Entre 15 et 20% des cancers du sein diagnostiqués sont des cancers du sein triple-négatifs (CSTN). Ce sous-type de cancer du sein est caractérisé par l'absence ou le faible niveau d'expression du récepteur au facteur de croissance épidermique de type 2 (HER2) et des récepteurs hormonaux à l'œstrogène et à la progestérone. Par définition, les patientes atteintes de CSTN ne peuvent bénéficier des traitements antihormonaux ou des thérapies ciblées anti-HER2 qui ont nettement amélioré la prise en charge thérapeutique des autres sous-types de cancers du sein. En marge de ces progrès, les CSTN sont ainsi principalement traités par chimiothérapies cytotoxiques, des thérapies ne parvenant pas toujours à empêcher leur dissémination métastatique. Par conséquent, les CSTN sont aujourd'hui associés à des pronostics relativement mauvais et l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques constitue un enjeu majeur de la recherche sur le cancer du sein. C'est dans ce contexte qu'une cible thérapeutique potentielle contre les CSTN a récemment été identifiée: la sérine-thréonine kinase PKC thêta. Cette PKC nouvelle est fortement exprimée dans les CSTN alors qu'elle ne l'est pas, ou très faiblement, dans des cancers du sein exprimant le récepteur aux œstrogènes et dans les tissus mammaires non transformés. L'objectif de ma thèse a été d'étudier la fonction de PKC thêta dans le contrôle de l'invasion de cellules tumorales mammaires, une étape clé de la formation de métastases. Nos travaux montrent qu'une inhibition de PKC thêta aboutit à une nette diminution des capacités invasives de lignées de cellules CSTN in vitro. De même, in vivo cette inhibition limite fortement la formation de métastases chez la souris. Nous identifions le mécanisme moléculaire par lequel PKC thêta contrôle l'invasion: PKC thêta est capable d'activer la voie des adhérences focales en phosphorylant directement la kinase des adhérences focales (FAK) sur des sites de phosphorylations encore jamais identifiés, les sérines 892 et 893. Ces phosphorylations sont essentielles aux effets positifs de PKC thêta sur l'invasion et la FAK phosphorylée de la sorte est retrouvée spécifiquement au front de cellules CSTN en migration. De façon intéressante, ces phosphorylations de FAK par PKC thêta permettent une modification de la dynamique de formation des adhérences cellule/matrice ainsi que celle des protrusions. Le contrôle de ces protrusions passe très certainement par une altération de la dynamique d'activité des RhoGTPases induite par PKC thêta De surcroît, l'utilisation d'une PKC thêta activable par la rapamycine nous permet de finement étudier la temporalité des effets de PKC thêta sur la génération des protrusions et des adhérences cellule/matrice. Enfin, concernant le contrôle de l'activité de PKC thêta en amont, nous constatons que son activation de même que ses effets sur la voie FAK et l'invasion dépendent entièrement de CDCP1 (Cub Domain-Containing Protein 1), un récepteur transmembranaire associé à l'agressivité de plusieurs cancers, dont les CSTN. Mes travaux mettent ainsi en évidence un mécanisme inédit de contrôle de la voie FAK permettant l'invasion de cellules tumorales mammaires. De plus, ils valident PKC thêta en tant que cible thérapeutique potentielle dont l'inhibition pourrait permettre de limiter la dissémination métastatique des CSTN et ce sans effets secondaires majeurs, la fonction physiologique de PKCthêta étant non essentielle. / Triple-negative breast cancer is a subtype of breast cancer that primarily affects women under the age of 40. TNBCs account for 15 to 20% of all diagnosed breast cancers and are defined by tumour cells lacking or weakly expressing the oestrogen receptor, the progesterone receptor and the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2). By definition, these cancers cannot benefit from hormonal therapies or targeted therapies against the HER2 that have both proved to be very efficient in other breast cancer subtypes. Hence, therapies against TNBC are based essentially on classical cytotoxic chemotherapies that are not always able to block metastatic dissemination of those cancers. As a consequence, TNBCs are associated with poor prognosis and thus, finding new therapeutic targets for TNBC constitutes a major challenge for breast cancer research. In that context, a new potential TNBC therepeutical target has recently been identified: the serine threonine PKC theta. This novel PKC is highly expressed in TNBC whereas it is not expressed in breast cancer expressing the oestrogen receptor or non-transformed mammary tissues. The aim of my PhD was to study the function of PKC theta in the control of breast cancer cells invasion, a key step to metastasis formation that can be defined as the ability of cells to migrate through an extracellular matrix. We have shown that PKC theta inhibition leads to strong diminution of the invasive abilities of TNBC cell lines in vitro. Accordingly, we show in vivo that PKC theta inhibition strongly impairs metastasis formation in mice. We have identified the molecular mechanisms through which PKC theta controls invasion: PKC theta is able to activate focal adhesion signalling by directly phosphorylating FAK (Focal Adhesion Kinase) at newly identified phosphorylation sites, serines 892 and 893. We observe that this phosphorylated FAK localizes to nascent adhesions at the leading edge of migrating breast cancer cells and that those phosphorylations are essential to PKC theta control of invasion. PKC theta phosphorylations of FAK also modify the dynamic of cell/matrix adhesions and protrusion formation. The effects on protrusion formation are most certainly linked to PKC theta alteration of Rho GTPases activity dynamic. Furthermore, the use of an activatable PKC theta enables us to precisely study the temporality of PKC theta effects on both protrusions and adhesions. Protrusions and adhesions being essential to cell migration, those results explain PKC theta positive effects on invasion. Finally, regarding the upstream control of PKC theta we observe that PKC theta activation, together with its effect on FAK and invasion, depend on CDCP1, a transmembrane receptor that has been linked to the aggressiveness of several cancers, including TNBC. Altogether, my work reveals a new mechanism of FAK pathway activation leading to breast cancer cell invasion. Moreover, it further defines PKC theta as an interesting therepeutical target, whose inhibition could limit metastatic dissemination of TNBC without major secondary effects, as PKC theta has a non-essential physiological function.

Melanophores are dark brown pigment cells located in the skin of fish, amphibia, reptiles, and many invertebrates. The color of the animal can change via rearrangement of pigment granules, melanosomes, in the cells. The dark melanophores can either hide colorful cells so that the animal appears dark, or let through colors from underneath. The animal regulates its colors and patterns via communicating nerve cells and hormones in the blood stream. It is nowadays well established that melatonin-stimulation of melanophores results in aggregation of melanosomes to the cell center and that the evident outcome is more transparent cells. It has previously been shown that the activity of serine and threonine kinases as well as phosphatases regulates the distribution of melanosomes in the cells. We wanted to study if tyrosine phosphorylations were involved in the regulation of melanosome aggregation. Melatonin-stimulated signaling in the African clawed frog, Xenopus laevis, melanophores was examined. Melansome aggregation was accompanied by tyrosine phosphorylation as shown by immunoblots. Inhibition of tyrosine phosphorylation reduced melanosome aggregation by melatonin, and the phosphorylation most likely regulated pigment aggregation. Tyrosine phosphorylation of the protein was mediated via a Gi/o protein coupled receptor, probably the melatonin receptor Mel1c. The phosphorylation was most likely not a result of the classical Gi/o protein pathway, as Src-kinase and mitogen-activated protein kinase seemed required for phosphorylation and melanosome aggregation. Two candidates for the phosphorylated protein were presented, talin and β-spectrin. The possible involvement of nitric oxide in melanosome aggregation by melatonin was investigated. Nitric oxide appeared to be necessary for melanosome aggregation. The effect of nitric oxide synthase inhibition on melanosome aggregation was not mediated via changes in the tyrosine-phosphorylated protein. We speculated that nitric oxide could affect melanosome distribution via modifications of the actin cytoskeleton. The use of recombinant melanophores as a biosensor has also been examined. A human G protein coupled receptor, opioid receptor 3, was inserted into melanophores by electroporation. The transfected melanophores responded dose-dependently to opioids and an inhibitor of opioid receptors reduced the aggregation response. Future melanophore biosensors migh detect a variety of substances, such as narcotics, pheromones, odors, and tastes.

Comme la plupart des Crustacés, Orchestia cavimana possède un exosquelette minéralisé qu'il renouvelle cycliquement. Du fait des mœurs terrestres de cet animal, ces cycles de mue sont associés à des processus de stockage et de résorption de calcium. Le stockage a lieu sous forme de concrétions calcaires au niveau de diverticules de l'intestin moyen appelés cæcums postérieurs. Les concrétions calcaires sont essentiellement constituées de carbonate de calcium amorphe précipité au sein d'une matrice organique comprenant une fraction protéique soluble et une autre insoluble dans un tampon contenant de l'EDTA. Des résultats précédents ont permis de mettre en évidence, parmi les constituants de la fraction soluble, une protéine acide de masse apparente en SDS-PAGE de 23 kDa qui a été appelée Orchestine. Cette protéine, dont le gène a été cloné et séquencé, n'est pas glycosylée et fixe le calcium. Le but de ce travail a été de poursuivre la caractérisation de ce marqueur protéique. Pour ce faire, nous avons montré qu'Orchestine est phosphorylée sur des résidus sérine et tyrosine. Afin d'étudier les relations entre ces phosphorylations et l'aptitude de la protéine à fixer le calcium, nous avons produit une protéine recombinante dépourvue de toute modification post-traductionnelle. La comparaison de l'aptitude à fixer le calcium des protéines native, native déphosphorylée par diverses phosphatases spécifiques, et recombinante nous a permis de conclure à l'importance fondamentale des sérines dans cette aptitude. De plus, Orchestine interfère dans la croissance in vitro de cristaux de carbonate de calcium. D'autre part, la protéine recombinante nous a permis de lever l'ambiguïté de la divergence de masse moléculaire de la protéine observée en SDS-PAGE (de 23 kDa) et de celle déduite de la séquence (de 12,4 kDa) et de conclure à la correspondance gène orchestine-protéine Orchestine. Enfin la protéine recombinante a été utilisée pour la production d'un anticorps polyclonal afin de localiser Orchestine dans les structures biominéralisées élaborées par O. cavimana lors de son cycle de mue. Orchestine semble non seulement localisée dans les couches non minéralisées des concrétions calcaires (structures de réserve du calcium) mais aussi dans celles des sphérules calciques (structures permettant la remobilisation du calcium). Les propriétés ainsi mises en évidence nous conduisent à envisager qu'Orchestine est une molécule-clé dans la formation des structures de stockage et déstockage élaborées de manière cyclique par O. cavimana.