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Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Plusieurs études ont découvert et renforcé l'implication de la dynamique mitochondriale dans le cancer. J'ai découvert un rôle inattendu des protéines kinases de la famille PKD dans la fission mitochondriale. La perte de l'activité PKD a conduit à un blocage de la fission et a entraîné une élongation significative des mitochondries par fusion continue. D'un point de vue mécanique, nous avons montré que les protéines PKD régulent la dynamique mitochondriale en activant le facteur de fission mitochondrial (MFF) par phosphorylation de plusieurs sites. MFF agit comme un récepteur principal de la GTPase DRP1, qui resserre les mitochondries, et il est essentiel à une bonne division mitochondriale. Les trois membres de la famille PKD peuvent phosphoryler MFF. La phosphorylation de MFF est médiée par PKD et la fragmentation mitochondriale se produit pendant la mitose. Comme démontré dans études sur les phosphoprotéomes, la phosphorylation du MFF est augmentée dans les cancers très mitotiques. Ainsi, l'axe de signalisation PKD-MFF régulant la dynamique mitochondriale en mitose pourrait devenir une voie thérapeutique attrayante pour le traitement du cancer. / Over the last two decades, multiple studies have uncovered and strengthen the implication of mitochondrial dynamics in cancer. During my thesis, I discovered an unanticipated role for the PKD kinase family in mitochondrial fission. Loss of PKD activity led to blockade of mitochondrial fission and resulted in a significant elongation of mitochondria by unopposed fusion. Mechanistically, we showed that PKDs regulated mitochondrial dynamics by activating the mitochondrial fission factor (MFF) through phosphorylation of multiple sites. MFF acts as a main receptor for the large GTPase DRP1, which constricts mitochondria, and it is critical for proper mitochondrial division. All three PKD family members could phosphorylate MFF. PKD-mediated MFF phosphorylation and mitochondrial fragmentation occurred specifically during mitosis. As MFF phosphorylation was found to be significantly upregulated in highly mitotic cancers, which was evidenced in several global phosphoproteome studies, the discovered PKD-MFF signaling axis regulating mitochondrial dynamics in mitosis could become an attractive therapeutic avenue for cancer treatment.

Proliferative kidney disease (PKD) poses a high financial burden upon the freshwater salmonid aquaculture industry of Europe and North America. The alternate hosts of the causative agent, Tetracapsuloides bryosalmonae (Myxozoa: Malacosporea), have been identified as freshwater bryozoans (Bryozoa: Phylactolaemata) within which spores capable of infecting salmonid fish develop. Currently, control of PKD relies upon complex management practices, with no licensed prophylaxis or treatment available. Assessment of the nutritional preferences of phylactolaemate bryozoans allowed development of an optimised laboratory culture system. Following laboratory maintenance, bryozoans collected from PKD-endemic sites were found to be infected with the malacosporean parasites T. bryosalmonae and Buddenbrockia plumatellae. Subsequent parasitic development was observed using light-, electron- and confocal-microscopy techniques. Methods of challenging rainbow trout with T. bryosalmonae spores were developed, with the minimum infective dose established. The presence of Thomsen-Friedenreich and Tn epitopes within the parasite was investigated, and experimental vaccine preparations based on either these specificities or T. bryosalmonae-infected bryozoans were efficacy tested in rainbow trout. In addition, salinomycin and amprolium were tested as prospective chemotherapeutants for PKD. Further insights into the development and subsequent release of malacosporean spores within their invertebrate hosts have been revealed. Long-term maintenance of T. bryosalmonae allowed controlled infection of rainbow trout previously vaccinated with experimental preparations. Findings of the project could potentially be utilised in future research into the development of control methods for PKD.

The main aim of the study is the formation and the verification of methodology of Bryozoa cultivation in the laboratory conditions, then the establishing of the optimal method for detection of Myxozoa in the collected samples of Bryozoa, and finally the creation of effective and in practice usable method for eliminating Bryozoa in fish farming facilities. The creation and verification of the methodology of Bryozoa cultivation in the laboratory conditions was not successful. The optimal detection of Myxozoa in the collected samples of Bryozoa was verified by the technique of visual observation of given number of zooids in each sample using a microscope. Three chemicals (Savo Original, Persteril, formaldehyde), commonly used in fishery, were used in different concentrations for a testing elimination of Bryozoa in intensive fish breeding systems. Used preparations caused death of entire colonies of the species Plumatella emarginata at concentration: Savo Original 0,025 %, Persteril 0,00313 % and formaldehyde 0,00625 %; in case of species Cristatella mucedo: Savo Original 0,1 %, Persteril 0,00625 % and formaldehyde 0,0125 %. Obtained results show that formaldehyde is the only tested product that can be used in fish farming because the concentration needed for killing the colony of Bryozoa is lower than the lethal concentration for salmonid fish. Using formaldehyde in the concentration of 1.38 mg/l for the elimination of Bryozoa in a model system with a volume of 1000 m3 costs 37.5 thousand CZK. The cheapest variant is to use preparation Savo Original, but this product can be used only in a system which is temporarily without fish.

Adipocytes are specialized cells found in vertebrates to ensure survival in terms of adaption to food deficit and abundance. However, their dysfunction accounts for the pathophysiology of metabolic diseases such as T2DM. Preliminary data generated by Mona Löffler suggested that PKD1 is involved in adipocyte function. Here, I show that PKD1 expression and activity is linked to lipid metabolism of murine adipocytes. PKD1 gene expression and activity was reduced in murine white adipose tissue upon fasting, a physiological condition which induces lipolysis. Isoproterenol-stimulated lipolysis in adipose tissue and 3T3-L1 adipocytes reduced PKD1 gene expression. Silencing ATGL in adipocytes inhibited isoproterenol-stimulated lipolysis, however, the β-adrenergic stimulation of ATGL-silenced adipocytes lowered PKD1 expression levels as well. Adipose tissue of obese mice exhibited high PKD1 RNA levels but paradoxically lower protein levels of phosphorylated PKD1-Ser916. However, HFD generated a second PKD1 protein product of low molecular weight in mouse adipose tissue. Furthermore, constitutively active PKD1 predominantly displayed nuclear localization in 3T3-L1 adipocytes containing many fat vacuoles. However, adipocytes overexpressing non-functional PKD1 contained fewer lipid droplets and PKD1-KD was distributed in cytoplasm. Most importantly, deficiency of PKD1 in mouse adipose tissue caused expression of genes involved in adaptive thermogenesis such as UCP-1 and thus generated brown-like phenotype adipocytes. Thus, PKD1 is implicated in adipose tissue function and presents an interesting target for therapeutic approaches in the prevention of obesity and associated diseases. / Adipozyten sind spezialisierte Zellen der Wirbeltiere, die das Überleben durch Anpassung an Nahrungsmangel und Nahrungsüberfluss gewährleisten. Eine Dysfunktion von Adipozyten bedingt jedoch die Pathophysiologie von Stoffwechselerkrankungen wie dem T2DM. Vorläufige Ergebnisse von Mona Löfflers Versuchen zeigten, dass PKD1 in der Funktion von Adipozyten involviert ist. Innerhalb dieser Arbeit konnte dargestellt werden, dass die Expression und Aktivität von PKD1 in murinen Adipozyten an den Lipidmetabolismus gekoppelt ist. Beim Hungern von murinem weißen Fettgewebe, einem physiologischen Zustand, der Lipolyse induziert, war die Genexpression von PKD1 reduziert. Isoproterenol-stimulierte Lipolyse führte ebenfalls zu verminderter Expression von PKD1 in murinen weißen Fettgewebe und 3T3-L1 Adipozyten. In ATGL-silenced Adipozyten war die Isoproterenol-stimulierte Lipolyse zwar inhibiert, allerdings wurde die Genexpression von PKD1 durch die β-adrenerge Stimulation ebenfalls vermindert. Fettgewebe von adipösen Mäusen hingegen wiesen hohe PKD1 RNA Level sowie einen niedrigen Proteingehalt der phosphorylierten Form PKD1-Ser916 auf. Fettreiche Ernährung von Mäusen generierte in Fettgewebe jedoch ein weiteres Produkt von PKD1 mit niedrigem Molekulargewicht im Western Blot. Des Weiteren wurde dargestellt, dass konstitutiv aktives PKD1 in 3T3-L1 Adipozyten vorwiegend nuklear lokalisiert war und diese Adipozyten einen hohen Gehalt von Fettvakuolen aufwiesen. Adipozyten, die funktionsloses PKD1 exprimierten, enthielten wenige Lipidtropfen und PKD1-KD war im Cytoplasma verteilt. Vor allem zeigte diese Arbeit, dass die Deletion von PKD1 spezifisch in murinem Fettgewebe die Expression von Genen wie UCP-1 verursachte, die eine Rolle in adaptiver Thermogenese spielen, und dadurch einen brown-like Phänotypen generierte. Zusammenfassend ist PKD1 in die Funktionen von Adipozyten verwickelt und stellt ein attraktives Ziel für therapeutische Ansätze in der Prävention von Übergewicht und damit assoziierten Erkrankungen dar.

Le récepteur ionotropique P2X[indice inférieur 7] (P2X[indice inférieur 7]R) est impliqué dans divers rôles physiologiques tels la prolifération, l'apoptose, la réponse inflammatoire et le trafic membranaire dans plusieurs types cellulaires. Cependant, peu est connu quant aux rôles physiologiques du P2X[indice inférieur 7]R dans les cellules épithéliales intestinales (CEIs). Dans la littérature scientifique, le P2X[indice inférieur 7]R est connu pour activer la protéine kinase Dl (PKD1/PKC[mu]) qui est impliquée dans le transport des protéines membranaires. Comme l'un des rôles physiologiques majeurs des CEIs est le transport et l'absorption du glucose, le transporteur à glucose de type 2 (Glut2) a été ciblé afin d'étudier son transport membranaire suite à l'activation du P2X[indice inférieur 7]R. Glut2 est un élément clé dans le métabolisme du glucose par les CEIs. Une hypothèse stipulant que le P2X[indice inférieur 7]R serait impliqué dans le trafic membranaire de Glut2 par une voie dépendante de la PKD1/PKC[mu] a été émise. Les objectifs majeurs de l'étude étaient de déterminer le profil d'expression du P2X[indice inférieur 7]R selon le stade de différenciation des CEIs, d'élucider les mécanismes moléculaires régulant l'expression du P2X[indice inférieur 7]R, d'étudier la signalisation intracellulaire affectant l'expression membranaire de Glut2 induite par l'activation du P2X[indice inférieur 7]R. D'abord, le profil d'expression du P2X[indice inférieur 7]R en fonction de la différenciation des CEIs a été déterminé par immunofluorescence indirecte sur des sections de jéjunum de souris normales et par immunobuvardage de type western sur des lysats de cellules Caco-2/15 prolifératives et différenciées. Ensuite, la signalisation induite par l'activation du P2X[indice inférieur 7]R a été étudiée en stimulant des cellules IEC-6 avec de l'ATP ou du BzATP, deux agonistes du P2X[indice inférieur 7]R, et en prétraitant les cellules avec de l'oATP, un antagoniste du P2X[indice inférieur 7]R. Différents inhibiteurs pharmacologiques tels le UO126 (MEK1/2) et la rottlerine (PKC[delta]) ont été utilisés pour déterminer l'ordre des protéines dans les voies de signalisation. Également, différents chélateurs de calcium, comme le BAPTA-AM et l'EGTA, ont été utilisés pour étudier la dépendance des voies trouvées au calcium. L'expression de Glut2 à la membrane plasmique suite à la stimulation du P2X[indice inférieur 7]R a été étudiée par immunofluorescence indirecte et par biotinylation des protéines membranaires de surface. Finalement, la régulation transcriptionnelle du P2X[indice inférieur 7]R dans les cellules HEK 293T et Caco-2/15 a été étudiée par des essais luciférase qui permettent de visualiser l'interaction entre le promoteur du P2X[indice inférieur 7]R et des facteurs de transcription cibles comme Cdx-2, GATA-4, HNF-4[alpha], C/EBP[alpha] et C/EBP[bêta]. Les résultats obtenus démontrent que l'expression du P2X[indice inférieur 7]R augmente en fonction de l'état de différenciation des cellules Caco-2/15, ce qui coïncide avec sa localisation dans les deux tiers supérieurs de la villosité de jéjunum de souris normales. Aussi, l'activation du P2X[indice inférieur 7]R amène une augmentation de la phosphorylation des protéines PKD1/PKC[mu], PKC[delta], ERK1/2, MEK1/2, SAPK/JNK, p90RSK et CREB. Également, la PKC[delta] est en amont des protéines MEK1/2 et ERK1/2 qui elles-mêmes sont en amont de la PKD1/PKC[mu]. Cette voie PKC[delta]/MEK/ERK/PKD est également indépendante du calcium extracellulaire et intracellulaire. Aussi, il y a internalisation et diminution de l'expression membranaire de Glut2 suite à l'activation du P2X[indice inférieur 7]R par le BzATP. Finalement, le P2X[indice inférieur 7]R est régulé au niveau transcriptionnel par les facteurs de transcription HNF-4[alpha], C/EBP[alpha] et C/EBP[bêta] mais pas par Cdx-2 et GATA-4. En résumé, les résultats démontrent que le P2X[indice inférieur 7]R est impliqué dans l'internalisation et la diminution de l'expression membranaire de Glut2 par un mécanisme qui semble dépendant de la voie PKC[delta]/MEK/ERK/PKD calcium-indépendante.

Des altérations de la signalisation en aval du récepteur à l’antigène (BCR) jouent un rôle clé dans la physiopathologie de la Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC). Notre laboratoire a montré qu’une stimulation antigénique ex-vivo des cellules B-LLC conduit à une survie et une migration cellulaires différentielles qui distingue deux groupes de patients. Sur la base de ces résultats, nous avons montré que l’avantage de survie cellulaire en réponse à une stimulation antigénique observé dans un groupe est dépendant 1) d’un seuil imposé par les niveaux d’expression des effecteurs précoces (BCR, Syk et Zap70), de la capacité des cellules leucémiques à répondre en termes de phosphorylation de Syk, d’activation de la PLCƳ2, de mobilisation calcique et d’activation du facteur de transcription NFAT2 ; l’activation de la voie BCR/NFAT mesurée par la survie des cellules B-LLC ex-vivo étant corrélée à la survie globale des patients ; 2) de l’augmentation des niveaux de phosphorylation globale et spécifique de Syk, de la distribution subcellulaire de phospho-Syk, de la capacité de Syk à interagir avec des effecteurs positifs et négatifs et à les activer. De plus, notre étude sur la diminution de la migration des cellules B de LLC en réponse à une stimulation du BCR montre qu’elle dépend du taux d’internalisation du CXCR4 qui est régulé par l’activation des PI3Ks situées en amont des PKDs ; ces dernières activées phosphorylent le CXCR4 qui est alors internalisé. L’ensemble de ces données nous a permis de mieux définir les mécanismes moléculaires sous-jacents à une survie accrue et à une migration diminuée des cellules BLLC en réponse à une stimulation antigénique, de mettre en évidence d’éventuels biomarqueurs fonctionnels de stratification (pSyk et pPLCƳ2), de pointer de potentielles cibles thérapeutiques (NFATs et PKDs) et d’expliquer en partie l’action de drogues, comme le Fostamatinib et l’Idelalisib, utilisées en thérapie dans la LLC. / Altered B-cell antigen receptor (BCR) signaling pathways play a key role in chronic lymphocytic leukemia(CLL) pathophysiology. Our lab has previously shown that ex-vivo antigenic stimulation of CLL-B cells led todifferential cell survival and cell migration, which allowed the distinction between two groups of patients. Basedon these results, we evidenced that the cell survival advantage in response to BCR engagement from one groupdepends on 1) a critical threshold mediated by the early effector expression levels (BCR, Syk et Zap70), a BCR competency of the leukemic cells translated by Syk phosphorylation, PLCƳ2 activation, intracellular Ca2+mobilization and the transcription factor NFAT2 activation; this activated BCR/NFAT signaling cascade, which is reflected by the ex-vivo measurement of CLL cell survival, was correlated to the overall survival from CLLpatients; 2) increased levels of global and specific Syk phosphorylation, phospho-Syk subcellular distribution, Sykability to interact with positive and negative effectors and to activate them. Moreover, study of BCR stimulation mediated decreased migration in CLL B cells showed that it relied on CXCR4 internalization levels that were regulated by activated PI3Ks acting upstream of the PKDs; activation of the latters allowed CXCR4 phosphorylation and then its endocytosis. Altogether, these data allowed us to better understand the molecular mechanisms underlying the survival advantage and the decreased migration of CLL B cells in response to antigenic stimulation, to evidence eventual functional biomarkers of stratification (pSyk and pPLCƳ2), to point out potential therapeutic targets (NFATs and PKDs), and to partially explain how Fostamatinib and Idelalisib function as therapeutic drugs in CLL.

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