Resumo: A couve comum (Brassica oleracea L. var. acephala DC) pertence à família Brassicaceae e de provável origem a região mediterrânea, atualmente têm ampla distribuição nos cinco continentes, desenvolvendo-se bem em temperaturas amenas, entretanto resiste bem ao frio e a geadas leves. No Brasil, a produção está localizada predominantemente em pequenas áreas do centro-sul do Brasil. O consumo das brássicas está associado ao seu alto valor nutricional, como fonte de vitaminas, minerais e fibras, bem como na prevenção de certos tipos de câncer, além de suas folhas apresentarem altos teores de fibras, imprescindíveis para boa digestão. Dentre os fatores que podem comprometer a produção encontram-se o inseto-praga Plutella xylostella (L., 1758) (Lepidoptera: Plutellidae), conhecida no Brasil como traça-dascrucíferas que ataca cultivares de couve, repolho, brócolis, cenoura e aipo. Seus danos são graves ao limbo foliar, chegando a comprometer economicamente a cultura, ocorrendo em todas as regiões produtoras de brássicas do país apresentando maiores populações em períodos quentes e secos. Nesse contexto, o trabalho teve por objetivos identificar genótipos de couve com fonte de resistência a P. xylostella determinando-se os tipos não-preferência para oviposição, alimentação e antibiose. Os testes de nãopreferência para alimentação foram realizados com os genótipos: Manteiga de Ribeirão Pires I-2620, Roxa I-919, Manteiga I-1811, Manteiga de São Roque I-1912, Gigante I- 915, Manteiga I-916, Crespa I-918, Manteiga de Ribeirão Pires I-2446, Crespa de Capão Bonito, Manteiga de Tupi, Manteiga de Jundiaí, Manteiga de Mococa, Manteiga de São José, Manteiga de Monte Alegre, Pires 2 de Campinas, Comum, Couve de Arthur Nogueira 2, Couve de Arthur Nogueira 1. Nestes experimentos realizaram-se testes com e sem chance de escolha ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The cabbage (Brassica oleracea L. var. acephala DC) belong to Brassicaceae family and probable origin the Mediterranean region and actually have large distribution in the five continents, developing in moderate temperatures, however it resists good the cold and the low frosts. In Brazil, the production is located predominantly in small areas of the center-south of Brazil. The consumption of the brássicas is associated with its high nutricional value, as vitamin, minerals and staple fibres, and can prevent certain types of cancer, beyond of high fibre value, necessary for good digestion. Amongst the factors that can compromise the production, have the pest Plutella xylostella (L., 1758) (Lepidoptera: Plutellidae), recognized in Brazil how traçadas- crucíferas, attacking borecole, cabbage, broccolis, carrot and celery. Your damages are serious in the leaves, arriving to compromise the culture economically, occurring in all the producing regions of brássicas of the country presenting major population in hot and dry periods. In this context, the aim of this work to identify genotypes with resistance of the type antibiosis and no-preference to P. xylostella, and to determine the involved types of resistance. The tests of no-preference for feeding was realized with the genotypes: Manteiga of Ribeirão Pires I-2620, Roxa I-919, Manteiga I-1811, Manteiga of São Roque I-1912, Gigante I-915, Manteiga I-916, Crespa I-918, Manteiga de Ribeirão Pires I-2446, Crespa of Capão Bonito, Manteiga of Tupi, Manteiga de Jundiaí, Manteiga of Mococa, Manteiga of São José, Manteiga of Monte Alegre, Pires 2 of Campinas, Comum, Couve of Arthur Nogueira 2, Couve of Arthur Nogueira 1. Free-choice and nochoice tests possibility had been carried through, with larvae of first and fourth ínstar evaluates for 24 hours. It demonstrated less attractive and to be consumed by the feeding...(Complete abstract, click electronic access below) / Orientador: Arlindo Leal Boiça Junior / Coorientadora: Leila Trevizan Braz / Banca: João Carlos de Oliveira / Banca: José Roberto Sacarpellini / Mestre

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2015-10-22T18:12:21Z No. of bitstreams: 2 Tese - Walter Santos de Araújo.pdf: 2149997 bytes, checksum: 6ada687150a99d08e94670136a570e65 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-23T10:19:17Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Walter Santos de Araújo.pdf: 2149997 bytes, checksum: 6ada687150a99d08e94670136a570e65 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-23T10:19:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Walter Santos de Araújo.pdf: 2149997 bytes, checksum: 6ada687150a99d08e94670136a570e65 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-03-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The intensification of land use due to human activities in natural environments has led to various consequences to biodiversity, ranging from local extinction of native species and colonization of by exotic and invasive ones to the complete conversion of ecosystems in to anthropic landscapes. Among the different biodiversity components that can be influenced by human habitat modification are the ecological interactions between insect herbivores and their host plants, which together represent 75% of the known diversity of terrestrial species. In this context, the objective of my thesis was to investigate global patterns in the structure and fragility of plant-herbivore networks. Specifically, I sought to answer as the intensification of land use and the dominance of exotic host plant species influence the structure and fragility of interaction networks of insect herbivores and host plants, and also I investigate whether there latitudinal gradient in the structuration of these interactions. I compiled 90 local plant-herbivore networks distributed worldwide, spanning different taxonomic groups of plants and insects and several feed guilds of herbivores. The main results of my analyses show that land use intensification and the dominance of exotic host plant species influence different aspects of plant-herbivore networks, such as species richness and taxonomic distinctness (a proxy to phylogenetic diversity) of herbivore species and the structure and fragility of interactions. Another recurrent result was that, when networks composed exclusively of endophagous herbivores were analyzed separately from those composed exclusively by exophages, only the networks of endophages had consistent effects of the land use intensity and proportion of exotic host plant species. Altogether, land use intensification surprisingly increases network specialization by decreasing connectance and nestedness, and increases modularity; while the increase in the proportion of exotic hosts had opposite effects. Possibly these changes in the network structure are due to loss proportionally higher of species with many interactions (i.e., generalists) in relation to species with few interactions (i.e., specialists). As a consequence of these changes in the network connectivity, land use intensification decreases the robustness of plant-herbivore networks, while the proportion of exotic host plant species increases. Therefore, networks located in habitats with higher land use intensity tend to be less robust that networks in more pristine habitats, which is a very intriguing result that goes in the opposite direction of most of the literature on ecological networks. Controling the antropic effects that can act on the networks, my results show that plant–herbivore networks are structured independently of latitude, suggesting that the factors that influence the interactions between host plants and insect herbivores are latitudinally invariant. The results and patterns found emphasize the important contribution of this thesis to the understanding of plant-herbivore networks in the context of human disturbances in natural habitats. / A intensificação do uso do solo devido às atividades humanas nos ambientes naturais tem promovido uma série de consequências à biodiversidade, que vão desde a extinção local de espécies nativas, passando pela colonização de espécies exóticas e invasoras, até a completa conversão de ecossistemas em paisagens antropizadas. Dentre os vários componentes da biodiversidade que podem ser influenciados pela alteração antrópica dos habitats estão às interações ecológicas entre insetos herbívoros e suas plantas hospedeiras, que juntos representam quase dois terços da diversidade de espécies terrestres conhecidas. Nesse contexto, o objetivo da minha tese foi avaliar padrões globais na estrutura e fragilidade das redes planta-herbívoro. Especificamente avaliei como a intensificação do uso do solo e a dominância de plantas hospedeiras exóticas influenciam a estrutura e fragilidade de redes de interação envolvendo insetos herbívoros e plantas hospedeiras, e também avaliei se existe gradiente latitudinal na estruturação dessas interações. Para isso eu compilei 90 redes locais, mundialmente distribuídas, constituídas por diferentes grupos taxonômicos de insetos e plantas e por várias guildas alimentares de herbívoros. Os meus principais resultados mostram que a intensificação do uso do solo e a dominância de plantas hospedeiras exóticas influenciam diferentes aspectos das redes planta-herbívoro, tais como, riqueza de espécies e distinção taxonômica (um substituto para diversidade filogenética) de herbívoros e estrutura e fragilidade das interações. Outro resultado constante no meu estudo foi que quando as redes compostas exclusivamente por herbívoros endófagos foram analisadas separadamente daquelas compostas exclusivamente por herbívoros exófagos, foi encontrado que apenas as redes de endófagos mostraram uma mudança consistente em resposta à intensidade de uso do solo e à proporção de plantas hospedeiras exóticas. De modo geral, a intensificação do uso do solo surpreendentemente aumenta a especialização das redes, por diminuir a conectância e o aninhamento, e aumentar a modularidade; enquanto que o aumento na proporção de hospedeiras exóticas tem efeitos opostos. Possivelmente essas mudanças na estrutura das redes se devem à perda proporcionalmente maior de espécies com muitas interações (i.e., generalistas) em relação às com poucas interações (i.e., especialistas). Como consequência dessas mudanças na conectividade das redes, a intensificação do uso do solo diminui a robustez das redes plantaherbívoro, enquanto o incremento na proporção de plantas hospedeiras exóticas aumenta. Portanto, redes localizadas em habitats com maior intensificação do uso do solo foram menos robustas do que as redes de habitats que tendem a naturais, o que é um resultado contrário à maioria da literatura de redes ecológicas. Controlando os efeitos antrópicos que podem atuar sobre as redes, meus resultados mostram que as redes planta-herbívoro são estruturadas independentemente da latitude, sugerindo que os fatores que influenciam as interações entre plantas e insetos são latitudinalmente invariantes. Os resultados e padrões encontrados enfatizam a contribuição importante da tese para a compreensão das redes planta-herbívoro em um contexto de modificações antrópicas.

As rizobactérias promotoras de crescimento (PGPR) são microrganismos que ocorrem naturalmente no solo, são conhecidas por proporcionar melhorias no desenvolvimento das plantas atuando de diversas formas. Bacillus subtilis (cepa GB03) é uma PGPR disponível para comercialização como fungicida biológico concentrado, utilizada no tratamento de sementes de diversas culturas como algodão, soja, amendoim, trigo e cevada. Destaca-se pela capacidade de promover o crescimento de plantas por meio da emissão de voláteis. Vários estudos com Arabidopsis thaliana já comprovaram que B. subtilis (GB03) é capaz de auxiliar no desenvolvimento da planta por meio da promoção de crescimento e pela supressão de patógenos habitantes de solo. No entanto, o seu papel na proteção de plantas contra a herbivoria de insetos ainda não é bem caracterizado. Deste modo, buscou-se avaliar os efeitos da interação de B. subtilis (GB03) com plantas de rúcula (Eruca sativa) e Plutella xylostella (traça-das-crucíferas). Este inseto pertence à ordem Lepidoptera, considerado praga de maior importância no cultivo de Brassicaceae ao redor do mundo. Devido à sua alta prolificidade e capacidade de adaptação e ao seu curto ciclo de vida, tornou-se uma das pragas mais resistentes e de difícil controle da agricultura. Atualmente, os custos em escala mundial com o controle da praga anualmente chegam em torno de US $ 4 a 5 bilhões. Foram utilizados dois tratamentos, plantas inoculadas com B. subtilis (GB03) e controle (plantas não inoculadas). Avaliou-se o crescimento de plantas de rúcula e o peso seco de parte aérea. Para avaliar o desempenho e dano de P. xylostella em ambos tratamentos, previamente foram pesados grupos de quinze lagartas e submetidas a alimentação de plantas de rúcula durante 24 horas. Posteriormente, as lagartas foram retiradas e pesadas novamente e a área foliar consumida foi calculada por meio do software editor de imagens ImageJ®. A preferência de oviposição do inseto foi testada por meio de olfatometria, composta apenas de pistas olfativas e em arenas contendo tanto pistas olfativas quanto visuais. A emissão de voláteis foi caracterizada quantitativamente e qualitativamente por cromatografia gasosa e analisada por espectrometria de massas. A inoculação com GB03 em plantas de rúcula promoveu melhor crescimento das plantas em relação ao tratamento controle, ao mesmo tempo em que diminuiu os danos pelo consumo alimentar do inseto na planta. P. xylostella não apresentou distinção entre os odores das plantas nos testes de olfatometria. Entretanto, observou-se menor número de ovos em plantas com GB03 nos bioensaios de arena. Não foram constatadas diferenças significativas na emissão total de voláteis entre os tratamentos com e sem GB03, no entanto, foram encontradas concentrações diferentes dos compostos (Z)-3-hexenol e 2-ethyl-1-decanol. Outros testes devem ser realizados com a finalidade de estabelecer o papel desempenhado por GB03 na indução de defesas de plantas contra insetos. / The plant growth promoting rhizobateria (PGPR) are microorganisms that naturaly live in the soil, known by improving the plants\' development in many ways. Bacillus subtilis (strain GB03) is a comercial available PGPR, sold as a concentrated biological fungicide, applied in seed treatment of different cultures as cotton, soybean, peanut, wheat and barley. Moreover, it stands out by its capacity of plant growth promoting via volatiles emission. Several studies with Arabidopsis thaliana showed that B. subtilis (GB03) can help the plant development via growth promotion and by soil pathogens supression. However, its role in plant protection against insect herbivory has not been characterized yet. Thus, it aimed to evaluate the interaction effects among B. subtilis (GB03), arugula plants (Eruca sativa) and Plutella xylostella (Diamondback moth). This insect belongs to the order Lepidoptera and have been considered the main pest in Brassicaceae fields around the world. Due to its high prolificacy and plasticity in field survival, and its short life cycle, it has become one of the most resistant and hard control pest in agriculture. Currently, the annualy world costs with this pest control is about US $ 4-5 bilions. Here, it was used two treatments, innoculated plants with B. subtilis (GB03) and control (non-innoculated plants). The arugula plants growth and dry mass of shoots were evaluated. To analyze the performance and damage by P. xylostella in both treatments, it was previously weighed groups with fifteen caterpillars and submitted to feeding on arugula plants during 24 hours. After that, the caterpillars were removed and weighed again and the consumed leaf area was calculated by the image editor software ImageJ®. The insect oviposition preference was tested by olfactometry, with only olfactory cues and in arenas containing both, olfactory and visual cues. Volatiles emission was quantitatively and qualitatively characterized by gas chromatography and analyzed by mass spectrometry. GB03 innoculation in arugula plants promoted a better growth when compared to control, and, at the same time, there was an increasing in the plant damage by insect food consumption. P. xylostella did not show distinction between odors of the plants in olfactometry tests. Although, it was observed less number of eggs in plants with GB03 in arena bioassays. It was not found significant differences in total volatile emission between the treatments with and without GB03, even though different concentrations of (Z)-3-hexenol and 2-ethyl-1-decanol were observed. Other tests must be performed in order to estabilish the role played by GB03 in plant induction defense against insects.

Os inibidores inibidores de serino proteinases do tipo Bowman-Birk (BBI) possuem dois sítios ativos e são encontrados em plantas das famílias Fabaceae e Poaceae. Neste trabalho foi apresentada a estrutura primária e o padrão de expressão de 14 seqüências expressas (EST, expressed sequence tags) de BBI putativos encontradas no banco de dados do "Projeto Transcriptoma da Cana-de-açúcar" (SUCEST). Estas quatorze seqüências foram utilizadas em conjunto com outras 87 seqüências de BBI previamente descritas e depositadas no banco de dados "GenBank" para a construção de árvores filogenéticas da família BBI. A análise filogenética mostrou que os BBI de monocotiledôneas e dicotiledôneas podem ser claramente separados em diferentes grupos e a topologia das árvores filogenéticas sugere um padrão evolutivo diferente das famílias de BBI em plantas. Os inibidores de dicotiledôneas são bem conservados e acumularam diferenças sutis durante a evolução. Em contrapartida, os inibidores de monocotiledôneas são altamente variáveis, indicando a ocorrência de um processo evolutivo interessante, baseado em eventos de duplicação intragênica e mutação. Dois inibidores de serino proteinases, um de tripsina e outro de quimotripsina, derivados do gene que codifica o inibidor Bowman-Birk de soja, foram expressos na superfície do fago filamentoso M13 e utilizados para a construção de bibliotecas de variantes. Para tal foram feitas mutações em quatro aminoácidos do sítio ativo destes inibidores e duas bibliotecas de expressão na superfície de fagos filamentosos foram construídas. Posteriormente, estas bibliotecas foram utilizadas para a seleção de variantes que melhor interagiam com a tripsina bovina e de Diatraea saccharalis e com as enzimas digestivas presentes no extrato intestinal desta praga. Os variantes selecionados foram seqüenciados, analisados e caracterizados. Os resultados mostraram que a técnica de expressão na superfície de fagos filamentosos foi eficiente para selecionar novos inibidores. Além disto, com as mutações realizadas, foi possível transformar a alça de inibição de quimotripsina em uma alça de inibição de tripsina. / The Bowman-Birk inhibitors (BBIs) are double headed inhibitors of serine proteinase found in plants from Fabaceae and Poaceae families. We describe the primary structure and the gene expression profile of 14 putative BBIs from the sugarcane expressed sequence tag (SUCEST) database and show how we used these newly discovered sequences together with 87 previously described BBI sequences from the "GenBank" database to construct phylogenetic trees for the BBI family. Phylogenetic analysis revealed that BBI-type inhibitors from monocotyledonous and dicotyledonous plants could be clearly separated into different groups, while the overall topology of the BBI tree suggests a different pattern of evolution for BBI families in flowering plants. We also found that BBI proteinase inhibitors from dicotyledonous plants were well conserved, accumulating only slight differences during their evolution. In addition, we found that BBIs from monocotyledonous plants were highly variable, indicating an interesting process of evolution based on internal gene duplications and mutation events. Two serine-type proteinase inhibitors, a trypsin and a chymotrypsin, both derived from the soybean Bowman-Birk inhibitor, were expressed on the surface of a filamentous phage. Site mutations were made in four positions of the reactive sites of these inhibitors and two phage-display libraries were constructed. Later, these libraries were used to select better ligands to the bovine and Diatraea saccharalis trypsin and to the midgut enzymes of this insect pest. The selected variants were sequenced, analyzed and characterized. The results showed that the phage-display technique is efficient to select new proteinase inhibitors. Furthermore, it was possible to modify the chymotrypsin loop into a trypsin loop using the library constructed by the insertion of a degenerated primer.

As plantas desenvolveram diferentes mecanismos para reduzir o ataque de insetos, incluindo compostos protéicos de defesa, como os inibidores de proteinases (IPs). Os insetos, ao longo da evolução, desenvolveram estratégias para superar as barreiras defensivas das plantas, permitindo a sua alimentação e desenvolvimento, como a super expressão de genes de enzimas digestivas sensíveis e insensíveis aos IPs de plantas. Uma das abordagens desse trabalho foi identificar novas serinoproteinases no intestino de lagartas de Spodoptera frugiperda. Duas novas quimotripsinas e trê novas tripsinas foram identificadas e juntamente com mais 10 genes já conhecidos que codificam estas enzimas foram submetidos à análise de expressão gênica por PCR em tempo real. Entre essas duas famílias de serinoproteinases (SPs) os genes que codificam as quimotripsinas apresentam uma regulação positiva mais ampla do que aqueles que codificam as tripsinas. Estudos de modelagem molecular das quimotripsinas também foram realizados. Foram construídos modelos tridimensionais à partir de modelagem por homologia além de análises de dinâmica molecular e docagem com oito diferentes IPs do tipo Bowman- Birk. Os resultados mostram quais quimotripsinas apresentam as maiores afinidades aos inibidores testados de maneira geral e individual, inferidos à partir da estimativa de energia livre do sistema. Também foi encontrada uma serina extra próxima ao sítio catalítico de três quimotrispsinas modeladas que pode interferir na afinidade dessas enzimas já que este aminoácido apresenta perda de área acessível ao solvente quando complexada ao IP de soja testado. Os resultados de expressão gênica e grau de sensibilidade foram comparados e não se observou qualquer relação entre esses parâmentros. Isso sugere que as lagartas da espécie S. frugiperda combinam diferentes estratégias adaptativas como o aumento de expressão de todas as suas quimotripsinas independentemente do grau de sensibilidade das enzimas. / Plants have developed different mechanisms to reduce insect attack, including defence proteins such as proteinase inhibitors (PIs). In turn, insects have evolved strategies to overcome these plant defence mechanisms, such as the hyperexpression of PI-sensitive and insensitive digestive enzymes, allowing the insect to thrive. One of the aims of this work was to identify new serine proteinases (SPs) in the gut of the fall armyworm larvae, Spodoptera frugiperda. Two new chymotrypsins and three new trypsins were identified, and together with 10 previously identified genes, the genes that encode these enzymes were subjected to real-time PCR and gene expression analysis. Between these two families of serine-proteinases the genes that encode chymotrypsins show a greater positive regulation then those encoding the trypsins. Molecular modelling studies of the chymotrypsins were carried out, and 3D models were generated using homology modelling, which were then further refined by dynamic molecular and docking analyses with 8 different Bowman-Birk type PIs. The results demonstrate which chymotrypsins possess the highest affinities to the tested inhibitors in a general and individual manner, inferred from the estimated free energies. A serine residue in very close proximity to the catalytic site was present in three of chymotrypsins investigated, which may be affecting the enzymes affinity since the residue has a reduced accessible area to the solvent when complexed to the soya PI tested. The genetic expression patterns and the degree of PI-sensitivity were also compared and no relation between the parameters was found. This suggests that the larvae of the species S. frugiperda combine different adaptive strategies like the increase in expression of its entire chymotrypsin arsenal regardless of the degree of PI-sensitivity of the enzymes.

As plantas desenvolveram diferentes mecanismos para reduzir o ataque de insetos, incluindo compostos protéicos de defesa, como os inibidores de proteinases (IPs). Os insetos, ao longo da evolução, desenvolveram estratégias para superar as barreiras defensivas das plantas, permitindo a sua alimentação e desenvolvimento, como a super expressão de genes de enzimas digestivas sensíveis e insensíveis aos IPs de plantas. Uma das abordagens desse trabalho foi identificar novas serinoproteinases no intestino de lagartas de Spodoptera frugiperda. Duas novas quimotripsinas e trê novas tripsinas foram identificadas e juntamente com mais 10 genes já conhecidos que codificam estas enzimas foram submetidos à análise de expressão gênica por PCR em tempo real. Entre essas duas famílias de serinoproteinases (SPs) os genes que codificam as quimotripsinas apresentam uma regulação positiva mais ampla do que aqueles que codificam as tripsinas. Estudos de modelagem molecular das quimotripsinas também foram realizados. Foram construídos modelos tridimensionais à partir de modelagem por homologia além de análises de dinâmica molecular e docagem com oito diferentes IPs do tipo Bowman- Birk. Os resultados mostram quais quimotripsinas apresentam as maiores afinidades aos inibidores testados de maneira geral e individual, inferidos à partir da estimativa de energia livre do sistema. Também foi encontrada uma serina extra próxima ao sítio catalítico de três quimotrispsinas modeladas que pode interferir na afinidade dessas enzimas já que este aminoácido apresenta perda de área acessível ao solvente quando complexada ao IP de soja testado. Os resultados de expressão gênica e grau de sensibilidade foram comparados e não se observou qualquer relação entre esses parâmentros. Isso sugere que as lagartas da espécie S. frugiperda combinam diferentes estratégias adaptativas como o aumento de expressão de todas as suas quimotripsinas independentemente do grau de sensibilidade das enzimas. / Plants have developed different mechanisms to reduce insect attack, including defence proteins such as proteinase inhibitors (PIs). In turn, insects have evolved strategies to overcome these plant defence mechanisms, such as the hyperexpression of PI-sensitive and insensitive digestive enzymes, allowing the insect to thrive. One of the aims of this work was to identify new serine proteinases (SPs) in the gut of the fall armyworm larvae, Spodoptera frugiperda. Two new chymotrypsins and three new trypsins were identified, and together with 10 previously identified genes, the genes that encode these enzymes were subjected to real-time PCR and gene expression analysis. Between these two families of serine-proteinases the genes that encode chymotrypsins show a greater positive regulation then those encoding the trypsins. Molecular modelling studies of the chymotrypsins were carried out, and 3D models were generated using homology modelling, which were then further refined by dynamic molecular and docking analyses with 8 different Bowman-Birk type PIs. The results demonstrate which chymotrypsins possess the highest affinities to the tested inhibitors in a general and individual manner, inferred from the estimated free energies. A serine residue in very close proximity to the catalytic site was present in three of chymotrypsins investigated, which may be affecting the enzymes affinity since the residue has a reduced accessible area to the solvent when complexed to the soya PI tested. The genetic expression patterns and the degree of PI-sensitivity were also compared and no relation between the parameters was found. This suggests that the larvae of the species S. frugiperda combine different adaptive strategies like the increase in expression of its entire chymotrypsin arsenal regardless of the degree of PI-sensitivity of the enzymes.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-12-03Bitstream added on 2014-06-13T20:33:52Z : No. of bitstreams: 1 tagliari_sra_me_jabo.pdf: 327924 bytes, checksum: fce7de7ea57c7ccfd242df4b023d97f0 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A couve comum (Brassica oleracea L. var. acephala DC) pertence à família Brassicaceae e de provável origem a região mediterrânea, atualmente têm ampla distribuição nos cinco continentes, desenvolvendo-se bem em temperaturas amenas, entretanto resiste bem ao frio e a geadas leves. No Brasil, a produção está localizada predominantemente em pequenas áreas do centro-sul do Brasil. O consumo das brássicas está associado ao seu alto valor nutricional, como fonte de vitaminas, minerais e fibras, bem como na prevenção de certos tipos de câncer, além de suas folhas apresentarem altos teores de fibras, imprescindíveis para boa digestão. Dentre os fatores que podem comprometer a produção encontram-se o inseto-praga Plutella xylostella (L., 1758) (Lepidoptera: Plutellidae), conhecida no Brasil como traça-dascrucíferas que ataca cultivares de couve, repolho, brócolis, cenoura e aipo. Seus danos são graves ao limbo foliar, chegando a comprometer economicamente a cultura, ocorrendo em todas as regiões produtoras de brássicas do país apresentando maiores populações em períodos quentes e secos. Nesse contexto, o trabalho teve por objetivos identificar genótipos de couve com fonte de resistência a P. xylostella determinando-se os tipos não-preferência para oviposição, alimentação e antibiose. Os testes de nãopreferência para alimentação foram realizados com os genótipos: Manteiga de Ribeirão Pires I-2620, Roxa I-919, Manteiga I-1811, Manteiga de São Roque I-1912, Gigante I- 915, Manteiga I-916, Crespa I-918, Manteiga de Ribeirão Pires I-2446, Crespa de Capão Bonito, Manteiga de Tupi, Manteiga de Jundiaí, Manteiga de Mococa, Manteiga de São José, Manteiga de Monte Alegre, Pires 2 de Campinas, Comum, Couve de Arthur Nogueira 2, Couve de Arthur Nogueira 1. Nestes experimentos realizaram-se testes com e sem chance de escolha... / The cabbage (Brassica oleracea L. var. acephala DC) belong to Brassicaceae family and probable origin the Mediterranean region and actually have large distribution in the five continents, developing in moderate temperatures, however it resists good the cold and the low frosts. In Brazil, the production is located predominantly in small areas of the center-south of Brazil. The consumption of the brássicas is associated with its high nutricional value, as vitamin, minerals and staple fibres, and can prevent certain types of cancer, beyond of high fibre value, necessary for good digestion. Amongst the factors that can compromise the production, have the pest Plutella xylostella (L., 1758) (Lepidoptera: Plutellidae), recognized in Brazil how traçadas- crucíferas, attacking borecole, cabbage, broccolis, carrot and celery. Your damages are serious in the leaves, arriving to compromise the culture economically, occurring in all the producing regions of brássicas of the country presenting major population in hot and dry periods. In this context, the aim of this work to identify genotypes with resistance of the type antibiosis and no-preference to P. xylostella, and to determine the involved types of resistance. The tests of no-preference for feeding was realized with the genotypes: Manteiga of Ribeirão Pires I-2620, Roxa I-919, Manteiga I-1811, Manteiga of São Roque I-1912, Gigante I-915, Manteiga I-916, Crespa I-918, Manteiga de Ribeirão Pires I-2446, Crespa of Capão Bonito, Manteiga of Tupi, Manteiga de Jundiaí, Manteiga of Mococa, Manteiga of São José, Manteiga of Monte Alegre, Pires 2 of Campinas, Comum, Couve of Arthur Nogueira 2, Couve of Arthur Nogueira 1. Free-choice and nochoice tests possibility had been carried through, with larvae of first and fourth ínstar evaluates for 24 hours. It demonstrated less attractive and to be consumed by the feeding...(Complete abstract, click electronic access below)

Submitted by MARCELO MUELLER DE FREITAS null (freitasmm@hotmail.com) on 2016-08-30T14:48:41Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO MARCELO - VERSÃO FINAL.pdf: 1608919 bytes, checksum: 9f7300ca28b20b8e1c0cd0ab90154490 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-08-31T13:25:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 freitas_mm_me_jabo.pdf: 1608919 bytes, checksum: 9f7300ca28b20b8e1c0cd0ab90154490 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-31T13:25:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 freitas_mm_me_jabo.pdf: 1608919 bytes, checksum: 9f7300ca28b20b8e1c0cd0ab90154490 (MD5) Previous issue date: 2016-07-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Entre as pragas que causam prejuízos à soja, Spodoptera cosmioides assume importância devido a ineficiência dos métodos atuais para o seu controle, podendo causar reduções significativas na produção da cultura. Portanto, métodos alternativos dentro do manejo integrado de pragas como a resistência de plantas, tornam-se ferramentas fundamentais como táticas de controle a S. cosmioides. Variações em fatores intrínsecos às plantas podem afetar a expressão da resistência ao ataque de insetos e outros artrópodes. Desse modo, a determinação de metodologias específicas e mais precisas, em trabalhos visando à seleção de genótipos resistentes a um determinado inseto, são imprescindíveis para melhor demonstrar possíveis variações nos níveis de resistência entre genótipos. O presente trabalho teve como objetivo avaliar alguns fatores relacionados às plantas de soja que podem influenciar a expressão da resistência constitutiva e induzida a S. cosmioides. Na primeira parte avaliou-se a influência dos seguintes fatores na expressão da resistência constitutiva de dois genótipos resistente e suscetível a S. cosmioides em testes de preferência alimentar com e sem chance de escolha: substrato alimentar (disco foliar versus folíolo inteiro), posição foliar/idade foliar (folha mais nova da parte superior versus folha mais velha da parte inferior), e estrutura vegetal (folha versus vagem). Além disso, avaliou-se os efeitos de antibiose para S. cosmioides pela alimentação individual ou mista com folhas e vagens em teste sem chance de escolha. A segunda parte teve como objetivo investigar se alguns fatores como o genótipo (resistente e suscetível) e posição foliar (folhas da parte superior e folhas da parte inferior) influenciam na expressão da resistência induzida por injúria prévia. Também foram testados dois métodos de avaliação dos parâmetros biológicos de S. cosmioides, oferecendo discos foliares ou folíolos inteiros aos insetos nos bioensaios. Na primeira parte deste estudo, observou-se que o folíolo inteiro retirado da parte inferior das plantas proporcionou a melhor diferenciação na expressão da antixenose em genótipos de soja. Além disso, o desenvolvimento larval de S. cosmioides foi afetado em lagartas alimentadas apenas com vagem e quando alimentadas com vagem até o quarto ínstar e folíolo a partir do quarto ínstar. Na segunda parte, verificou-se que o genótipo resistente expressou resistência induzida a S. cosmioides em plantas de soja previamente injuriadas, enquanto que o genótipo suscetível não apresentou indução de resistência. Além disso, a posição foliar influenciou a expressão da resistência induzida no genótipo resistente, que foi melhor observada com o disco foliar coletado da parte superior. Espera-se que os resultados obtidos neste estudo, possam contribuir para o entendimento dos mecanismos de defesa em soja, fornecendo metodologias específicas para trabalhos futuros com resistência constitutiva e induzida, que poderão colaborar para o manejo integrado de pragas na cultura da soja. / Among the pests that cause damage to soybeans, Spodoptera cosmioides takes importance due to inefficiency of current methods for their control and may cause significant decreases in crop production. Therefore, alternative methods within the Integrated Pest Management as the Host-Plant Resistance become fundamental tools as control tactics against S. cosmioides. Variations on factors inherent to plants may affect the expression of resistance to insects and other arthropods. Thus, the determination of specific methodologies and most accurate in studies aiming at the selection of genotypes resistant to a particular insect are essential to better demonstrate possible variations in resistance levels between genotypes. This study aimed to evaluate some factors related to soybean plants that can influence the expression of constitutive and induced resistance to S. cosmioides. In the first part we evaluated the influence of the following factors on expression of constitutive resistance of two resistant and susceptible genotypes to S. cosmioides on feeding preference on choice and no-choice tests: leaf discs versus entire leaflets; upper part versus lower part of the plant; leaf versus pod. In addition, we evaluated the effects on larval development to S. cosmioides by individually or mixed food with leaves and pods in no-choice test. The second part aimed to investigate if some factors such as genotype (resistant and susceptible) and leaf position (upper part versus lower part of the plant) influence the expression of resistance induced by previous herbivory. We also tested two methods of evaluation of biological parameters of S. cosmioides offering leaf disks or entire leaflets insects in bioassays. In the first experiment, the entire leaflet removed from the lower part of the plants showed the best differentiation in the expression of antixenosis in soybean genotypes. The larval development of S. cosmioides was affected in caterpillars fed only on pod and when fed on pod to the fourth instar and leaflets from the fourth instar. In the second experiment, the resistant genotype expressed induced resistance to S. cosmioides in previously injured soybean plants, while the susceptible genotype showed no resistance induction. Furthermore, the position influenced the expression of induced resistance in the resistant genotype, which was better seen with leaf disc collected from upper part of the plant. We expect the results of this study can contribute to the understanding of the defense mechanisms of soybeans, providing specific methodologies for future works with constitutive and induced resistance, contributing to the Integrated Pest Management of soybeans.

Os inibidores inibidores de serino proteinases do tipo Bowman-Birk (BBI) possuem dois sítios ativos e são encontrados em plantas das famílias Fabaceae e Poaceae. Neste trabalho foi apresentada a estrutura primária e o padrão de expressão de 14 seqüências expressas (EST, expressed sequence tags) de BBI putativos encontradas no banco de dados do "Projeto Transcriptoma da Cana-de-açúcar" (SUCEST). Estas quatorze seqüências foram utilizadas em conjunto com outras 87 seqüências de BBI previamente descritas e depositadas no banco de dados "GenBank" para a construção de árvores filogenéticas da família BBI. A análise filogenética mostrou que os BBI de monocotiledôneas e dicotiledôneas podem ser claramente separados em diferentes grupos e a topologia das árvores filogenéticas sugere um padrão evolutivo diferente das famílias de BBI em plantas. Os inibidores de dicotiledôneas são bem conservados e acumularam diferenças sutis durante a evolução. Em contrapartida, os inibidores de monocotiledôneas são altamente variáveis, indicando a ocorrência de um processo evolutivo interessante, baseado em eventos de duplicação intragênica e mutação. Dois inibidores de serino proteinases, um de tripsina e outro de quimotripsina, derivados do gene que codifica o inibidor Bowman-Birk de soja, foram expressos na superfície do fago filamentoso M13 e utilizados para a construção de bibliotecas de variantes. Para tal foram feitas mutações em quatro aminoácidos do sítio ativo destes inibidores e duas bibliotecas de expressão na superfície de fagos filamentosos foram construídas. Posteriormente, estas bibliotecas foram utilizadas para a seleção de variantes que melhor interagiam com a tripsina bovina e de Diatraea saccharalis e com as enzimas digestivas presentes no extrato intestinal desta praga. Os variantes selecionados foram seqüenciados, analisados e caracterizados. Os resultados mostraram que a técnica de expressão na superfície de fagos filamentosos foi eficiente para selecionar novos inibidores. Além disto, com as mutações realizadas, foi possível transformar a alça de inibição de quimotripsina em uma alça de inibição de tripsina. / The Bowman-Birk inhibitors (BBIs) are double headed inhibitors of serine proteinase found in plants from Fabaceae and Poaceae families. We describe the primary structure and the gene expression profile of 14 putative BBIs from the sugarcane expressed sequence tag (SUCEST) database and show how we used these newly discovered sequences together with 87 previously described BBI sequences from the "GenBank" database to construct phylogenetic trees for the BBI family. Phylogenetic analysis revealed that BBI-type inhibitors from monocotyledonous and dicotyledonous plants could be clearly separated into different groups, while the overall topology of the BBI tree suggests a different pattern of evolution for BBI families in flowering plants. We also found that BBI proteinase inhibitors from dicotyledonous plants were well conserved, accumulating only slight differences during their evolution. In addition, we found that BBIs from monocotyledonous plants were highly variable, indicating an interesting process of evolution based on internal gene duplications and mutation events. Two serine-type proteinase inhibitors, a trypsin and a chymotrypsin, both derived from the soybean Bowman-Birk inhibitor, were expressed on the surface of a filamentous phage. Site mutations were made in four positions of the reactive sites of these inhibitors and two phage-display libraries were constructed. Later, these libraries were used to select better ligands to the bovine and Diatraea saccharalis trypsin and to the midgut enzymes of this insect pest. The selected variants were sequenced, analyzed and characterized. The results showed that the phage-display technique is efficient to select new proteinase inhibitors. Furthermore, it was possible to modify the chymotrypsin loop into a trypsin loop using the library constructed by the insertion of a degenerated primer.

Orientador: Maria Lígia Rodrigues Macedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T23:07:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_DesireeSoaresda_D.pdf: 3168437 bytes, checksum: b863b3429e08cd7ff7926b540a4d69b5 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Inibidores de peptidases (IPs) são proteínas vegetais envolvidas nos mecanismos de defesa contra herbívoros e patógenos. São considerados agentes antimetabólicos, uma vez que sua presença na dieta de insetos compromete seu desenvolvimento normal. Este efeito se dá através da formação de complexos entre os IPs e as enzimas digestivas, comprometendo assim o processo digestivo dos insetos. Neste trabalho, investigamos efeitos do inibidor de tripsina de sementes de Adenanthera pavonina (ApTI) sobre o desenvolvimento de dois insetos-praga, a broca-da-cana (Diatraea saccharalis) e a lagarta-do-cartucho (Spodoptera frugiperda). Bioensaios, estudos bioquímicos e de proteômica, foram realizados a fim de determinar o efeito de ApTI sobre o desenvolvimento destes insetos. A exposição aguda de larvas de D. saccharalis ao ApTI diminuiu a atividade das tripsinas e quimotripsinas em 87% e 63%, respectivamente. ApTI afetou o desenvolvimento deste inseto como observado através da diminuição na viabilidade larval (55%) e pupal (20,6%). Larvas oriundas da geração F1 apresentaram efeitos similares aos observados na geração F0, como redução no peso (23%) e na taxa de sobrevivência (33%). Análises bioquímicas revelaram que o inibidor foi refratário à digestão pelas peptidases de D. saccharalis e que o perfil de enzimas digestivas permaneceu sensível à inibição por quantidades crescentes de ApTI. Entretanto, não foi possível realizar a identificação das proteínas do intestino desta lagarta por espectrometria de massas. Larvas de S. frugiperda foram criadas em dieta contendo 0,5% de ApTI. Ao final dos experimentos, uma redução no peso médio larval de 30% foi observada. Porém, diferentemente dos resultados obtidos para D. saccharalis, as enzimas das larvas alimentadas com ApTI mostraram-se resistentes à inibição, sugerindo que esta espécie adapta-se à dieta contendo inibidor. O sequenciamento das proteínas presentes nos fluidos intestinais de S. frugiperda permitiu a identificação de 41 proteínas. Dentre elas foi possível identificar serinopeptidases do tipo tripsina e quimotripsina, proteínas estruturais, enzimas quinases e fosfatases. Nossos resultados demonstram que são necessários novos estudos para obtenção de mais informações acerca das proteínas presentes no fluido intestinal de S. frugiperda, para correlacionarmos sua expressão diferencial em larvas submetidas a diferentes tratamentos, conhecendo desta maneira um novo indício sobre os mecanismos adaptativos desta espécie contra os IPs / Abstract: Peptidase inhibitors (PIs) are plant proteins involved in defense mechanisms against herbivores and pathogens. They are considered antinutritional compounds, since their presence in insect diet hinder the normal larval development. This effect is due the complexation between PIs and peptidases, affecting the insect digestive process. In this work, we investigated the effects of trypsin inhibitor from Adenanthera pavonina seeds (ApTI) on the development of two pest insects: the sugarcane borer (Diatraea saccharalis) and the fall armyworm (Spodoptera frugiperda). Biochemical and proteomic studies were carried out in order to determine the ApTI effects on the development of these insects. The acute exposure of sugarcane borer to ApTI reduced the trypsin and chymotrypsin activities in 87% and 63%, respectively. The effect of ApTI on development of sugarcane borer was noticed by reduced larval (23%) and pupal viability (33%). Biochemical analysis revealed that the inhibitor was refractory to digestion by D. saccharalis peptidases and the enzymes maintained sensibility to inhibition by increasing amounts of ApTI. However, it was not possible to identify proteins from sugarcane borer gut through mass spectrometry approach. S. frugiperda larvae were reared in artificial diet containing 0.5% ApTI and a reduction in average larval weight of 30% was noticed. But, differently of D. saccharalis, S. frugiperda midgut enzymes became resistant to inhibition by ApTI, showing that this species adapted to ApTI-diet. From the sequencing of S. frugiperda gut fluid proteins we identified 41 proteins. Among them, we identified trypsin and chymotrypsin enzymes, structural proteins and quinases and phosphatases enzymes. Our results demonstrated that further researches are necessary in order to obtain more information about proteins from S. frugiperda gut fluid. The correlation between differential expressed proteins in larvae submitted to different treatments is crucial to reach new indicatives about the adaptive mechanisms this species evolve against PIs / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular