Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2007.

Thesis (Ph. D.)--University of Canterbury, 2006. / Typescript (photocopy). Includes bibliographical references (leaves 109-118). Also available via the World Wide Web.

Thesis (MSc (Genetics))--University of Stellenbosch, 2010. / Includes bibliography. / Title page: Dept. of Genetics, Faculty of Science. / ENGLISH ABSTRACT: Undeniably, changes in the environment and dwindling traditional energy resources have resulted in the search for viable, renewable energy alternatives such as biofuels. Cellulose is one of the most abundant polymers on earth and can be converted to simple sugars and fermented to ethanol biofuel fairly easily. Cellulose rich biomass that can serve to supply ethanol biofuel production can be sourced from unexploited agricultural waste. The main drawback to using vegetative tissue as opposed to harvested food stocks from crops results from the structural properties of plant cell walls. Although cellulose is abundant, the contaminating hemicellulose and lignin fibres within the cell wall matrix have a negative impact on the digestibility of the cellulose present. Thus, an important step in creating an effective biofuel production system from agricultural excess is developing crops with improved cell wall polymer characteristics that can be converted to ethanol more efficiently. This project consisted of two parts. Firstly, the aim was to assess lignin production in transgenic sugarcane transformed with a construct aimed at down-regulating the 4- (hydroxyl) cinnamoyl CoA ligase (4CL) gene in the lignin biosynthesis pathway. The second part of the project revolved around discovering the mechanism of impared cell growth caused by expressing the gene encoding cellulose synthase from a marine invertebrate, Ciona savignyi, in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Several sugarcane lines that had been previously transformed with a hairpin RNAi construct aimed at down-regulating the 4CL gene in the monolignol biosynthesis pathway were subjected to analysis to determine if lignification had been reduced. Although the presence of the hairpin construct in the genomic DNA had been confirmed for all of the transgenic lines, there was no significant decrease in the lignin levels in any of the transgenic lines. PCR analysis of the mRNA and enzyme assays also confirmed that the 4CL gene was still being expressed. Ongoing work will determine the cause of the unsuccessful down-regulation. Previously, it had been proven that the cellulose synthase gene from C. savignyi could be functionally expressed in S. cerevisiae. However, cellulose production resulted in extremely retarded growth of colonies and cultures, to the point of the apparent death of the cultures. The aim of this part of the project was to determine the mechanism (either metabolic or physical) that causes this effect. To generate enough cell mass to perform metabolic analysis, several strategies to impede cellulose production in transgenic yeast were explored. Attempts to stop cellulose production and induce better growth by introducing Isoxaben (a traditional weed killer that targets cellulose synthases) into the growth medium used for the transgenic yeast proved unsuccessful. To control the expression of the transgene, it was attempted to clone the cellulose synthase gene into an expression system containing an inducible promoter. The cloning exercise proved extremely difficult and multiple attempts with several strategies proved unsuccessful. This process is still ongoing as the growth retarding process induced by cellulose production in yeast remains to be identified. / AFRIKAAANSE OPSOMMING: Dit is onontkenbaar dat veranderinge in die omgewing en minderwordende tradisionele energiebronne veroorsaak dat lewensvatbare en hernubare energiebronne soos biobrandstof gevind moet word. Sellulose is een van die mees volop polimere op aarde en kan redelik maklik omgeskakel word na eenvoudige suikers en gefermenteer word tot etanol-biobrandstof. Sellulose-ryk biomassa wat etanol-biobrandstof kan verskaf, kan herwin word van tot op hede ongebruikte landbou-afval. Die komplekse struktuur van plantselwande is die hoofstruikelblok in die omskakeling van vegetatiewe weefsel tot biobrandstof. Hoewel sellulose volop is, het die kontaminerende hemisellulose- en lignienvesels binne die selwand-matriks ’n negatiewe impak op die verteerbaarheid van die sellulose teenwoordig in die selwand. Daarom is ’n belangrike stap in die ontwikkeling van effektiewe biobrandstof-produksiesisteme vanaf landbou-afval om gewasse te ontwikkel met verbeterde selwandpolimeer-eienskappe wat etanol-produksie kan vergemakilik. Hierdie projek het bestaan uit twee dele. Eerstens was die doel om vas te stel of die lignienproduksie geaffekteer is in transgeniese suikerriet getransformeer met ’n konstruk wat mik om die 4-(hidroksie)-cinnamoyl CoA ligase (4CL) geen te af-reguleer in die lignienbiosintese- padweg. Die tweede deel van die projek het daarop gefokus om die meganisme te ondek wat die belemmerde selgroei veroorsaak, as gevolg van die uitdrukking van die geen wat kodeer vir sellulose-sintase in ’n mariene ongewerwelde, Ciona savignyi, in Saccharomyces cerevisiae. Verskeie suikerriet-lyne, wat voorheen getransformeer is met ’n haarnaald-RNAi-konstruk om die 4CL-geen te af-reguleer in die monolignol-biosintese-padweg, is onderwerp aan analise om vas te stel of lignifikasie verminder is. Hoewel die teenwoordigheid van die haarnaald-konstruk in die genomiese DNA bevestig is vir al die transgeniese lyne, was daar geen beduidende vermindering in die lignienvlakke in die transgeniese lyne nie. PKRanalise van die mRNA en ensiem-aktiwiteitstoetse het ook bevestig dat die 4CL-geen steeds uitgedruk word. Verdere ondersoek sal kan vasstel wat die oorsaak van die onsuksesvolle af-regulering is. Voorheen is bewys dat die sellulose-sintase-geen van C. savignyi funksioneel uitgedruk kon word in Saccharomyces cerevisiae. Egter, selluloseproduksie het die gevolg gehad dat groei in die transgeniese kolonies en kulture erg gestrem is, tot die punt dat die kulture dood voorgekom het. Die doel van hierdie deel van die projek was om vas te stel wat die meganisme (òf metabolies òf fisies) is wat hierdie verskynsel veroorsaak het. Om genoeg selmassa te genereer om metaboliese analise uit te voer, is verskeie strategieë om selluloseproduksie in transgeniese gis te verhinder, ondersoek. Pogings om selluloseproduksie te stop en om groei te verbeter deur Isoxaben by te voeg in die groeimedium gebruik vir transgeniese gis, was onsuksesvol. Isoxaben is ’n tradisionele onkruiddoder wat sellulose-sintases teiken en inhibeer. Om die uitdrukking van die transgeen te beheer, is ’n poging aangewend om dié sellulose-sintase-geen in ’n uitdrukking-sisteem te kloon met ’n induseerbare promotor. Die kloneringsoefening was uiters moeilik en veelvoudige pogings met verskeie strategieë was onsuksesvol. Hierdie proses moet verder gevoer word aangesien die groeistremmingsmeganisme veroorsaak deur selluloseproduksie in gis nog geïdentifiseer moet word.

Os estudos da biotransformação têm-se mostrado um método eficiente para reações que envolvam a obtenção de compostos com interesse comercial. Dentre estes produtos utilizados podemos destacar monoterpenos por constituírem uma variedade de compostos com grande aplicação tanto no âmbito farmacêutico, como em perfumes, cosméticos e alimentos. As suspensões de células vegetais e os fungos filamentosos têm sido largamente usados em reações de biotransformação destes metabólitos secundários como substratos exógenos. A habilidade das culturas celulares e fungos em transformar tais compostos vêm sendo dirigidos principalmente para a obtenção de derivados oxigenados de maior valor agregado, principalmente visando à produção de flavorizantes, aromatizantes e fragrâncias. As suspensões de células vegetais apresentam sistemas enzimáticos mais complexos, podendo levar a produtos específicos, enquanto os microrganismos, por serem mais simples e de crescimento mais rápido, geralmente promovem mais rapidamente a metabolização dos substratos.Neste contexto, o presente trabalho descreve a investigação do potencial de bioconversão dos monoterpenos (R)-(+)-α-pineno, (S)-(-)-α-pineno e (S)-(-)-β- pineno, bem como do óleo de terebentina, para avaliação de suas potencialidades frente a reações de biotransformação mediadas pelos microrganismos Cunninghamella echinulata ATCC 9245, Mortierella isabellina NRRL 1757 e Cunninghamella elegans ATCC 36112 e por suspensões de células vegetais de Catharanthus roseus. Todos os sistemas estudados mostraram habilidade na bioconversão dos substratos testados. / Biotransformation has been an efficient method to obtain important commercial compounds such as monoterpenes, that have a range of applications in the pharmaceutical, perfumery, cosmetics and food industries. Plant cell cultures and filamentous fungi suspensions have been widely used in biotransformation reactions of monoterpenes as exogenous substrates. The ability of the cells and fungi cultures to transform these compounds has being mainly used for the synthesis of oxygenated derivatives aiming at the production of flavours and fragrances. The plant cell cultures suspensions have complex enzymatic systems with the production of specific compounds, where as filamentous fungi, which are structurally simpler and fast growing, can promote quicker transformations reactions. In this context, the present work describes the evaluation of bioconversion of the monoterpenes (R)-(+)-α-pinene, (S)-(-)-α-pinene, (S)-(-)-β-pinene, as well as turpentine oil using the filamentous fungi suspensions of Cunninghamella echinulata ATCC 9245, Cunninghamella elegans ATCC 36112 and Mortierella isabellina NRRL 1757, aswer as Catharanthus roseus plant cell cultures. All evaluated systems were capable of bioconverting the studied substrates. The main product obtained from pinenes and turpentine oil was α-terpineol.

The basis of this study are mutant plants with ARP2/3 complex lacking in one of its subunits (arpc5 and arp2). These plants also express CSC subunit CESA6 of primary cell wall tagged by YFP. Thanks to modern imaging technologies, it is possible to observe the movement of tagged cellulose synthase complexes in vivo at plasmatic membrane. Kymograph analyses was used to measure the velocity of CESA complexes. In addition to observing CESA complexes directly on the plasma membrane, experiments were made to regenerate cell walls of protoplasts of Arabidopsis thaliana plants arpc5 and WT. It was found, that observed mutants arpc5 and arp2 have reduced velocity of CESA complexes in comparison to WT and arpc5 protoplasts regenerate cellulose mesh of cell wall slower. Keywords: Cellulose synthesis, ARP2/3 complex, CESA, CSC velocity, arpc5, arp2, Arabidopsis thaliana.

Os estudos da biotransformação têm-se mostrado um método eficiente para reações que envolvam a obtenção de compostos com interesse comercial. Dentre estes produtos utilizados podemos destacar monoterpenos por constituírem uma variedade de compostos com grande aplicação tanto no âmbito farmacêutico, como em perfumes, cosméticos e alimentos. As suspensões de células vegetais e os fungos filamentosos têm sido largamente usados em reações de biotransformação destes metabólitos secundários como substratos exógenos. A habilidade das culturas celulares e fungos em transformar tais compostos vêm sendo dirigidos principalmente para a obtenção de derivados oxigenados de maior valor agregado, principalmente visando à produção de flavorizantes, aromatizantes e fragrâncias. As suspensões de células vegetais apresentam sistemas enzimáticos mais complexos, podendo levar a produtos específicos, enquanto os microrganismos, por serem mais simples e de crescimento mais rápido, geralmente promovem mais rapidamente a metabolização dos substratos.Neste contexto, o presente trabalho descreve a investigação do potencial de bioconversão dos monoterpenos (R)-(+)-α-pineno, (S)-(-)-α-pineno e (S)-(-)-β- pineno, bem como do óleo de terebentina, para avaliação de suas potencialidades frente a reações de biotransformação mediadas pelos microrganismos Cunninghamella echinulata ATCC 9245, Mortierella isabellina NRRL 1757 e Cunninghamella elegans ATCC 36112 e por suspensões de células vegetais de Catharanthus roseus. Todos os sistemas estudados mostraram habilidade na bioconversão dos substratos testados. / Biotransformation has been an efficient method to obtain important commercial compounds such as monoterpenes, that have a range of applications in the pharmaceutical, perfumery, cosmetics and food industries. Plant cell cultures and filamentous fungi suspensions have been widely used in biotransformation reactions of monoterpenes as exogenous substrates. The ability of the cells and fungi cultures to transform these compounds has being mainly used for the synthesis of oxygenated derivatives aiming at the production of flavours and fragrances. The plant cell cultures suspensions have complex enzymatic systems with the production of specific compounds, where as filamentous fungi, which are structurally simpler and fast growing, can promote quicker transformations reactions. In this context, the present work describes the evaluation of bioconversion of the monoterpenes (R)-(+)-α-pinene, (S)-(-)-α-pinene, (S)-(-)-β-pinene, as well as turpentine oil using the filamentous fungi suspensions of Cunninghamella echinulata ATCC 9245, Cunninghamella elegans ATCC 36112 and Mortierella isabellina NRRL 1757, aswer as Catharanthus roseus plant cell cultures. All evaluated systems were capable of bioconverting the studied substrates. The main product obtained from pinenes and turpentine oil was α-terpineol.

Os estudos da biotransformação têm-se mostrado um método eficiente para reações que envolvam a obtenção de compostos com interesse comercial. Dentre estes produtos utilizados podemos destacar monoterpenos por constituírem uma variedade de compostos com grande aplicação tanto no âmbito farmacêutico, como em perfumes, cosméticos e alimentos. As suspensões de células vegetais e os fungos filamentosos têm sido largamente usados em reações de biotransformação destes metabólitos secundários como substratos exógenos. A habilidade das culturas celulares e fungos em transformar tais compostos vêm sendo dirigidos principalmente para a obtenção de derivados oxigenados de maior valor agregado, principalmente visando à produção de flavorizantes, aromatizantes e fragrâncias. As suspensões de células vegetais apresentam sistemas enzimáticos mais complexos, podendo levar a produtos específicos, enquanto os microrganismos, por serem mais simples e de crescimento mais rápido, geralmente promovem mais rapidamente a metabolização dos substratos.Neste contexto, o presente trabalho descreve a investigação do potencial de bioconversão dos monoterpenos (R)-(+)-α-pineno, (S)-(-)-α-pineno e (S)-(-)-β- pineno, bem como do óleo de terebentina, para avaliação de suas potencialidades frente a reações de biotransformação mediadas pelos microrganismos Cunninghamella echinulata ATCC 9245, Mortierella isabellina NRRL 1757 e Cunninghamella elegans ATCC 36112 e por suspensões de células vegetais de Catharanthus roseus. Todos os sistemas estudados mostraram habilidade na bioconversão dos substratos testados. / Biotransformation has been an efficient method to obtain important commercial compounds such as monoterpenes, that have a range of applications in the pharmaceutical, perfumery, cosmetics and food industries. Plant cell cultures and filamentous fungi suspensions have been widely used in biotransformation reactions of monoterpenes as exogenous substrates. The ability of the cells and fungi cultures to transform these compounds has being mainly used for the synthesis of oxygenated derivatives aiming at the production of flavours and fragrances. The plant cell cultures suspensions have complex enzymatic systems with the production of specific compounds, where as filamentous fungi, which are structurally simpler and fast growing, can promote quicker transformations reactions. In this context, the present work describes the evaluation of bioconversion of the monoterpenes (R)-(+)-α-pinene, (S)-(-)-α-pinene, (S)-(-)-β-pinene, as well as turpentine oil using the filamentous fungi suspensions of Cunninghamella echinulata ATCC 9245, Cunninghamella elegans ATCC 36112 and Mortierella isabellina NRRL 1757, aswer as Catharanthus roseus plant cell cultures. All evaluated systems were capable of bioconverting the studied substrates. The main product obtained from pinenes and turpentine oil was α-terpineol.

Orientador: Claudia Regina Baptista Haddad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T00:53:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_MariaCristinadaCosta_M.pdf: 561166 bytes, checksum: 57a597ae699902d2f7063c9a77a30325 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O excesso de sais no solo afetao metabolismo geral da planta, causando alterações fisiológicas e morfológicas. Visando avaliar os efeitos do sal no crescimento e metabolismo sob estresse salino, foram comparadas as respostas de Vigna luteola (halófita) e Vigna unguiculata (sensível). As plantas foram cultivadas na presença de NaCl nas concentrações de: 100mM, 250mM e 500mM. V. unguiculata apresentou reduções significativas de massas fresca e seca, área foliar e número de folhas sob salinidade. Estes parâmetros não foram afetados em V. luteola. Há dados na literatura que mostram que plantas adaptadas à salinidade apresentam a razão raiz/parte aérea maior que plantas sensíveis. Contudo, este aumento foi evidenciado na espécie mais sensível ao sal, sob salinidade, mantendo-se constante em V. luteola. O aumento de suculência, que é considerado uma adaptação ao estresse salino, não foi verificado em nenhuma das espécies estudadas. A resistência ao estresse salino tem sido relacionada com a atividade de enzimas antioxidantes, que removem espécies ativas de oxigênio. O aumento da atividade de peroxidases totais foi observado apenas em V. luteola, associado ao estresse salino. Sob estresse salino, ocorreu o aumento da atividade de siringaldazina oxidase somente em V. unguiculata. Não foi observada relação entre crescimento de raízes e atividade desta enzima, pois nesta espécie a salinidade provocou maior crescimento da raiz. A atividade de peroxidases totais em Vigna luteola está localizada na epiderme, córtex e cilindro central e, em V. unguiculata na epiderme e cilindro central. Sob estresse salino, a atividade foi mais intensa nas duas espécies. Em V. luteola foi observada em toda raiz, em V. unguiculata, além da epiderme e do cilindro central, foi possível observa-la em porções do córtex. A respeito da localização da enzima siringaldazina oxidase, em V. unguiculata restringiu-se à epiderme, expandindo - se para o córtex e cilindro central sob estresse salino. Já em V. luteola estava presente em todas as regiões da raiz, intensificando - se com a aplicação de NaCl no meio de cultivo. A alteração da permeabilidade das membranas é um dos resultados da salinidade, que está relacionado ao aumento do teor de espécies ativas de oxigênio. Foi observado aumento de liberação de eletrólitos em ambas as espécies de Vigna. Entretanto, em V. unguiculata, o acréscimo neste parâmetro foi altamente significativo na presença de NaCl e com resultados sempre maiores aos mesmos tratamentos de V. luteola. A manutenção da razão Na+/K+ nas células é um fator relevante para a tolerância à salinidade. O acúmulo de Na+ foi observado em raízes e folhas das duas espécies de Vigna. Em raízes, obteve-se valores maiores em V. luteola, em decorrência a alta concentração de Na+ neste órgão. Em folhas, a maior razão Na+/K+ foi obtida em V. unguiculata. As análises de parâmetros bioquímicos sob estresse salino, indicaram que não houve variação no teor de proteínas (folhas), sacarose (folhas) e açúcares solúveis totais (raiz e folhas) em Vigna luteola. Sob salinidade, o teor de proteínas foi reduzido em folhas de V. unguiculata. Já as concentrações de açúcares solúveis totais (raízes e folhas), sacarose (folhas) e malondialdeído (raiz) ficaram inalterados. Mediante salinidade, não ocorreram alterações significativas nos parâmetros bioquímicos em V. luteola, o que permitiu seu crescimento e desenvolvimento normal. As mudanças de indicadores bioquímicos e ausência de resposta antioxidante em V. unguiculata sob salinidade, podem estar relacionadas com o comprometimento do seu crescimento sob estresse salino / Abstract: The excess of salt in the soil affects all the general metabolism of the plant causing physiologic and morphologic alterations. With the objective of evaluating the effects of salt in the growth and metabolism under saline stress, this study compares the responses of two Vigna species, with distinct sensitivity to salt, cultivated with the presence of NaCl in the following concentrations: 100mM, 250mM e 500mM. V. unguiculata presented significant reductions in fresh and dry mass, leaf area and number of leaves when subjected to salinity. However, these parameters were not affected in V. luteola. There is data in the literature which shows that plants that have adapted to salinity present the root/shoot ratio higher than sensitive plants. On the other hand, this increase was evidenced in the species which is most sensitive to salt, under salinity, keeping itself constant in V. luteola. The increase in juiciness, which is considered an adaptation to saline stress, was not present in either of the species studied. The resistance to saline stress has been associated to the activity of antioxidant enzymes, which remove reactive oxygen species. The increase in activity of total peroxidases was observed only in V. luteola. Under saline stress, only V. unguiculata presented an increase in siringaldazine oxidase activity. There was no evidence of relation between the growth of roots and the presence of this enzyme, since this species presented larger root growth due to salinity. The histochemical location of total peroxidases activity indicated that the distribution of the activity of these enzymes is similar in both species of Vigna (epidermis, cortex and central cylinder), however, there is stronger activity in V. luteola, especially under stress. In relation to the location of the seringaldazine oxidase enzyme, in V. unguiculatat was restricted to the epidermis, expanding to the cortex and central cylinder under saline stress. In V. luteola it was present in all parts of the root, intensifying when NaCl was applied during cultivation. The change in the membrane permeability is one of the results of salinity which is connected to the increase of reactive oxygen species concentration. An increase in eletrolites release was noticed in both Vigna species. Meanwhile, in V. unguiculata, the rise in this parameter was highly significative in the presence of NaCl and with results constantly higher than the results of the same treatments in V. luteola. The maintenance of the Na+/K+ ratio in the cells is a relevant factor to the tolerance of salinity. Na+ accumulation was observed in both Vigna species¿ roots and leaves. In roots, higher values were obtained in V. luteola, due to the higher Na+ concentration in this organ. In leaves, the highest Na+/K+ ratio change was obtained in V. unguiculata. The analysis of biochemical parameters under saline stress, show that there was no change in protein content (leaves), sucrose (leaves) and total soluble sugars (root and leaves) in Vigna luteola. Protein content was reduced in V. unguiculata leaves, while concentrations of total soluble sugars (root and leaves), sucrose (leaves) e malondialdeid (root) remained the same. Under salinity, there were no significant changes in the biochemical parameters of V. luteola, which allowed for its normal growth and development. The changes in biochemical indicators and lack of antioxidant response in V. unguiculata under salinity may be connected to its growth and development compromise under saline stress / Mestrado / Mestre em Biologia Vegetal

Orientador: Paulo Mazzafera / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T23:52:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Purcino_RubiaPadilha_D.pdf: 1224493 bytes, checksum: 875e464b9ac37fd8cf61d27335a57537 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Xylella fastidiosa (Xf) é uma bactéria fitopatogênica que se desenvolve exclusivamente no xilema de uma grande variedade de plantas cultivadas. Na cultura do citros essa bactéria é conhecida como o agente causal da clorose variega do citros (CVC), doença responsável por prejuízos econômicos consideráveis, desde a década de 80. Embora muitos trabalhos tenham sido realizados com essa bactéria, pouco se conhece sobre o mecanismo de infecção, a composição do meio em que ela se desenvolve, o xilema e o desenvolvimento dos sintomas. Grande parte dos estudos sobre a nutrição da bactéria são realizados in vitro, o que pode não caracterizar a interação entre a bactéria e xilema. Este trabalho é resultado de um subprojeto do genoma funcional, cujo principal objetivo é a caracterização da constituição da seiva do xilema, na tentativa de melhor compreender a nutrição da bactéria e o desenvolvimento da doença. Ao longo da realização dos experimentos e análises dos resultados foram surgindo questões que levaram a necessidade do melhor entendimento do metabolismo do nitrogênio em plantas com CVC. Por isso os resultados gerados foram agrupados em dois capítulos, onde no primeiro são encontrados resultados da caracterização qualitativa e quantitativa das principais substâncias nitrogenadas presentes na seiva do xilema de plantas de citros com CVC, bem como atividade das principais enzimas envolvidas no metabolismo do nitrogênio. A atividade da Redutase do nitrato (RN) nas folhas não sofreu alteração em plantas doentes (PD), porém a atividade da Glutamina Sintetase (GS) foi significativamente maior nos extratos das folhas dessas plantas. Embora a concentração de aminoácidos tenha sido suavemente maior na seiva do xilema de PD, caiu drasticamente no extrato de folhas dessas plantas. O teor de proteínas solúveis também foi menor na seiva do xilema e no extrato de folhas de PD. PD e Planta Sadia (PS) apresentaram o mesmo perfil de aminoácidos em HPLC, contudo em proporções bem diferentes, principalmente dos aminoácidos ASN, GLN e ARG. A poliamina putrescina foi identificada em grande concentração somente em PD. Estes resultados demonstram que PD apresentam alterações no metabolismo de compostos nitrogenados provavelmente em resposta a mudanças na interação dos processos de absorção, assimilação e redistribuirão do nitrogênio. No segundo capítulo são agrupados os dados das análises do metabolismo de açúcares, ácidos orgânicos e investigação das alterações no metabolismo da parede celular. A seiva de PD apresenta menor concentração de glicose, acompanhada de frutose e glicose. Grande quantidade de ácido cítrico também foi determinada nessas plantas. Baseados nesses resultados cultivamos a bactéria em meios com diferentes fontes de carbono e verificamos que o meios que permitiram maior crescimento foram aqueles que a fonte de carbono utilizada foi glicose (I glL), sacarose combinada com citrato nas concentrações de 3g/L de cada fonte de cardono, e citrato na concentração de 3 g/L, o que demonstra que a composição química da seiva do xilema é importante tanto para o processo de agregação como para a formação do biofilme. A infecção com Xi também promoveu modificações nas paredes celulares dos pecíolos. Verificamos por imunocitoquímica em microscópio confocal utilizando os anticorpos 11M 5 e JIM 7, diferenças entre PD e PS nos padrões de esterificação da fração pectina, assim como encontramos no fracionamento da parede celular alterações na composição dos principais carboidratos que constituem a fração hemicelulose / Abstract: Xylellafastidiosa (Xj) is a fastidious bacterium which grows exclusively in the xylem of several plants. In citrus the disease caused by Xf is known as "clorose variegada do citros" (CVC), being responsible for marked loss of productivity since the 80s. Although a meaningful number of reports have been published in the literature about Xf, little is know about the mechanisms controlling infection, the biochemical composition of the xylem fluid where the bacteria develops and how the disease symptoms develop. Most of the studies on the nutritional requirements by the bacteria were carried out with artificial media in vitro, what may not be the exact situation in the xylem. The aim of this thesis was to characterize the xylem sap composition of citrus plants in order to better understand nutritional aspects of the bacteria and this can influence the disease development. During the experiments new questions arose and focus was given to the nitrogen metabolism of citrus plants infected with Cvc. Therefore, the thesis has two chapters. The first chapter contains results on the qualitative and quantitative characterization of the xylem sap of health and diseased plants as well as the activity of enzymes ofthe nitrogen metabolism in plants. The activity ofNitrate reductase (NR) in leaves did not change in diseased plant (PD), however, the activity of Glutamine synthethase (GS) was significantly higher in these leaves. Although amino acids concentration was slightly higher in the sap of diseased plants the leveI dropped drastically in the leaves. The protein contents were lower in the sap and in leaves of diseased plants. Diseased and health plants showed the same amino acid profile in HPLC, but different proportions were observed among amino acids, mainly for the amino acids ASN, GLN and ARG. The polyamine putrescine was found in high concentrations only in diseased plants. These results showed that significant changes take place in the nitrogen metabolism of diseased plants, probably as a response to the alterations in the absorption, assimilation and distribution of nitrogen in the plant. In the second chapter the data on carbohydrates, organic acids and cell wall are presented. The xylem sap of diseased plants showed lower concentration of glucose than health plants. High amounts of citric acid were also found in diseased plants. This information was used to design artificial media to grow the bacteria and study its nutritional need. Best growth was observed with media containing glucose (l g/L), sucrose plus citrate both at 3g/L, and citrate alone at 3 g/L, indicating that the composition of the sap might play a role both in the bacterial agregation as well as in the biofilm formation. Infection with XI also promoted changes in the cell wall of leaf peduncle of infected plants. Immunocytochemical analysis with confocal microscopy, using the antibodies 11M 5 and 11M 7, showed marked differences between diseased and health plants regarding the pectin esterification. Additionally the hemicelullose fraction was also affected. / Doutorado / Biologia Vegetal / Doutor em Biologia Vegetal

Orientadores: Marcos Antonio Machado, Alexandre Morais do Amaral / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T05:44:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Baptista_JulianaCristina_M.pdf: 1606790 bytes, checksum: 2559d8ff6d67422a6685a6a8d5a31cd6 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), e responsável por consideráveis prejuízos para a produção de laranja, no Brasil e no mundo. A doença e altamente agressiva para a planta de citros, provocando, entre outros, lesões em folhas e frutos, com redução tanto na qualidade de frutos quanto na produtividade. Devido a sua importância, recentemente a bactéria teve seu genoma completamente seqüenciado, onde foram identificados, por homologia de seqüência de proteínas, varias ORFs ("open reading frames") associadas ao processo de infecção. Dentre elas, varias seqüências que teoricamente codificam para proteínas envolvidas na degradação da parede celular vegetal, o que pode ser um indicativo de que a bactéria utiliza mecanismos relacionados a este evento durante o seu processo infeccioso e de adaptação. Entretanto, não ha ate o momento informação experimental a respeito da funcionalidade de seqüências em Xac que permitam a degradação da parede celular. O objetivo principal deste trabalho foi identificar funcionalmente, em Xac, através de ensaios in Vectra e in vitro, genes envolvidos na produção ou transporte de proteínas relacionadas a degradação de celulose e com isso analisar a sua relevância na capacidade infectiva ou adaptativa da bactéria. Para tal, foram produzidos mutantes a partir de inserções aleatórias de transposon e sitio-dirigidas, estabelecendo-se uma coleção de linhagens, cujo fenótipo e genótipo foram avaliados por ensaios biológicos e sequenciamento. Verificou-se que o operon xps do sistema de secreção do tipo II e funcional em Xac e que os genes XAC0028, XAC0029, XAC2374, XAC3516 e XAC4231 participam da degradação de celulose / Abstract: The citrus canker, caused by the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), is responsible for considerable losses for the orange production, in Brazil and abroad. The disease is highly aggressive for citrus plants, resulting, among others, in injuries on leaves and fruits, with a reduction in the quality of fruits as much as in the productivity. Due to its importance, recently the bacterium had its genome completely sequenced and a number of open reading frames (ORFs) where identified by homology with protein sequences and annotated as associated to the infection process. Amongst them, some sequences that theoretically code for proteins involved in the degradation of the plant cell wall, which may indicate that the bacterium uses mechanisms related to this event during the process of adaptation and infection. However, there is no experimental data regarding such sequences to prove their real function during the pathogenesis of Xac. The main objective of this work was to identify functionally, in Xac, through in vitro and in vivo assays, genes involved in the production or transport of proteins related to the degradation of cellulose and, therefore, to analyze its relevance in the capacity of adaptation and infection of the bacterium. During the investigation, a collection of mutant strains of Xac was produced by random and site-directed mutagenesis, which were analyzed through the identification of leaf lesions and their action on degradation of artificial cellulose in plate as well as the growth in leaves. Through tests of mutagenesis and in vitro assays, this study shows that the xps operon that is present in Xac and encodes a type II secretion system machinery is functional and the genes XAC0028, XAC0029, XAC2374, XAC3516 and XAC4231 participate in cellulose degradation. In summary, for the first time it was experimentally demonstrated that Xac is capable in hydrolizing cellulose / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular