última imunização, os animais foram infectados com S. mansoni. Após a infecção, no 47° dia foi realizada a contagem de ovos nas fezes e no 48° dia foi realizada a eutanásia dos animais para avaliação de resposta leucocitária (sangue e lavado da cavidade peritoneal), carga parasitária, produção de anticorpos, quantificação de citocinas e análise histopatológica do fígado desses animais. Os resultados demonstraram que, a imunização com o MIX promoveu nesses animais redução do número de ovos nas fezes de 46% quando comparado com os animais do grupo somente infectado. Os animais dos grupos imunizados com AK, HGPRT e/ou MIX apresentaram diminuição na quantidade de eosinófilos na cavidade peritoneal quando comparados com os animais do grupo somente infectado. Em relação à carga parasitária, os animais do grupo imunizado com o MIX apresentaram maior redução (31,27%) quando comparados aos animais do grupo somente infectado. Os animais dos grupos imunizados com AK, HGPRT e/ou MIX foram capazes de produzir anticorpos IgG1 e IgE anti as enzimas e anti as proteínas do parasito. Os animais do grupo imunizado com o MIX apresentaram aumento discreto de IL-4 e foi observada redução de IL-10, e no grupo imunizado com HGPRT houve aumento discreto de IFN-γ, quando comparados com os animais do grupo somente infectado. Além disso, os animais do grupo imunizado com AK apresentaram redução do número de granulomas hepáticos (44,55%) e de ovos no fígado (42,31%), quando comparados com o grupo somente infectado. Assim, sugere-se que a imunização com essas enzimas pode contribuir para o controle da esquistossomose, bem como auxiliar na modulação da infecção experimental, induzindo redução da fisiopatologia desta parasitose.

O presente trabalho teve como objetivos a clonagem, expressão e purificação da proteína HGPRT de Leishimania tarentolae, para a caracterização e cristalização dessa enzima, a fim do seu estudo estrutural e funcional. O gene da HGPRT foi amplificado a partir de uma biblioteca genômica de Leishmania tarentolae da cepa UC Lambda ZAP Express BamHI-Sal3A I. Esse gene foi clonado no vetor de expressão pET29a(+) e usado na transformação da bactéria Escherichia coli BL21 (DE3). Esse sistema de expressão apresentou uma superexpressão da proteína recombinante, que foi purificada em cromatografia de forma iônica, com o uso da coluna de troca anônica POROS 20HQ. A proteína purificada foi utilizada para sua caracterização, como a determinação das constantes cinéticas (Km, Vmax e Kcat) para os diferentes substratos. A proteína foi encontrada como dímero em solução e o pI de aproximadamente 8,2. Além disso, essa proteína foi utilizada nos ensaios de cristalização pelo método de difusão de vapor em gotas suspensas. Os cristais obtidos foram utilizados nos testes da difração de raios-X sendo coletado um conjunto de dados no Laboratório Nacional de Luz Síncroton. Os dados de difração de raios-X foram processados com o uso do pacote de programa HKL. A resolução da estrutura cristalográfica foi obtida pelo método de substituição molecular através do programa AmoRe. Para o refinamento da estrutura foram utilizados os programas de refinamento automático CNS e REFMAC, e a manipulação na estação gráfica foi realizada através do programa O. A estrutura da HGPRT foi resolvida a 2,1 &#197 de resolução com os fatores de concordância Rwork e Rfree finais de 17,34 e 21,53%, respectivamente. / The aims of this work were the cloning, expression and purification of the protein HGPRT from Leishimania tarentolae, for the characterization and crystallization of the enzyme for it structural and functional study. The full-length hgprt gene was isolated from a leishmania tarentolae UC strain Lambda ZAP Express BamHI-Sal3A I genomic library. This gene was cloned in the expression vector pET29a+, and used in the transformation of the bacteria Escherichia coli BL21(DE3). This expression system presented a super-expression of the recombinant protein, which was purified by ionic change chromatography, utilizing the anionic change column POROS 20HQ. The purified protein was utilized for its characterization, including its kinetics constants (Km, Vmax e Kcat) for different substrates. The protein was found to be a dimmer in solution with pI close to 8.2. Besides, this protein was used in the crystallization assays by the steam diffusion in suspended drop technique. The obtained crystals were utilized in the x-ray diffraction studies. The data collection was performed in the Laboratório Nacional de Luz Síncroton. The X-ray diffraction data were processed utilizing the package program HKL. The crystallographic structure resolution was obtained by the molecular replacement method from the AmoRe program. For the structure refinement, the automatic refinement programs CNS and REFMAC were used, and the graphic manipulation was made through the O program. The structure of the HGPRT was resolved with 2,1 &#197 of resolution and final agreement factors Rwork and Rfree of 17,34% and 21,53%, respectively.

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Quinolinate phosphoribosyltransferase (QPRTase, EC 2.4.2.19) is an intriguing enzyme which appears to catalyse two distinct chemical reactions; transfer of a phosphoribosyl moiety from 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate to the nitrogen of quinolinic acid and decarboxylation at the 2-position to give nicotinic acid mononucleotide. The chemical mechanism of QPRTase is not fully understood. In particular, enzymatic involvement in the decarboxylation step is yet to be conclusively proven. QPRTase is neurologically important as it degrades the potent neurotoxin, quinolinic acid, implicated in diseases such as Huntington’s disease and AIDS related dementia. Due to its neurological importance and unusual chemistry the mechanism of QPRTase is important. Described here is a mechanistic study on human brain QPRTase. Human brain QPRTase was successfully expressed in E. coli BL21 (DE3) from the pEHISTEV-QPRTase construct and the protein was efficiently purified by nickel affinity chromatography. The crystal structure was solved using multiwavelength methods to a resolution of 1.9 Å. Human brain QPRTase was found to adopt an energetically stable hexameric arrangement. The enzyme was also found to exist as a hexamer during gel filtration under physiological conditions. Kinetic studies allowed the measurement of the kinetic parameters for quinolinic acid. The data gave a Km of 13.4 ± 1.0 μM and a Vmax of 0.92 ± 0.01 μM min-1. There was no evidence for cooperative binding of quinolinic acid to the six subunits of the QPRTase hexamer. The enzyme showed maximum activity at approximately pH 6. The active site of human brain QPRTase is a deep pocket with a highly positive electrostatic surface composed of three arginine residues, two lysine residues and one histidine residue. Mutation of these residues resulted in either complete loss or significant reduction in enzymatic activity showing they are important for binding and/or catalysis. A possible mechanism involving QPRTase in the decarboxylation of quinolinic acid mononucleotide was proposed. A series of quinolinic acid analogues were synthesised and tested as inhibitors of QPRTase. The inhibition studies highlighted some key interactions in the active site.

Porteur redox intervenant dans nombre de processus métaboliques, le NAD (nicotinamide adénine dinucléotide) est central pour les cellules vivantes. Outre son importance dans le métabolisme oxydoréductif, des données récentes suggèrent fortement d’autres rôles importants pour le NAD dans la signalisation cellulaire. Un système inductible d’enrichissement en NAD en surproduisant la quinolinate phosphoribosyltransférase (QPT) d’Escherichia coli chez Arabidopsis thaliana a permis de mettre en évidence l’implication du NAD dans les mécanismes spécifiques de défenses qui régissent les interactions plante-pathogène. Par ailleurs, une dérégulation de la synthèse de NAD sur l’étape enzymatique catalysée par la QPT endogène d’Arabidopsis thaliana souligne le rôle critique du NAD dans la balance C/N des plantes, en particulier en bouleversant l’assimilation de l’azote en conditions photorespiratoires. Ces travaux nous ouvrent à une nouvelle compréhension des mécanismes de signalisation impliquant le NAD dans les grandes fonctions métaboliques des plantes. / Plant development and functions are underpinned by redox reactions which depend on cofactors such as pyridine nucleotides as nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). Beside its redox properties, NAD has recently been implicated in cellular signalling. An inducible system based on Escherichia coli quinolinate phosphoribosyltransferase (QPT) overproduction in transgenic Arabidopsis thaliana was set up as a convenient experimental technique to raise NAD content. This build-up highlights the involvement of NAD in plant-pathogen specific defense mechanisms. Furthermore, manipulating endogenous Arabidopsis thaliana QPT levels was used to deregulate NAD production. Such an approach points out the critical role of NAD in C/N interactions by shaking up nitrogen assimilation upon photorespiratory conditions. These results pave the way for a new understanding of signalling mechanisms involving NAD in plants major metabolic functions.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5245.pdf: 1568165 bytes, checksum: 9fc25ff9dc83339e50628c08854efd2c (MD5) Previous issue date: 2012-08-29 / Universidade Federal de Sao Carlos / Schistosimiasis mansoni is a neglected chronic parasitic disease that affects thousands of people worldwide, caused by the trematode Schistosoma mansoni. In the infected host the disease is characterized by the presence of granuloma, imunnopathological response of the cellular infiltration against egg antigens. Thus, the host-parasite relation favors hepatosplenomegaly, acite and hepatic fibrosis. Current chemotherapy is based on the use of Praziquantel (PZQ), used against all species of Schistosoma spp for over 30 years. The main issue is that the PZQ is practically inactive against immature schistosomula and favors the resistance growth of the existent lineages, which makes the study for new drugs and vaccines that can contribute to the control of this disease even more urgent. One of the paths on the search for new therapeutic targets is the study of essential enzymes to the S. mansoni. In particular, it is known that the enzymes Adenylate Kinase 1 and 2 (ADK), Uridine cytidine Kinase 1 and 2 (UCK), Hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) e Purine nucleoside phosphorilase 1 (PNP) are found on the metabolic pathways of the parasite s nucleotide, participating in the metabolism of purines and pyrimidines. Our goals in this study were to assess the immunization with these enzymes, using the S. mansoni cercariae infected murine model, and subsequently analyze the acting in oviposition and growth of adult worms. Our results showed that the immunization in Balb/c mice with the UCK enzyme was capable of inducing a specific immune response, which favored a significant reduction of the parasitic load (adult worms). However, it was not possible to observe significant reduction in the number of eliminated eggs. Regarding the immunization with PNP and HGPRT enzymes, the mice had a reduction in the number of eggs per gram of feces. The data obtained are considered interesting and can be new targets for immunotherapy against schistosomiasis mansoni. Thereby, new assays must be made with different dosages of the enzymes for a better assessment on how these enzymes modulate the parasitic load through the eggs reduction, reduction in the adult worms retrieving, as well as the antibody levels during the murine infection by the S.mansoni. / A esquistossomose mansônica é uma doença parasitária, crônica e negligenciada que afeta milhares de pessoas ao redor do mundo, causada pelo trematódeo Schistosoma mansoni. No hospedeiro infectado a doença é caracterizada pela presença do granuloma, resultado imunopatológico do infiltrado celular contra antígenos dos ovos A quimioterapia atual é baseada no uso do Praziquantel (PZQ), usado contra todas as espécies de Schistosoma spp há mais de 30 anos. O principal problema é que o PZQ é praticamente inativo contra esquistossomulos imaturos e favorece o desenvolvimento de resistência das linhagens existentes. Um dos caminhos na busca por novos alvos terapêuticos é o estudo de enzimas que são essenciais para o S. mansoni. Em especial, sabe-se que as enzimas Adenilato Quinase 1 e 2 (ADK), Uridina Citidina Quinase 1 e 2 (UCK), Hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT) e Purina Nucleosídeo Fosforilase 1 (PNP) são encontradas nas vias metabólicas de nucleotídeos do parasito, participando do metabolismo de purinas e pirimidinas. A estratégia de utilizar enzimas do parasito na esquistossomose mansônica murina foi de avaliar uma resposta induzida por estas enzimas quando aplicadas em camundongos BALB/c e desafiados com cercarias de S. mansoni. Desta forma, avaliamos a fase crônica de camundongos imunizados e infectados com S. mansoni, onde foram analisadas amostras parasitológicas, hematológicas, sorológicas e fluidos da cavidade peritoneal. Nosso objetivo neste estudo foi avaliar a imunização com essas enzimas, usando o modelo murino infectado com cercarias de S. mansoni e posteriormente avaliar a ação na oviposição e desenvolvimento de vermes adultos. Nossos resultados demonstraram que a imunização em camundongos Balb∕c com a enzima UCK foi capaz de induzir uma resposta imune específica, a qual favoreceu a diminuição significativa da carga parasitária (vermes adultos). No entanto, não foi possível observar redução significativa no número de ovos eliminados. Em relação à imunização com as enzimas PNP e HGPRT os camundongos que receberam as imunizações com PNP e HGPRT tiveram redução no número de ovos por grama de fezes. Os dados obtidos são considerados interessantes e podem ser considerados novos alvos para a imunoterapia contra a esquistosomose mansônica. Dessa forma, novos ensaios deverão ser realizados com diferentes doses das enzimas para melhor avaliar como essas enzimas modulam a carga parasitária através da redução de ovos, diminuição na recuperação de vermes adultos, assim como os níveis de anticorpos durante a infecção murina pelo S. mansoni.