Thèse--Méd.--Reims, 1974. N°: N° 45. / Bibliogr. ff. 58-66.

Th.--Méd.--Paris, 1897-1898. / Paris, 1897-1898, tome 31, n ° 171.

Avhandling : Zoomorfologi : Göteborg. / Notes bibliogr.

La rétinite pigmentaire (RP) résulte en une dégénération progressive de la rétine et représente une cause importante de cécité. La transmission de cette maladie se fait selon différents processus d'hérédité dont une forme liée au chromosome X pour la protéine retinitis pigmentosa 2 (RP2) et une forme autosomique récessive dans le cas de la phosphodiesterase 6 (PDE6). RP2 est une protéine qui stimule la réaction d'hydrolyse du GTP et est probablement impliquée dans le transport des protéines. C'est une protéine de 350 acides aminés qui possède deux sites d'acylation et est localisée principalement à la membrane plasmique. Il existe quelques mutations perturbant cette localisation dont la deletion de la serine 6 qui résulte en une RP. Dans la cascade signalétique visuelle, l'activation de la rhodopsine par un photon mène à l'activation de la (PDE6). La PDE6 activée hydrolyse ensuite le GMPc, ce qui mène à la fermeture des canaux GMPc dépendants et à l'hyperpolarisation de la membrane du photorécepteur. La PDE6 est un tétramère d'environ 220 kDa et est acylée, ce qui permet sa liaison à la membrane. On la retrouve, tout comme la RP2, en partie dans les microdomaines résistant aux détergents. Ces microdomaines, aussi appelés radeaux lipidiques, sont riches en phospholipides saturés et en cholestérol. Toutefois, la liaison préférentielle de la PDE6 et de la RP2 à des phospholipides saturés n'a jamais été démontrée. L'objectif de cette thèse est de caractériser les propriétés de liaison membranaire de ces protéines en utilisant des monocouches de Langmuir. Pour ce faire, une RP2 recombinante a été produite et la PDE6 fut extraite de photorécepteur bovin. L'analyse de l'interaction de RP2 avec le modèle membranaire met en évidence l'affinité particulière de RP2 pour les lipides saturés et une liaison préférentielle au domaine liquide condensé. La PDE6 montre aussi une discrimination face aux phospholipides. De plus, les résultats obtenus en spectroscopie infrarouge montrent différentes orientations de sa structure secondaire en fonction de l'environnement lipidique. En somme, les résultats présentés dans cette thèse permettent de postuler de nouvelles hypothèses concernant l'importance de l'interaction membranaire de la RP2 et la PDE6 en ce qui concerne leur implication dans les différents processus impliqués dans les mécanismes de la vision.

Les rétinites pigmentaires (RP) sont des pathologies rétiniennes cécitantes d'origine génétique caractérisées par une perte des photorécepteurs. Nous avons ciblé des formes de RP autosomique dominante consécutives à des mutations dans le gène du pigment visuel de la RHODOPSINE, du facteur d'épissage PRPF31 et du facteur de transcription impliqué dans le développement des photorécepteurs NR2E3. Les fibroblastes, issus de biopsies de peau de patients, ont été reprogrammés en cellules iPS par une technique dite non intégrative. Après stabilisation des cellules iPS, nous avons vérifié leur propriété de pluripotence et l'absence d'anomalies caryotypiques.Les cellules iPS porteuses d'une mutation sur le gène RHODOPSINE ont été différenciées dans le lignage des photorécepteurs. Nos résultats montrent que les photorécepteurs porteurs de la mutation P347L du le gène RHODOPSINE récapitulent la dégénérescence observée chez les patients.Nous montrons que les cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de cellules iPS porteuses de la mutation Cys294X du gène PRPF31 présentent des problèmes d'adhésion cellulaire due à l'absence de lame basale. Leur activité de phagocytose est alors perturbée, suggérant qu'un dysfonctionnement de l'EPR pourrait être à la base de la RP causée par la mutation Cys294X du gène PRPF31. Les modèles développés nous ont permis de mieux comprendre les processus à la base de la pathogénèse de certaines RP. Ces modèles associés à des protocoles de criblage, pourraient permettre d'évaluer l'efficacité et la toxicité de nouvelles molécules pharmacologiques, mais également être utilisés pour valider des approches de thérapie génique. / Retinitis pigmentosa (RP) is an inherited retinal diseases characterized by a loss of photoreceptors. We focused specific forms of autosomal dominant RP with mutations in the rod visual pigment RHODOPSIN, the ubiquitous splicing factor PRPF31 and the transcription factor involved in the development of photoreceptors NR2E3. Fibroblasts from skin biopsies of patients were reprogrammed into iPS cells by a non-integrative approach. After stabilization of iPS cell lines, we verified their pluripotency property and the absence of karyotype abnormalities. Based on the retinal differentiation protocol, iPS cells carrying a mutation in the RHODOPSIN gene have been differentiated in the photoreceptor lineage. Our results showed that the photoreceptors expressing the mutated form of RHODOPSIN summarizing the process of degeneration observed in RP patients. We show that retinal pigment epithelium (RPE) cells derived from iPS cells carrying a mutation in the PRPF31 gene lack basal membranes and have cell adhesion disorders. Consequently, their phagocytic activity is disturbed, suggesting that a malfunction of the RPE could be the primary step of the development of RP caused by mutation Cys294X in the PRPF31 gene. The models developed from specific-patient iPS cells have enabled us to better understand the processes underlying the pathogenesis of some RP. These models associated with screening protocols could be used to evaluate the efficacy and toxicity of new pharmacologic compounds but also used to validate new gene therapy approaches.

Le récepteur MerTK est impliqué dans la phagocytose des segments externes des photorécepteurs (SEP) par l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR), fonction cruciale pour la survie des photorécepteurs et la vision. Dans la rétine, ces deux tissus sont en contact permanent et la phagocytose ne survient qu'une fois par jour, cette fonction nécessite donc d'être contrôlée précisément. Le pic de phagocytose est lié à l'activation intracellulaire de MerTK via l'intégrine αvβ5. Ce projet a eu pour but d'étudier les mécanismes extracellulaires régulant la fonction de MerTK au cours de cette phagocytose.Nous avons montré que MerTK est clivé à la surface des cellules d'EPR in vivo avant et après le pic de phagocytose. Ceci permettrait d'éviter une phagocytose trop prononcée des SEP.Nous avons démontré le rôle opposé des ligands de MerTK, spécifique à l'EPR. Gas6 semble inhibiteur, il stimule le clivage de MerTK et inhibe la phagocytose in vitro, et son expression in vivo est faible au moment du pic de phagocytose. Au contraire, Protéine S, dont l'expression augmente in vivo au moment du pic, inhibe le clivage de MerTK et stimule la phagocytose in vitro, et pourrait ainsi potentialiser cette fonction.Parmi les protéases étudiées, l'inhibition d'ADAM17 in vitro engendre une diminution du clivage de MerTK corrélée à une augmentation de sa biodisponibilité à la surface cellulaire et de son activité. Cependant, cet effet n'étant pas total, l'implication d'une autre protéase n'est pas exclue.Ainsi, mes travaux de Doctorat permettent de mieux comprendre la régulation complexe de l'activité de MerTK dans la phagocytose rétinienne, essentielle pour le rythme circadien de cette fonction. / The MerTK receptor is involved in the daily phagocytosis of photoreceptor outer segments (POS) by the retinal pigment epithelium (RPE), an indispensable process for photoreceptors survival and vision. In the retina, the contact between POS and RPE is permanent, and POS phagocytosis occurs once a day, requiring a precise control of this function. The phagocytic peak is initiated by activation of MerTK via the αvβ5 integrin receptor. This project aimed at studying extracellular mechanisms that control MerTK function during POS phagocytosis. We have shown that MerTK can be cleaved from the RPE cell surface in vivo before and just after the phagocytic peak. This process might avoid an excess of POS phagocytosis. We have also shown the opposite role of MerTK ligands, specific to RPE cells. Gas6 appears to act as an inhibitor as it stimulates MerTK cleavage and inhibits POS phagocytosis in vitro. Moreover, in vivo, Gas6 expression is weak at peak phagocytosis time. In contrast, Protein S, which in vivo expression increases at the time of the phagocytic peak, inhibits MerTK cleavage and stimulates POS phagocytosis in vitro, and thus might potentiate phagocytosis. Among the protease candidates we studied, in vitro inhibition of ADAM17 results in decreased MerTK cleavage associated with the increase of full-length receptors available at cell surface and of MerTK activation. However, as cleavage still occurs in these conditions, we cannot exclude the implication of another protease. Taken together, my PhD data allows us to better understand the complex regulation of MerTK activity during retinal phagocytosis, which is essential for the circadian rhythm of this function.

Le gène nucleoredoxin-like 1 (NXNL1), composé de deux exons et d'un intron, code pour RdCVF lorsque l'intron est retenu et RdCVF-long (RdCVFL), une thiorédoxine active, lorsque qu'il est excisé. RdCVFL est une enzyme protégeant les photorécepteurs du stress oxydatif. RdCVF exprimé et sécrété que par les bâtonnets interagit avec son récepteur basigin 1 (BSG1) à la surface des cônes, stimule l'entrée du glucose. Dans la rétinopathie pigmentaire, les bâtonnets dégénèrent progressivement, RdCVF n'est plus exprimé et les cônes meurent. RdCVF tronqué dans le motif thiorédoxine ne possède pas d'activité thiol-oxydoréductase. Les cônes sont les ancêtres des bâtonnets. NXNL1 codait à l'origine pour RdCVFL, et les cônes des mammifères n'expriment donc plus que cette protéine. Chez l'hydre, apparue il y a 600 millions d'années, NXNL ancestral est exprimé. RdCVFL la protège contre les radicaux libres, RdCVF est exprimé, mais n'interagit pas avec basigin, il manque chez l'hydre un des acteurs de la signalisation métabolique de RdCVF. Il y a 400 millions d'années, chez la lamproie, seuls les bâtonnets expriment RdCVF. Son récepteur BSG1 se lie à RdCVF; les acteurs de la signalisation étaient donc présents chez les vertébrés anciens avec des bâtonnets fonctionnels. Le bénéfice pour la vision par l'addition d'une nouvelle fonction de NXNL1 a joué un rôle durant l'évolution de ce système. Une séquence en 3' du premier exon du gène NXNL1 lie la protéine nucléoline impliquée dans l'épissage et exprimée par les bâtonnets mais pas par les cônes. Cette protéine doit réguler l'épissage alternatif du gène NXNL1. / The nucleoredoxin-like 1 gene (NXNL1), which is composed by two exons and one intron, encodes for RdCVF made from an unspliced mRNA and RdCVF-long (RdCVFL), an active thioredoxin, when the intron is excised. RdCVFL is an enzyme that protects photoreceptors against oxidative stress. RdCVF is only expressed and secreted by the rods and interacts with its receptor basigin 1 (BSG1), expressed by cones and stimulates glucose entry. So in retinitis pigmentosa, characterized by progressive rods degeneration, RdCVF is no longer expressed and cones die. RdCVF corresponds to a truncated thioredoxin-like protein with no thiol-oxidoreductase activity. According to the knowledge of retina evolution, the cones are rods ancestors and NXNL1 originally encode for the RdCVFL, and today, mammalian cones only expresses this protein. In hydra that appeared 600 million years ago, ancestral NXNL gene was found, RdCVFL protects it against free radicals attack and RdCVF already existed. But hydra basigin doesn’t interact with RdCVF, so it lacks one of the metabolic signaling actors of RdCVF in hydra. 400 million years ago, In lamprey only rods produce RdCVF. Lamprey BSG1 binds RdCVF; actors signaling were present in oldest vertebrate that present functional rods. This original alternative splicing system has played a role during evolution by adding a new function of NXNL1 gene leading to a benefit in vision. I identified a sequence in 3’ RNA of exon n°1 of NXNL1 gene that binds the nucleolin protein involved in splicing and expressed by the rods but not by the cones. This protein must regulate the NXNL1 alternative splicing.

Avhandling : Zoomorfologi : Göteborg. / Notes bibliogr.

La rétinite pigmentaire est une maladie héréditaire rétinienne menant à la cécité, et pour laquelle il n’existe aucun traitement. La cause la plus fréquente des formes autosomiques dominantes de la maladie est une mutation ponctuelle dans le gène de la rhodopsine (RHO) induisant la mort des photorécepteurs (PR). Pour éviter la dégénérescence des PR, la stratégie thérapeutique doit supprimer l’expression de la protéine mutante tout en restaurant celle de la protéine normale et ce à un niveau physiologique. Mon projet était de réparer le pré-ARNm RHO par la technologie SMaRT (trans-épissage (TE) médié par le splicéosome). Ceci nécessite d’introduire par transfert de gène, dans la cellule cible, un ARN exogène, appelé PTM pour molécule pre-ARNm de TE, pouvant induire un épissage en trans.Nous avons créé 20 PTM différents et obtenu un taux maximal de TE in vitro de 40% après co-transfection transitoire des constructions RHO et PTM dans les cellules HEK293T. Nous avons générés des lignées cellulaires d’expression stable de RHO normale ou mutée par transduction lentivirale. Alors que la RHO normale se localise à la membrane plasmique, la mutation induit la rétention cytoplasmique de la protéine. La transfection du PTM dans la lignée cellulaire de RHO mutée a induit du TE, capable de restaurer partiellement la localisation de la RHO réparée à la membrane.Nous avons alors testé le TE in vivo dans un modèle murin humanisé de rétinite pigmentaire. L’injection sous-rétinienne d’un AAV2/8-bRho-PTM a permis le TE in vivo, mais n’a pas suffi à prévenir la dégénérescence des PR observée par SD-OCT (technologie que nous avons améliorée au cours de ce projet). / Retinitis pigmentosa is an hereditary retinal dystrophy involving degeneration of photoreceptors leading to blindness and for which there is currently no treatment. The most frequent cause of autosomal dominant forms of the disease is a point mutation in the rhodopsin gene (RHO). Therapeutic strategy should both suppress mutant protein expression and restore that of the normal one to physiologic level to prevent photoreceptor degeneration. My PhD project was to repair RHO pre-mRNA by SMaRT (Spliceosome Mediated RNA Trans-splicing) technology. This implies to introduce by gene transfer into the target cell an exogenous RNA, called PTM for Pre-mRNA Trans-splicing Molecule. This one was able to promote a splice reaction in trans, leading to the replacement of the mutated exons. We designed 20 different PTM and obtained in vitro a maximum trans-splicing rate of 40% after transient co-transfection of PTM and RHO constructs in HEK293T cells. We then created WT or mutated RHO stable expression cell lines by lentiviral transduction. Mutation induced retention of the protein into the cytoplasm, while the WT RHO was localized to the plasma membrane. We observed that the PTM transfection in the mutated RHO cell line induced trans-splicing, which was able to partially restore localization to the plasma membrane of repaired RHO. We then tested trans-splicing in vivo in mRho+/- RHO P347S+ mice, a humanized heterozygous mouse model of retinitis pigmentosa. After subretinal injection of AAV2/8-bRho-PTM we observed that trans-splicing occurred in vivo. Unfortunately we did not observe by SD-OCT (a technology that we improve in this project) any rescue of the degenerative phenotype.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Sciences de la Vie et de la Santé : Lille 1 : 2004. / N° d'ordre (Lille 1) : 3411. Résumé en français et en anglais. Article en anglais reproduit dans le texte. Titre provenant de la page de titre du document numérisé. Bibliogr. p. 103-118.