Processos estão sendo desenvolvidos a fim de recuperar áreas contaminadas por metais pesados. Assim, estudos que caracterizam fungos que degradam estes poluentes, se fazem necessários. Assim sendo, o objetivo desse trabalho foi caracterizar fungos em ambientes aquáticos contaminados por metais pesados e inserir genes a fim de melhorar absorção de metais pesados. 340 isolados fúngicos resistentes a quatro diferentes metais pesados (Pb, Cd, Cr e Hg) foram selecionados e identificados através de exame direto, microcultivo e seqüenciamento de ITS. Os isolados foram testados quanto a velocidade de crescimento radial em meios suplementados com metais pesados. Trichoderma sp. apresentou VCR de 0,9cm/dia (Pb), VCR de 0,7cm/dia (Cd), VCR de 0,8cm/dia e VCR de 0,9cm/dia(Hg). Curvularia afinis apresentou uma VCR de 0,3cm/dia; Uma cepa do gênero Penicillium apresentou alta VCR na maior concentração testada 0,26cm/dia na concentração de 0,5g/L de Cádmio; Aspergillus apresentou VCR de 0,42cm/dia e Microsphaeropsis arundinis apresentou VCR de 0,24 cm/dia. Trichoderma harzianum apresentou melhor capacidade de retenção de metal e foi observada em MET. Saccharomyces cerevisiae foi transformada com o gene sintético EC20 para aumento a retenção destes metais. / Processes are being developed in order to recover areas contaminated by heavy metals. Thus, studies featuring fungi that degrade these pollutants are needed. Therefore, the aim of this study was to characterize fungi in aquatic environments contaminated by heavy metals and insert genes in order to improve absorption of heavy metals. 340 fungal isolates resistant to four different heavy metals (Pb, Cd, Cr and Hg) were selected and identified through direct examination, microculture and ITS sequencing. The isolates were tested for the radial growth rate in media supplemented with heavy metals. Trichoderma sp. presented VCR 0,9cm / day (Pb), VCR 0.7cm / day (Cd), VCR 0.8cm / day and VCR 0,9cm / day (Hg). Curvularia afinis presented a VCR 0.3 cm / day; A strain of Penicillium showed high VCR at the highest concentration tested 0,26cm / day at a concentration of 0.5 g / L of cadmium; Aspergillus presented VCR 0,42cm / day and showed VCR arundinis Microsphaeropsis 0.24 cm / day. Trichoderma harzianum showed better metal holding capacity and was observed in TEM. Saccharomyces cerevisiae was transformed with the synthetic gene EC20 for increasing the retention of these metals.

Processos estão sendo desenvolvidos a fim de recuperar áreas contaminadas por metais pesados. Assim, estudos que caracterizam fungos que degradam estes poluentes, se fazem necessários. Assim sendo, o objetivo desse trabalho foi caracterizar fungos em ambientes aquáticos contaminados por metais pesados e inserir genes a fim de melhorar absorção de metais pesados. 340 isolados fúngicos resistentes a quatro diferentes metais pesados (Pb, Cd, Cr e Hg) foram selecionados e identificados através de exame direto, microcultivo e seqüenciamento de ITS. Os isolados foram testados quanto a velocidade de crescimento radial em meios suplementados com metais pesados. Trichoderma sp. apresentou VCR de 0,9cm/dia (Pb), VCR de 0,7cm/dia (Cd), VCR de 0,8cm/dia e VCR de 0,9cm/dia(Hg). Curvularia afinis apresentou uma VCR de 0,3cm/dia; Uma cepa do gênero Penicillium apresentou alta VCR na maior concentração testada 0,26cm/dia na concentração de 0,5g/L de Cádmio; Aspergillus apresentou VCR de 0,42cm/dia e Microsphaeropsis arundinis apresentou VCR de 0,24 cm/dia. Trichoderma harzianum apresentou melhor capacidade de retenção de metal e foi observada em MET. Saccharomyces cerevisiae foi transformada com o gene sintético EC20 para aumento a retenção destes metais. / Processes are being developed in order to recover areas contaminated by heavy metals. Thus, studies featuring fungi that degrade these pollutants are needed. Therefore, the aim of this study was to characterize fungi in aquatic environments contaminated by heavy metals and insert genes in order to improve absorption of heavy metals. 340 fungal isolates resistant to four different heavy metals (Pb, Cd, Cr and Hg) were selected and identified through direct examination, microculture and ITS sequencing. The isolates were tested for the radial growth rate in media supplemented with heavy metals. Trichoderma sp. presented VCR 0,9cm / day (Pb), VCR 0.7cm / day (Cd), VCR 0.8cm / day and VCR 0,9cm / day (Hg). Curvularia afinis presented a VCR 0.3 cm / day; A strain of Penicillium showed high VCR at the highest concentration tested 0,26cm / day at a concentration of 0.5 g / L of cadmium; Aspergillus presented VCR 0,42cm / day and showed VCR arundinis Microsphaeropsis 0.24 cm / day. Trichoderma harzianum showed better metal holding capacity and was observed in TEM. Saccharomyces cerevisiae was transformed with the synthetic gene EC20 for increasing the retention of these metals.

Les sols représentent une ressource non renouvelable qui soutient 95% de la production alimentaire mondiale. Cependant, les sols sont de plus en plus impactés par la pollution chimique anthropique, menaçant la santé humaine et l’environnement. Parmi les polluants les plus répandus dans les sols, l'arsenic est aussi l’un des plus dommageables pour la santé humaine, touchant près de 200 millions de personnes dans le monde. Pour limiter la contamination des sols, les approches conventionnelles de remédiation reposent principalement sur l'excavation et l'enfouissement des sols contaminés, mais sont incompatibles avec les grandes surfaces concernées par la contamination chimique, pouvant s’étendre sur des millions d’hectares. Une solution novatrice utilise les plantes et les microorganismes associés pour extraire, dégrader ou stabiliser les contaminants in situ dans une approche dite de phytoremédiation. L'exsudation d'une grande diversité de métabolites des racines dans le sol environnant serait un mécanisme essentiel qui permet aux plantes de tolérer et de détoxifier les contaminants du sol. Cependant, l’environnement chimique de la rhizosphère et les interactions complexes entre les exsudats racinaires et les contaminants restent largement inconnus. L'objectif de cette thèse est de faire progresser la compréhension de l'exsudation racinaire en réponse à la contamination et de son impact sur le devenir de l'arsenic dans la rhizosphère. Le Chapitre 1 rapporte un nouveau système de croissance à petite échelle, hautement reproductible, développé pour capturer et caractériser les exsudats racinaires. En utilisant une analyse métabolomique non ciblée basée sur la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse, l’espèce légumineuse Lupinus albus a été examinée pour identifier les différences significatives dans l’exsudation d’un large spectre de composés dans la rhizosphère. Cette approche a révélé les classes prédominantes de composés exsudés et leurs variations en réponse à la contamination, notamment les coumarines, connues pour être impliquées dans les stratégies d'acquisition de nutriments chez les plantes, ainsi que l'exsudation inattendue de phytochélatines, connues pour participer à la complexation et à la détoxification intracellulaire de l'arsenic. Pour confirmer l'exsudation des phytochélatines, une expérience supplémentaire a été menée et a permis de valider l'exsudation des phytochélatines comme mécanisme potentiel de tolérance à l'arsenic dans la rhizosphère. Le Chapitre 2 examine plus en détail les mécanismes d'exsudation des phytochélatines et leurs interactions avec l'arsenic chez Lupinus albus. Grâce à l'inhibition chimique des principales voies de synthèse et d'exsudation des phytochélatines, ce chapitre fournit les premières observations de l’exsudation active de complexes arsenic-phytochélatine chez les plantes, pouvant jouer un rôle critique dans la détoxification de l'arsenic. À partir de ces observations, le chapitre 2 propose une révision du modèle actuel d'efflux d'arsénite des racines et met en évidence l'exsudation de complexes arsenic-phytochélatine comme mécanisme jusque-là inconnu de détoxification chez les plantes. Dans le Chapitre 3, les différentes stratégies employées en réponse à la contamination à l'arsenic chez Lupinus albus et Salix miyabeana sont explorées en profondeur par différents essais en pots et à plus grande échelle, directement sur le terrain. Ces deux espèces, illustrant différents traits fonctionnels importants pour la phytoremédiation, révèlent des adaptations distinctes ainsi que des stratégies d’exsudation conservées en réponse à l'arsenic. Les résultats présentés dans ce chapitre révèlent en particulier le rôle central de l'exsudation de phytochélatines dans la rhizosphère de ces deux espèces, pourtant éloignées phylogénétiquement. Notamment, la découverte de complexes phytochélatine-arsenic dans la rhizosphère des deux espèces souligne l'importance des mécanismes extracellulaires dans la détoxification de l'arsenic chez les plantes. De plus, les mesures sur le terrain soutiennent les implications de l'exsudation des phytochélatines en tant qu’adaptation à l'exposition à l'arsenic en conditions réelles. En résumé, ce chapitre fournit de nouvelles perspectives sur l'interaction complexe entre les plantes et les sols lors de la phytoremédiation de l'arsenic. Dans l'ensemble, cette thèse présente de nouvelles stratégies d'exsudation chez deux espèces phytoremédiatrices majeures et apporte de nouvelles connaissances sur la façon dont l'investissement de ressources dans la rhizosphère peut aider les plantes à tolérer, voire à surmonter, l'effet de la pollution anthropique sur l'environnement. Comprendre ces interactions naturelles est essentiel pour aider à concevoir des stratégies de gestion durables des terres, visant à réduire l'impact à long terme des activités humaines sur les sols. / Soils represent a non-renewable resource supporting 95% of global food production. However, soils face increasing threats from anthropogenic chemical pollution, creating an environmental burden impacting human and environmental health worldwide. Arsenic is one of the most widespread soil contaminants, thought to affect over 200 million people globally and posing substantial threats to public health. To limit contamination of soils, conventional remediation approaches rely on soil excavation and burial, but are incompatible with the extensive problem of soil contamination, often impacting millions of hectares. An innovative solution is to use phytoremediation to harness plants' natural abilities to extract or degrade soil contaminants. The exudation of a wide diversity of metabolites from roots into the surrounding soil is thought to be an essential mechanism used by plants to modify challenging soil environments. However, the extent and variation of root exudation remains largely uncharacterised for many important crops. The objective of this thesis is to advance the understanding of root exudation in response to contamination and how it impacts the fate of arsenic in the rhizosphere. Chapter 1 reports a novel small-scale but highly reproducible growth system developed to capture and characterise root exudates. Using untargeted liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based metabolomic analysis, the leguminous crop white lupin (Lupinus albus) was scrutinised to identify significant differences in exuded compounds within the rhizosphere. This approach revealed the predominant classes of exuded compounds in response to contamination, including coumarins, known to be involved in plant nutrient acquisition strategies, as well as unexpected phytochelatin exudation, known to participate in intracellular arsenic complexation and detoxification. A validatory experiment was conducted and confirmed the exudation of phytochelatins as a potential arsenic tolerance mechanism for rhizosphere detoxification. Chapter 2 further investigates the mechanisms of phytochelatin exudation and their interactions with arsenic in Lupinus albus. Through chemical inhibition of key root exudates synthesis and exudation mechanisms, this chapter provides the first evidence that plants actively exude arsenic-phytochelatin complexes, which may function as a critical step for arsenic detoxification and tolerance. From this evidence, Chapter 2 provides a tentative revision of the current model of arsenite efflux from roots and demonstrates that arsenic-phytochelatin exudation may be an active mechanism conferring arsenic tolerance. In Chapter 3, the different strategies employed in response to arsenic contamination in Lupinus albus and Salix miyabeana were extensively scrutinised in larger-scale pot and field trials, to capture the diversity of rhizosphere metabolites within constructed and real-world soils. These species, illustrating different important functional traits for phytoremediation, revealed distinct as well as more conserved root exudate adaptations to arsenic. Most importantly, the findings presented in this chapter reveal a conserved and pivotal role for extracellular phytochelatin exudation in the rhizosphere of these distantly related phytoremediating species. The discovery of phytochelatin-arsenic complexes in the rhizosphere of both species underscores the importance of extracellular mechanisms in plant arsenic detoxification. Furthermore, field assessments supported the real-world implications of phytochelatin exudation as an adaptive response to arsenic exposure. In summary, this chapter provides novel insights into the complex interplay between plants and soils in arsenic phytoremediation. Overall, this thesis presents novel exudation strategies in two major phytoremediation species and brings new knowledge on how investment of resources in the rhizosphere can help plants tolerate, or even overcome, the effect of anthropogenic pollution upon the natural environment. Understanding these mechanisms is vital to devise sustainable land management strategies to reduce the long-term impact of human activity on soils around the world.

L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a fixé en 1998 la concentration maximale en arsenic dans l’eau de consommation à 10 ppb (μg/L). Dans le monde, plus de 100 millions de personnes sont exposées à des concentrations supérieures à 50 ppb. La toxicité, l’omniprésence et la mobilité de l’arsenic entraînent la nécessité de pouvoir le doser immédiatement sur le terrain. Il existe actuellement deux méthodes de dosage de terrain commercialisées. La première, onéreuse, est basée sur la voltammétrie (> 7000 €). La seconde à environ 2 €/analyse se présente sous le format de bandelette. Elle permet la mesure de teneurs en arsenic avoisinant les 10 ppb, mais nécessite la génération d’arsine (forme la plus toxique), l’utilisation de bromure de mercure et donne jusqu’à 33% de faux positifs. L’entreprise Novassay souhaite développer une nouvelle méthode de dosage de l’arsenic simple, rapide et efficace pouvant être utilisée directement sur le terrain. Ce travail présente dans un premier temps, un nouveau protocole issu d’une optimisation de la méthode dite au bleu de molybdène et de l’utilisation d’une membrane filtrante permettant une lecture colorimétrique sur support solide. Dans un deuxième temps, seront présentés les résultats obtenus sur le développement d’une méthode de dosage inédite de l’arsenic par l’intermédiaire de nanoparticules d’or. Dans cette partie, une molécule imaginée à partir de la structure d'un complexant naturel de l’arsenic sera synthétisée. Les tests de dosage de l’arsenic avec cette molécule seront réalisés sur deux types de nanoparticules d’or, les premières stabilisées au citrate, les secondes stabilisées au xylane. / In 1998, the World Health Organization (WHO) set the maximum concentration of arsenic in drinking water at 10 ppb (μg/L). In the world, more than 100 million people are exposed to concentrations upper than 50 ppb. The toxicity, ubiquity and mobility of arsenic imply the need to be able to dose it immediately on the field. There are currently two commercially available field dosing methods. The first, expensive, is based on voltammetry (> €7000). The second at about €2/analysis is available in the strip format. It allows the measurement of arsenic concentrations close to 10 ppb but requires the generation of arsine (the most toxic form of arsenic), the use of mercury bromide and gives up to 33% false positives. Novassay wants to develop a new simple, fast and efficient arsenic method that can be used directly in the field. Firstly, this work shows a new protocol resulting from an optimization of the molybdenum blue method and the use of a filtering membrane allowing a colorimetric reading on a solid support. In the second part of this work, the results obtained on the development of a novel method of dosing arsenic by the utilisation of gold nanoparticles will be presented. In this part, an imagined molecule from the structure of a natural complexant of arsenic will be synthesized. The arsenic assay with this molecule will be performed on two types of gold nanoparticles, the first stabilized with citrate, the second stabilized with xylan.