GASPAROTTO, E.P.L. Expressão de genes e proteínas pró- e anti-apoptóticas em células precursoras da medula óssea e leucócitos do sangue periférico de pacientes portadores de policitemia vera. 2009. 185f. Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009. A policitemia vera (PV) é uma doença mieloproliferativa clonal que afeta o progenitor hematopoético multipotente causando o acúmulo de eritrócitos, leucócitos e plaquetas morfologicamente normais e seus precursores, na ausência de um estímulo definido. Alterações na regulação da apoptose parece ser uma das causas do acúmulo de células eritróides sem a necessidade de eritropoetina. A mutação JAK2 V617F foi descrita como um dos eventos envolvidos na fisiopatologia das Doenças Mieloproliferativas Crônicas, sendo relacionada a um pior prognóstico. Esta mutação resulta na ativação constitutiva da enzima Janus Kinase 2 e conseqüentemente das vias de sinalização associadas ao estímulo celular mediado por citocinas e fatores de crescimento. O objetivo deste estudo foi investigar as alterações da expressão de proteínas e genes envolvidos na regulação da apoptose em pacientes com PV sem tratamento. Para tanto foi quantificada a expressão de genes e proteínas da família Bcl-2 e da via extrínseca da apoptose em células precursoras e leucócitos desses pacientes e de indivíduos saudáveis. Os leucócitos do sangue periférico de 12 pacientes e 14 controles foram obtidos pelo método de Haes-esteril. As células precursoras CD34+ destes pacientes e de 19 controles foram separadas em coluna imunomagnética. A detecção da expressão gênica e protéica das moléculas anti- e pró-apoptóticas foi realizada pelas técnicas de PCR em tempo real e Western-blot, respectivamente. Foi avaliada ainda a resistência à morte celular induzida por agentes apoptogênicos dos linfócitos dos pacientes. As células CD34+ e maduras mostraram expressão aumentada dos genes a1, mcl-1, noxa, c-flip e ciap-2. A expressão dos genes bid , bim-EL , fas e faim estava elevada e a dos genes bcl-2, bcl-xL e bax diminuída, somente nas células CD34+. Nos leucócitos, observou-se ainda maior nível de expressão do gene bok e expressão diminuída dos genes bcl-2, bcl-xL, bad, bax, faim, dr4, dr5 e trail. Os genes bcl-w, bak, bik, fasL e ciap-1 não mostraram diferença significativa na expressão em células CD34+ e leucócitos de pacientes e controles (p>0,05). Houve significância estatística nas correlações entre: expressão de dr5 e mutação JAK2 V617F; bim-EL com concentração de hemoglobina e com hematócrito; bcl-w e número de plaquetas; a1, bad, bax nas células CD34+ e bad em leucócitos com aumento do baço. Os linfócitos dos pacientes foram mais resistentes a apoptose mediada por ACT D 1uM e 5uM, ARA-C 25uM, CHX 25uM, VP-16 e VM-26 25uM. Houve correlação entre a percentagem de alelos mutados para JAK2 V617F e o perfil de resistência aos indutores de apoptose dos linfócitos dos pacientes a ACT D 1 uM e 5uM e STS 5uM. Observou-se ainda correlação estatística entre: expressão de a1 com ACT D 5 uM, CHX 50uM e ARA-C 25uM; bad com CHX 25uM e teniposídeo 25uM; bcl-2 com ACT D 5uM , CHX 50uM, STS 1uM e 5uM e VP-16 a25uM ; bid com ACT D 5uM e VM26 25uM; bik com ACT D 5uM , STS 1uM e 5uM e VM-26 25uM, ARAC 25uM e VP16 25Um; bim-EL com CHX 25uM e teniposídeo 25uM; bok com ACT D 5uM STS 1uM e 5uM, ARAC 25uM e etoposídeo 25uM; ciap-1 com ACT D 1uM e 5uM, STS 1uM e VP16 25uM; dr4 com ACT D 5uM, ARAC 25uM, VP16 a 25uM; dr5 com ACT D 5uM, STS 1uM, ARAC 25uM e VP16 25uM; faim com ACT D 5uM; mcl-1 com ARAC 25uM e STS 1uM; trail com ACT D 5uM. As proteínas A1, BAD e c-FLIP tiveram o mesmo perfil de expressão dos seus respectivos genes, contudo os níveis de expressão protéica para BCL-xL estavam aumentados e para BIM-EL diminuídos, resultados discordantes com os obtidos nas expressões gênicas. Em conjunto esses resultados sugerem que a maquinaria apoptótica está desregulada, o que poderia contribuir, pelo menos em parte, com a mieloacumulação observada no SP e MO dos pacientes com PV. / GASPAROTTO, E.P.L. Pro- and anti-apoptotic genes and proteins expression in bone marrow precursors and peripheral blood leukocytes in polycythemia vera patients. 185f. Thesis (Doctoral). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009. Polycythemia vera (PV) is a clonal myeloproliferative disease arising in a multipotent haematopoietic progenitor cell causing the accumulation of erythrocytes, leukocytes and platelets morphologically normal and their precursors in absence of a definable stimulus. Apoptosis deregulation seems to be one of the causes of erythroid cells accumulation without the need for erythropoietin. The JAK2 V617F mutation has been described as one of the events involved in pathophysiology of chronics myeloproliferative diseases, being related to worse prognosis. This mutation results in constitutive activation of the enzyme Janus kinase 2 and consequently of signaling pathways associated with cell stimulation mediated by cytokines and growth factors. This study aimed to investigate changes in expression of proteins and genes involved in regulation of apoptosis in PV patients without treatment. Was quantified for both gene and proteins expression of the Bcl-2 family and the extrinsic pathway of apoptosis members in precursor cells and leukocytes of patients and healthy subjects. Peripheral blood leukocytes of 12 patients and 14 controls were obtained by the Haes-sterile method. CD34+ precursor cells of these patients and 19 controls were separated by immunomagnetic column. Anti- and pro-apoptotic gene and protein expression detection was performed by real-time PCR and Western-blot techniques respectively. It also assessed the resistance to cellular death induced by apoptogenics agents in PV lymphocytes. CD34+ and mature cells showed increased expression of a1, mcl-1, noxa, c-flip and ciap-2. Gene expression of bid, bim-EL , fas e faim was high and to genes bcl-2, bcl-xL and bax diminished, only in CD34+ cells. In leukocytes, there was even greater level of expression of bok and reduced of bcl-2, bcl-xL, bad, bax, faim, dr4, dr5 and trail. Not significant difference was found to bcl-w, bak, bik, fasL and ciap-1 expression in CD34+ cells and leukocytes of patients and controls (p> 0.05). There was statistical correlation between: dr5 expression and JAK2 V617F mutation; bim-EL with hemoglobin concentration and hematócrito; bcl-w and platelets counts; a1, bad, bax in CD34+ cells and bad in leukocytes with enlarged spleen. PV lymphocytes were more resistant to apoptosis mediated by ACT D 1uM and 5uM, ARA-C 25uM, CHX 25uM, VP-16 25uM and VM-26 25uM. There was correlation between JAK2 V617F allele burden and resistance profile to apoptosis inducers in PV lymphocytes to ACT D 1uM and 5uM and STS 5uM. There was also correlation between: a1 expression with ACT D 5 uM, CHX 50uM and ARA-C 25uM; bad with CHX 25uM and teniposide 25uM; bcl-2 with ACT D 5uM, CHX 50uM, STS 1uM and 5uM and VP -16 25uM; bid with ACT D 5uM and VM-26 25uM; bik with ACT D 5uM, STS 1uM and 5uM, VM-26 25uM, ARA-C 25uM and VP-16 25uM; bim-EL with CHX 25uM and teniposide 25uM ; bok with ACT D 5uM, STS 1uM and 5uM, ARA-C 25uM and etoposide 25uM; ciap-1 with ACT D 1uM and 5uM, STS 1uM and VP-16 25uM; dr4 with ACT D 5uM, ARA-C 25uM, VP-16 25uM; dr5 with ACT D 5uM, STS 1uM, ARA-C 25uM and VP-16 25uM; faim with ACT D 5uM, mcl-1 with ARA-C 25uM and STS 1uM; trail with ACT D 5uM. The A1, BAD and c-FLIP proteins have the same profile of expression of their genes, however the levels of protein expression in BCL-xL were increased and decreased for BIM-EL, discordant results in related with the one obtained by gene expressions. Taken together these results suggest that apoptotic machinery is deregulated, which could contribute, at least in part, with myeloaccumulation observed in the SP and BM of PV patients.

As neoplasias mieloproliferativas (NMPs) Filadelfia negativo como a policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primária (MFP) são desordens clonais da célula tronco hematopoiética caracterizadas pela produção excessiva de células mielóides diferenciadas. Este fenômeno ocorre devido à uma mutação somática (JAK2V617F) que ativa a via JAK-STAT de transdução de forma constitutiva. Esta mutação é mais frequente na PV, ocorrendo em 95% dos casos, e em 50% dos casos de TE e MFP. Outro defeito genético que ocorre é a mutação no receptor de trombopoetina, MPL. As mutações em MPL podem ser germinativas ou somáticas e menos de 10% dos pacientes com TE e MFP apresentam essa alteração genética. Entretanto, grande parte dos pacientes com TE e MFP que não apresentam mutação em JAK2V617F ou MPL podem apresentar mutações somáticas no gene CALR. Em adição às mutações somáticas que causam mieloproliferação, outras alterações genéticas em genes que funcionam como reguladores epigenéticos são encontrados nas NMPs nos genes TET2, IDH1, IDH2 e ASLX1. Objetivo: Estabelecer um perfil genético em pacientes com NMP através da avaliação de mutações nos genes JAK2, CALR, MPL, IDH1, IDH2, TET2 e ASXL1 assim como estabelecer uma correlação laboratorial destas na PV, TE e MFP. Casuística e Métodos: Foram utilizadas amostras de sangue periférico de 104 pacientes que foram enviadas para o Laboratório de Biologia Tumoral do Serviço de Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para avaliação diagnóstica. Quinze dos 104 pacientes são de pacientes com PV (14,4%), 20/104 (19,2%) com MFP, 20/104 (19,2%) com TE e 49/104 (47,1%) com outras doenças hemtológicas. Foi feita a avaliação da prevalência de mutações somáticas, seja por sequenciamento ou análise de fragmentos, nos genes JAK2 (exon 12 e Y931C), MPL, IDH1, IDH2, CALR, TET2 e ASXL1. PCR-RFLP foi realizada para identificação de mutações em JAK2V617F. Resultados: A mutação JAK2V617F foi observada em 30 (28,8%) pacientes (12 PV, 11 TE e 7 MFP), a mutação JAK2 exon 12 foi observada em apenas um (0,96%) paciente com PV, mutação JAK2Y931C em 4 (3,8%) pacientes (1 PV, 2 TE e 1 MFP) e 8 (7,7%) pacientes apresentaram mutações em CALR (3 TE e 5 MFP). Mutações nos genes epigenéticos como IDH1 foram observadas em 9 (8,7%) pacientes (2 TE, 2 MFP, 1 SMD, e 4 pacientes com suspeita de NMP), mutações em IDH2 estão presentes em 5 (4,8%) pacientes (2 TE, 1 SMD/leucemia e 4 pacientes com suspeita de NMP), mutações em ASXL1 foram identificadas em 13 (12,5%) pacientes (1 PV, 3 TE, 2 MFP, 3 SMD/leucemias e 4 com suspeita de NMP) e finalmente, mutações em TET2 foram encontradas em 33 (31,7%) pacientes (3 PV, 5 TE, 4 MFP, 8 SMD/leucemias e 13 pacientes com suspeita de NMP). Além disso, no caso da PV, os pacientes que apresentam mutações em JAK2V617F apresentam valores aumentados de plaquetas (mediana de 5,41 x 105/mm3 plaquetas) em relação aos pacientes sem a mutação (mediana de 2,06 x 105/mm3 plaquetas), com diferença estatística (p=0,031). Pacientes do mesmo grupo que apresentam mutações em TET2 apresentam, opostamente aos com mutações em JAK2V617F, menores valores de plaquetas (mediana de 1,75 x105/mm3 plaquetas) em relação aos pacientes sem mutações no gene TET2 (mediana de 5,41 x 105/mm3 plaquetas), com diferença estatística (p=0,048). No caso da MFP, os pacientes que apresentam mutações em JAK2V617F apresentam valores maiores de leucócitos (mediana de 1,09 x104/mm3 leucócitos) do que os pacientes que não apresentam a mutação (mediana de 6,99 x103/mm3 leucócitos) com diferença estatística (p=0,046), já os pacientes que apresentam mutações no gene ASXL1 apresentam valores menores de hemácias (mediana de 2,43 x106/mm3 hemácias) em relação aos pacientes que não apresentam mutação (mediana de 3,71 x106/mm3 hemácias) com diferença estatística (p=0,042). Conclusão: O trabalho permitiu fornecer um perfil genético dos pacientes com NMP estudados. Além disso, é possível observar que algumas mutações epigenéticas podem influenciar em diferenças clínicas / Myeloproliferative neoplasms (MPNs) Philadelphia (Ph) chromosome negative, such as polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and primary myelofibrosis (PMF) are clonal disorders of hematopoietic stem cell characterized by increased proliferation of differentiated myeloid cells. This phenomenon occurs due somatic mutation (JAK2V617F) that constitutively stimulates the JAK-STAT signaling pathway. This mutation is more frequent in PV, around 95%, and between 50% in ET and PMF. Other genetic aberration can be observed in the thrombopoietin (TPO) receptor MPL. Mutations in MPL can be in the germline line or somatic and less than 10% of patients with TE or PMF would harbor this genetic alteration. Otherwise, patients with TE or PMF without JAK2V617F or MPL mutation could present somatic mutations in calreticulin (CALR). In addition to somatic mutations that cause myeloproliferation, other genetic alterations that function as epigenetic regulators were identified in genes as TET2, IDH1, IDH2 e ASLX1 in MPN. Objective: Establish genetic profile in patients with diagnosis of PV, ET, and PMF through genetic alterations in the following genes: JAK2, MPL, CALR, IDH1, IDH2, TET2 e ASXL1, and correlate those alterations with demographic characteristic of the study population. Casuistic and Methods: Peripheral blood samples from 104 patients referred to the Tumor Biology Laboratory of the Department of Hematology of Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo for diagnostic investigation were analyzed. Fifteen out 104 samples were from PV patients (14.4%), 20/104 (19.2%) in PMF, 20/104 (19.2%) in ET and 49/104 (47.1%) with other hematologic diseases. Identification of somatic mutations was made, either by direct sequencing or fragment analysis in JAK2 (exon 12 and Y931C), MPL, IDH1, IDH2, CALR, TET2 and ASXL1. PCR-RFLP was performed to identify JAK2V617F mutation. Results: JAK2V617F mutation was observed in 30 (28.8%) patients (12 PV, 11 ET and 7 PMF), JAK2 exon 12 in only one (0.96%) patient with PV, JAK2Y931C in 4 (3.8%) patients (1 PV, 2 ET and 1 PMF), and 8 patients (7.7%) presented CALR mutation (3 ET and 5 PMF). Mutations in the epigenetic genes as IDH1 were observed in 9 (8.7%) patients (2 ET, 2 PMF, 1 MDS and 4 patients with suspected MPN), IDH2 mutations were present in 5 (4.8%) patients (2 ET, 1 MDS/leukemia, and 4 patients with suspected MPN), ASLX1 mutations were identified in 13 (12.5%) patients (1 PV, 3 ET, 2 PMF, 3 MDS/leukemia and 4 with suspected MPN) and finally, TET2 mutations were present in 33 (31.7%) patients (3 PV, 5 ET, 4 PMF, 8 MDS/leukemia, and 13 with suspected MPN). In addition, patients with PV who harbor JAK2V617F have increased platelet counts (median 5.41 x 105/mm3 platelets) compared to those without the mutation (median 2.06 x 105/mm3 platelets, p=0.031). Patients in the same group with TET2 mutation, as opposed to those with JAK2V617F, presented low platelets counts (median of 1.75 x 105/mm3 platelets) compared to those without TET2 mutation (median 5.41 x 105/mm3 platelets, p=0.048). Presence of JAK2V617F in patients diagnosed with PMF have a greater number of leukocytes (median 1.09 x104/mm3 leukocytes) when compared to patients without the mutation (median 6.99 x 103/mm3 leukocytes, p=0.046). Patients with PMF who presented mutations in ASXL1 gene have a lower number of red blood cells (median of 2.43 x 106/mm3) compared to patients without mutations in the same gene (median 3.71 x 106/mm3, p=0.042). Conclusion: The present study allows us to provide a genetic profile of patients with MPN. Furthermore, it is possible to observe that some epigenetic mutations could influence in some clinical differences

GASPAROTTO, E.P.L. Expressão de genes e proteínas pró- e anti-apoptóticas em células precursoras da medula óssea e leucócitos do sangue periférico de pacientes portadores de policitemia vera. 2009. 185f. Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009. A policitemia vera (PV) é uma doença mieloproliferativa clonal que afeta o progenitor hematopoético multipotente causando o acúmulo de eritrócitos, leucócitos e plaquetas morfologicamente normais e seus precursores, na ausência de um estímulo definido. Alterações na regulação da apoptose parece ser uma das causas do acúmulo de células eritróides sem a necessidade de eritropoetina. A mutação JAK2 V617F foi descrita como um dos eventos envolvidos na fisiopatologia das Doenças Mieloproliferativas Crônicas, sendo relacionada a um pior prognóstico. Esta mutação resulta na ativação constitutiva da enzima Janus Kinase 2 e conseqüentemente das vias de sinalização associadas ao estímulo celular mediado por citocinas e fatores de crescimento. O objetivo deste estudo foi investigar as alterações da expressão de proteínas e genes envolvidos na regulação da apoptose em pacientes com PV sem tratamento. Para tanto foi quantificada a expressão de genes e proteínas da família Bcl-2 e da via extrínseca da apoptose em células precursoras e leucócitos desses pacientes e de indivíduos saudáveis. Os leucócitos do sangue periférico de 12 pacientes e 14 controles foram obtidos pelo método de Haes-esteril. As células precursoras CD34+ destes pacientes e de 19 controles foram separadas em coluna imunomagnética. A detecção da expressão gênica e protéica das moléculas anti- e pró-apoptóticas foi realizada pelas técnicas de PCR em tempo real e Western-blot, respectivamente. Foi avaliada ainda a resistência à morte celular induzida por agentes apoptogênicos dos linfócitos dos pacientes. As células CD34+ e maduras mostraram expressão aumentada dos genes a1, mcl-1, noxa, c-flip e ciap-2. A expressão dos genes bid , bim-EL , fas e faim estava elevada e a dos genes bcl-2, bcl-xL e bax diminuída, somente nas células CD34+. Nos leucócitos, observou-se ainda maior nível de expressão do gene bok e expressão diminuída dos genes bcl-2, bcl-xL, bad, bax, faim, dr4, dr5 e trail. Os genes bcl-w, bak, bik, fasL e ciap-1 não mostraram diferença significativa na expressão em células CD34+ e leucócitos de pacientes e controles (p>0,05). Houve significância estatística nas correlações entre: expressão de dr5 e mutação JAK2 V617F; bim-EL com concentração de hemoglobina e com hematócrito; bcl-w e número de plaquetas; a1, bad, bax nas células CD34+ e bad em leucócitos com aumento do baço. Os linfócitos dos pacientes foram mais resistentes a apoptose mediada por ACT D 1uM e 5uM, ARA-C 25uM, CHX 25uM, VP-16 e VM-26 25uM. Houve correlação entre a percentagem de alelos mutados para JAK2 V617F e o perfil de resistência aos indutores de apoptose dos linfócitos dos pacientes a ACT D 1 uM e 5uM e STS 5uM. Observou-se ainda correlação estatística entre: expressão de a1 com ACT D 5 uM, CHX 50uM e ARA-C 25uM; bad com CHX 25uM e teniposídeo 25uM; bcl-2 com ACT D 5uM , CHX 50uM, STS 1uM e 5uM e VP-16 a25uM ; bid com ACT D 5uM e VM26 25uM; bik com ACT D 5uM , STS 1uM e 5uM e VM-26 25uM, ARAC 25uM e VP16 25Um; bim-EL com CHX 25uM e teniposídeo 25uM; bok com ACT D 5uM STS 1uM e 5uM, ARAC 25uM e etoposídeo 25uM; ciap-1 com ACT D 1uM e 5uM, STS 1uM e VP16 25uM; dr4 com ACT D 5uM, ARAC 25uM, VP16 a 25uM; dr5 com ACT D 5uM, STS 1uM, ARAC 25uM e VP16 25uM; faim com ACT D 5uM; mcl-1 com ARAC 25uM e STS 1uM; trail com ACT D 5uM. As proteínas A1, BAD e c-FLIP tiveram o mesmo perfil de expressão dos seus respectivos genes, contudo os níveis de expressão protéica para BCL-xL estavam aumentados e para BIM-EL diminuídos, resultados discordantes com os obtidos nas expressões gênicas. Em conjunto esses resultados sugerem que a maquinaria apoptótica está desregulada, o que poderia contribuir, pelo menos em parte, com a mieloacumulação observada no SP e MO dos pacientes com PV. / GASPAROTTO, E.P.L. Pro- and anti-apoptotic genes and proteins expression in bone marrow precursors and peripheral blood leukocytes in polycythemia vera patients. 185f. Thesis (Doctoral). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009. Polycythemia vera (PV) is a clonal myeloproliferative disease arising in a multipotent haematopoietic progenitor cell causing the accumulation of erythrocytes, leukocytes and platelets morphologically normal and their precursors in absence of a definable stimulus. Apoptosis deregulation seems to be one of the causes of erythroid cells accumulation without the need for erythropoietin. The JAK2 V617F mutation has been described as one of the events involved in pathophysiology of chronics myeloproliferative diseases, being related to worse prognosis. This mutation results in constitutive activation of the enzyme Janus kinase 2 and consequently of signaling pathways associated with cell stimulation mediated by cytokines and growth factors. This study aimed to investigate changes in expression of proteins and genes involved in regulation of apoptosis in PV patients without treatment. Was quantified for both gene and proteins expression of the Bcl-2 family and the extrinsic pathway of apoptosis members in precursor cells and leukocytes of patients and healthy subjects. Peripheral blood leukocytes of 12 patients and 14 controls were obtained by the Haes-sterile method. CD34+ precursor cells of these patients and 19 controls were separated by immunomagnetic column. Anti- and pro-apoptotic gene and protein expression detection was performed by real-time PCR and Western-blot techniques respectively. It also assessed the resistance to cellular death induced by apoptogenics agents in PV lymphocytes. CD34+ and mature cells showed increased expression of a1, mcl-1, noxa, c-flip and ciap-2. Gene expression of bid, bim-EL , fas e faim was high and to genes bcl-2, bcl-xL and bax diminished, only in CD34+ cells. In leukocytes, there was even greater level of expression of bok and reduced of bcl-2, bcl-xL, bad, bax, faim, dr4, dr5 and trail. Not significant difference was found to bcl-w, bak, bik, fasL and ciap-1 expression in CD34+ cells and leukocytes of patients and controls (p> 0.05). There was statistical correlation between: dr5 expression and JAK2 V617F mutation; bim-EL with hemoglobin concentration and hematócrito; bcl-w and platelets counts; a1, bad, bax in CD34+ cells and bad in leukocytes with enlarged spleen. PV lymphocytes were more resistant to apoptosis mediated by ACT D 1uM and 5uM, ARA-C 25uM, CHX 25uM, VP-16 25uM and VM-26 25uM. There was correlation between JAK2 V617F allele burden and resistance profile to apoptosis inducers in PV lymphocytes to ACT D 1uM and 5uM and STS 5uM. There was also correlation between: a1 expression with ACT D 5 uM, CHX 50uM and ARA-C 25uM; bad with CHX 25uM and teniposide 25uM; bcl-2 with ACT D 5uM, CHX 50uM, STS 1uM and 5uM and VP -16 25uM; bid with ACT D 5uM and VM-26 25uM; bik with ACT D 5uM, STS 1uM and 5uM, VM-26 25uM, ARA-C 25uM and VP-16 25uM; bim-EL with CHX 25uM and teniposide 25uM ; bok with ACT D 5uM, STS 1uM and 5uM, ARA-C 25uM and etoposide 25uM; ciap-1 with ACT D 1uM and 5uM, STS 1uM and VP-16 25uM; dr4 with ACT D 5uM, ARA-C 25uM, VP-16 25uM; dr5 with ACT D 5uM, STS 1uM, ARA-C 25uM and VP-16 25uM; faim with ACT D 5uM, mcl-1 with ARA-C 25uM and STS 1uM; trail with ACT D 5uM. The A1, BAD and c-FLIP proteins have the same profile of expression of their genes, however the levels of protein expression in BCL-xL were increased and decreased for BIM-EL, discordant results in related with the one obtained by gene expressions. Taken together these results suggest that apoptotic machinery is deregulated, which could contribute, at least in part, with myeloaccumulation observed in the SP and BM of PV patients.

Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) sont des hémopathies myéloïdes clonales, chroniques et prolifératives. Les plus fréquentes sont la polyglobulie de Vaquez et la thrombocytémie essentielle. Elles s’accompagnent de risques importants de thrombose (artérielles et veineuses) et de transformation en pathologies plus agressives (myélofibrose secondaire et leucémie aigüe). Les thromboses peuvent être la situation diagnostique de ces maladies, ou survenir au cours de la prise en charge. Le sujet de cette thèse est d’étudier la relation clinique entre NMP et thrombose. Dans un contexte de survenue de thrombose veineuse idiopathique, sans antécédent NMP, nous nous sommes intéressés à la recherche de mutation clonale chez les patients comme moyen diagnostique d’une NMP. Nous avons ainsi exploité la cohorte EDITH du CIC en prenant les patients ayant expérimentés un puis une récurrence thrombotique. A l’inverse, nous avons constitué une base de données (OBENE) des patients pris en charge pour une NMP au CHRU de Brest.Nous avons ensuite exploité cette base, en analysant la fréquence et l’impact des arythmies cardiaques auriculaires, la balance bénéfice-risque à l’utilisation des NACO, l’impact des statines sur la réduction du risque de thrombose ainsi que la fréquence et l’impact de la nonadhérence aux traitements dans les PV et TE.NMP et thromboses sont liées, il est donc nécessaire d’approfondir les connaissances de leur physiopathologie spécifique pour améliorer la prévention et le traitement des épisodes. Cette thèse amène quelques réponses àcertaines questions mais elle est surtout le point de départ de réflexion commune entre les praticiens et biologistes intéressés par ces domaines. / The myeloproliferative neoplasms (MPN) are clonal myeloid, chronic and proliferative disorders. The most frequent are polycythemia vera and essential thrombocythemia. The more frequent complications are thromboses (arterial and venous) and phenotypic evolutions (secondary myelofibrosis and acute leukemia). Thromboses can be a situation of diagnosis or observed during the followup of a MPN. This thesis is focused on the clinical link between MPN and thromboses.In a context of idiopathic venous thromboses (first event or recurrence), without medical history of MPN, we have tested patients for the most frequent MPN clonal mutations. So, we have used the informations and patients of the dedicated EDITH cohort.On the other hand, we have constituted a MPN database (OBENE) of the patients diagnosed for MPN in our Hospitalcentre. By this way, we have analysed the frequency and impact of atrial arrhythmias, the benefit-risk balance of the use of DOAC, the impact of statins to reduce the thrombotic risk and the frequency and impact of the treatment nonadherence in this population.MPN and thromboses are linked, so it is necessary to increase our knowledge of their physiopathology to improve prevention and treatment of the events. This thesis brings some answers to some questions but, she is almost the starting point of common reflexion between clinicians and biologists interested in these domains.

As neoplasias mieloproliferativas (NMPs) Filadelfia negativo como a policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primária (MFP) são desordens clonais da célula tronco hematopoiética caracterizadas pela produção excessiva de células mielóides diferenciadas. Este fenômeno ocorre devido à uma mutação somática (JAK2V617F) que ativa a via JAK-STAT de transdução de forma constitutiva. Esta mutação é mais frequente na PV, ocorrendo em 95% dos casos, e em 50% dos casos de TE e MFP. Outro defeito genético que ocorre é a mutação no receptor de trombopoetina, MPL. As mutações em MPL podem ser germinativas ou somáticas e menos de 10% dos pacientes com TE e MFP apresentam essa alteração genética. Entretanto, grande parte dos pacientes com TE e MFP que não apresentam mutação em JAK2V617F ou MPL podem apresentar mutações somáticas no gene CALR. Em adição às mutações somáticas que causam mieloproliferação, outras alterações genéticas em genes que funcionam como reguladores epigenéticos são encontrados nas NMPs nos genes TET2, IDH1, IDH2 e ASLX1. Objetivo: Estabelecer um perfil genético em pacientes com NMP através da avaliação de mutações nos genes JAK2, CALR, MPL, IDH1, IDH2, TET2 e ASXL1 assim como estabelecer uma correlação laboratorial destas na PV, TE e MFP. Casuística e Métodos: Foram utilizadas amostras de sangue periférico de 104 pacientes que foram enviadas para o Laboratório de Biologia Tumoral do Serviço de Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para avaliação diagnóstica. Quinze dos 104 pacientes são de pacientes com PV (14,4%), 20/104 (19,2%) com MFP, 20/104 (19,2%) com TE e 49/104 (47,1%) com outras doenças hemtológicas. Foi feita a avaliação da prevalência de mutações somáticas, seja por sequenciamento ou análise de fragmentos, nos genes JAK2 (exon 12 e Y931C), MPL, IDH1, IDH2, CALR, TET2 e ASXL1. PCR-RFLP foi realizada para identificação de mutações em JAK2V617F. Resultados: A mutação JAK2V617F foi observada em 30 (28,8%) pacientes (12 PV, 11 TE e 7 MFP), a mutação JAK2 exon 12 foi observada em apenas um (0,96%) paciente com PV, mutação JAK2Y931C em 4 (3,8%) pacientes (1 PV, 2 TE e 1 MFP) e 8 (7,7%) pacientes apresentaram mutações em CALR (3 TE e 5 MFP). Mutações nos genes epigenéticos como IDH1 foram observadas em 9 (8,7%) pacientes (2 TE, 2 MFP, 1 SMD, e 4 pacientes com suspeita de NMP), mutações em IDH2 estão presentes em 5 (4,8%) pacientes (2 TE, 1 SMD/leucemia e 4 pacientes com suspeita de NMP), mutações em ASXL1 foram identificadas em 13 (12,5%) pacientes (1 PV, 3 TE, 2 MFP, 3 SMD/leucemias e 4 com suspeita de NMP) e finalmente, mutações em TET2 foram encontradas em 33 (31,7%) pacientes (3 PV, 5 TE, 4 MFP, 8 SMD/leucemias e 13 pacientes com suspeita de NMP). Além disso, no caso da PV, os pacientes que apresentam mutações em JAK2V617F apresentam valores aumentados de plaquetas (mediana de 5,41 x 105/mm3 plaquetas) em relação aos pacientes sem a mutação (mediana de 2,06 x 105/mm3 plaquetas), com diferença estatística (p=0,031). Pacientes do mesmo grupo que apresentam mutações em TET2 apresentam, opostamente aos com mutações em JAK2V617F, menores valores de plaquetas (mediana de 1,75 x105/mm3 plaquetas) em relação aos pacientes sem mutações no gene TET2 (mediana de 5,41 x 105/mm3 plaquetas), com diferença estatística (p=0,048). No caso da MFP, os pacientes que apresentam mutações em JAK2V617F apresentam valores maiores de leucócitos (mediana de 1,09 x104/mm3 leucócitos) do que os pacientes que não apresentam a mutação (mediana de 6,99 x103/mm3 leucócitos) com diferença estatística (p=0,046), já os pacientes que apresentam mutações no gene ASXL1 apresentam valores menores de hemácias (mediana de 2,43 x106/mm3 hemácias) em relação aos pacientes que não apresentam mutação (mediana de 3,71 x106/mm3 hemácias) com diferença estatística (p=0,042). Conclusão: O trabalho permitiu fornecer um perfil genético dos pacientes com NMP estudados. Além disso, é possível observar que algumas mutações epigenéticas podem influenciar em diferenças clínicas / Myeloproliferative neoplasms (MPNs) Philadelphia (Ph) chromosome negative, such as polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and primary myelofibrosis (PMF) are clonal disorders of hematopoietic stem cell characterized by increased proliferation of differentiated myeloid cells. This phenomenon occurs due somatic mutation (JAK2V617F) that constitutively stimulates the JAK-STAT signaling pathway. This mutation is more frequent in PV, around 95%, and between 50% in ET and PMF. Other genetic aberration can be observed in the thrombopoietin (TPO) receptor MPL. Mutations in MPL can be in the germline line or somatic and less than 10% of patients with TE or PMF would harbor this genetic alteration. Otherwise, patients with TE or PMF without JAK2V617F or MPL mutation could present somatic mutations in calreticulin (CALR). In addition to somatic mutations that cause myeloproliferation, other genetic alterations that function as epigenetic regulators were identified in genes as TET2, IDH1, IDH2 e ASLX1 in MPN. Objective: Establish genetic profile in patients with diagnosis of PV, ET, and PMF through genetic alterations in the following genes: JAK2, MPL, CALR, IDH1, IDH2, TET2 e ASXL1, and correlate those alterations with demographic characteristic of the study population. Casuistic and Methods: Peripheral blood samples from 104 patients referred to the Tumor Biology Laboratory of the Department of Hematology of Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo for diagnostic investigation were analyzed. Fifteen out 104 samples were from PV patients (14.4%), 20/104 (19.2%) in PMF, 20/104 (19.2%) in ET and 49/104 (47.1%) with other hematologic diseases. Identification of somatic mutations was made, either by direct sequencing or fragment analysis in JAK2 (exon 12 and Y931C), MPL, IDH1, IDH2, CALR, TET2 and ASXL1. PCR-RFLP was performed to identify JAK2V617F mutation. Results: JAK2V617F mutation was observed in 30 (28.8%) patients (12 PV, 11 ET and 7 PMF), JAK2 exon 12 in only one (0.96%) patient with PV, JAK2Y931C in 4 (3.8%) patients (1 PV, 2 ET and 1 PMF), and 8 patients (7.7%) presented CALR mutation (3 ET and 5 PMF). Mutations in the epigenetic genes as IDH1 were observed in 9 (8.7%) patients (2 ET, 2 PMF, 1 MDS and 4 patients with suspected MPN), IDH2 mutations were present in 5 (4.8%) patients (2 ET, 1 MDS/leukemia, and 4 patients with suspected MPN), ASLX1 mutations were identified in 13 (12.5%) patients (1 PV, 3 ET, 2 PMF, 3 MDS/leukemia and 4 with suspected MPN) and finally, TET2 mutations were present in 33 (31.7%) patients (3 PV, 5 ET, 4 PMF, 8 MDS/leukemia, and 13 with suspected MPN). In addition, patients with PV who harbor JAK2V617F have increased platelet counts (median 5.41 x 105/mm3 platelets) compared to those without the mutation (median 2.06 x 105/mm3 platelets, p=0.031). Patients in the same group with TET2 mutation, as opposed to those with JAK2V617F, presented low platelets counts (median of 1.75 x 105/mm3 platelets) compared to those without TET2 mutation (median 5.41 x 105/mm3 platelets, p=0.048). Presence of JAK2V617F in patients diagnosed with PMF have a greater number of leukocytes (median 1.09 x104/mm3 leukocytes) when compared to patients without the mutation (median 6.99 x 103/mm3 leukocytes, p=0.046). Patients with PMF who presented mutations in ASXL1 gene have a lower number of red blood cells (median of 2.43 x 106/mm3) compared to patients without mutations in the same gene (median 3.71 x 106/mm3, p=0.042). Conclusion: The present study allows us to provide a genetic profile of patients with MPN. Furthermore, it is possible to observe that some epigenetic mutations could influence in some clinical differences

Les dernières avancées dans les traitements des hémopathies aboutissent à un meilleurs taux de rémission complète ainsi qu' à de meilleurs taux de survie après traitement. Cependant les risques de rechutes restent élevés. Notre projet s'inscrit dans la compréhension du rôle des cellules NK dans l'évolution de ce type de pathologies. Dans une première partie nous nous sommes intéressés à la polyglobulie de Vaquez. Cette pathologie présente une évolution lente et progressive, et elle est caractérisée par une mutation de JAK2 présente dans la lignée myéloïde chez plus de 95% des patients. Nous avons cherché à détecter la mutation dans les cellules NK de patients, puis, pour savoir si la mutation avait un effet sur les NK, nous avons exploré leurs fonctions in vitro. Nos résultats ont montré que, bien que la mutation soit présente dans les cellules NK, elle ne semble pas avoir d'impact sur les fonctions des cellules NK que nous avons pu tester. Nous en avons conclu que l'évolution de la polyglobulie de Vaquez en leucémie n'était peut-être pas due à une perte de fonction des NK mais plutôt à leur inhibition par l'environnement cellulaire.Dans une deuxième partie nous avons étudié la régulation des natural cytotoxicity receptors dans la leucémie aiguë myéloïde. D'apres des travaux antérieurs nous avons émis l'hypothèse que l'expression des trois NCR aurait une régulation commune s'effectuant au niveau de transcription de leurs gènes. Nos recherches bio-informatiques ainsi que notre expérimentation d'immunoprécipitation de la chromatine (Chip) montrent que le facteur de transcription ETS-1 semble être impliqué dans la régulation commune aux trois NCR. / The latest advances in blood disorders treatments lead to a better complete remission rate and a better survival rate after treatment. However, the risk of relapse remains high. Our project is included in the understanding of NK cells role in the development of these diseases.In a first part, we focused on polycythemia Vera for several reasons: the pathology has a slowly progressive disease, and it is characterized by the presence of JAK2 mutation for > 95% patients. We wanted to know if this mutation was found in NK cells from PV patients and what effects the mutation had on NK cells functions. Our results have shown that although the mutation was found in NK cells, it appears to have no impact on NK cells functions. We conclude that the evolution of PV to leukemia is not due to a loss of NK cell functions but to their inhibition by cellular environment.In a second part, we investigated the regulation of natural cytotoxicity receptors in acute myeloid leukemia because previous works have shown that NCR are weakly expressed in AML patients, that this down-regulation is acquired during evolution of AML and reversible after complete remission, ant that NCR weak expression is related to poor prognosis. We supposed that the expression of the three NCR has a common regulation at genes transcription level. Our bioinformatic researches and our experiment of chromatin immunoprecipitation show that ETS-1 transcription factor is a good candidate involved in the common regulation of the three NCR.

As Neoplasias mieloproliferativas (NMP) representam um vasto grupo de doenças clonais hematológicas malignas com três elementos principais: Policitemia vera (PV), Trombocitemia essencial (TE), e Mielofibrose Primária (MFP). JAK2 é uma proteína citoplasmática com atividade de tirosina quinase com função na transdução de várias vias na hematopoiese. A identificação da mutação do gene JAK2 (JAK2V617F) nas PV, TE e MFP representa um importante avanço para a compreensão da biologia destas NMPs. Variações marcantes na frequência desta mutação são observadas entre os diferentes estudos e acredita-se que um dos fatores responsáveis por estas diferenças seja a sensibilidade do método utilizado. Atualmente, diversas técnicas para detecção de JAK2V617F têm sido utilizadas, testadas e validadas quanto à sua sensibilidade e especificidade, entre elas: PCR RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphysm), ARMS PCR (Amplification-Refractory Mutation System), HRM (High-Resolution Melt Analysis) e Sequenciamento pela técnica de Sanger. Neste estudo foram realizadas todas as metodologias citadas anteriormente para a detecção da mutação de JAK2V617F em amostras de sangue de 136 pacientes (PV=20; MFP=20; TE=28; suspeita de NMP=68). Os resultados obtidos foram concordantes para as quatro técnicas empregadas nos pacientes com PV e MFP, já nos pacientes com TE as metodologias PCR-ARMS e PCR-HRM detectaram a mutação JAK2V617F em 67,8% enquanto o PCR-RFLP e o Sequenciamento pela técnica de Sanger foi 71,4% e 64,2% respectivamente. Nos casos onde houve suspeita diagnóstica de NMP também foram encontradas discordâncias entre as metodologias PCR-RFLP (4,4%) e PCR-HRM (1,5%) quando comparadas ao PCR-ARMS (3%) e o Sequenciamento (3%). O PCR-ARMS foi considerado nesse estudo como a melhor técnica para a detecção da mutação JAK2V617F, devido o menor risco de contaminação cruzada durante a reação, baixo tempo de execução, além da sua capacidade de determinação da carga alélica de JAK2, importante para o acompanhamento do paciente / Myeloproliferative neoplasms (MPN) represent a large group of clonal hematologic malignant diseases with three main members: Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET), and Primary Mielofibroses (PMF). JAK2 is a cytoplasmic tyrosine kinase protein and is important in different signal transduction pathways. Identification of JAK2V617F mutation in PV, ET and PMF is an important advance for understanding the biology of MPN. Differences in the frequency of this mutation are reported among different studies and it is believed that technical sensitivity could be the major reason for this variability. Currently, several techniques for detection of JAK2V617F have been developed, tested and validated for their sensitivity and specificity, including: PCR-RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphysm), PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System), PCR-HRM (High-Resolution Melt analysis) and Sanger Direct Sequencing. The present study, evaluated all four molecular diagnostic methods mentioned above blood samples from 136 patients (PV=20; MFP=20; ET=28 and other MPN=68). Comparable results were observed for PV and PMF when all technics were applied. Patients with diagnosis of ET JAK2V617F mutations were detected in 67.8% when PCR-ARMS and PCR-HRM were used whilst PCR-RFLP and direct sequencing detected 71.4% and 64.2% respectively. In 68 patients with suspicion of MPN discordant results were seen between PCR-RFLP (4.4%) and PCR-HRM (1.5%) when compared to PCR-ARMS (3%) and direct sequencing (3%) related to JAK2V617F frequency. In conclusion PCR-ARMS was considered the most reliable methodology for JAK2V617F detection by presenting the lowest risk for cross contamination, less laborious, and the ability in determining allele burden that is becoming an important tool for risk stratification

As Neoplasias mieloproliferativas (NMP) representam um vasto grupo de doenças clonais hematológicas malignas com três elementos principais: Policitemia vera (PV), Trombocitemia essencial (TE), e Mielofibrose Primária (MFP). JAK2 é uma proteína citoplasmática com atividade de tirosina quinase com função na transdução de várias vias na hematopoiese. A identificação da mutação do gene JAK2 (JAK2V617F) nas PV, TE e MFP representa um importante avanço para a compreensão da biologia destas NMPs. Variações marcantes na frequência desta mutação são observadas entre os diferentes estudos e acredita-se que um dos fatores responsáveis por estas diferenças seja a sensibilidade do método utilizado. Atualmente, diversas técnicas para detecção de JAK2V617F têm sido utilizadas, testadas e validadas quanto à sua sensibilidade e especificidade, entre elas: PCR RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphysm), ARMS PCR (Amplification-Refractory Mutation System), HRM (High-Resolution Melt Analysis) e Sequenciamento pela técnica de Sanger. Neste estudo foram realizadas todas as metodologias citadas anteriormente para a detecção da mutação de JAK2V617F em amostras de sangue de 136 pacientes (PV=20; MFP=20; TE=28; suspeita de NMP=68). Os resultados obtidos foram concordantes para as quatro técnicas empregadas nos pacientes com PV e MFP, já nos pacientes com TE as metodologias PCR-ARMS e PCR-HRM detectaram a mutação JAK2V617F em 67,8% enquanto o PCR-RFLP e o Sequenciamento pela técnica de Sanger foi 71,4% e 64,2% respectivamente. Nos casos onde houve suspeita diagnóstica de NMP também foram encontradas discordâncias entre as metodologias PCR-RFLP (4,4%) e PCR-HRM (1,5%) quando comparadas ao PCR-ARMS (3%) e o Sequenciamento (3%). O PCR-ARMS foi considerado nesse estudo como a melhor técnica para a detecção da mutação JAK2V617F, devido o menor risco de contaminação cruzada durante a reação, baixo tempo de execução, além da sua capacidade de determinação da carga alélica de JAK2, importante para o acompanhamento do paciente / Myeloproliferative neoplasms (MPN) represent a large group of clonal hematologic malignant diseases with three main members: Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET), and Primary Mielofibroses (PMF). JAK2 is a cytoplasmic tyrosine kinase protein and is important in different signal transduction pathways. Identification of JAK2V617F mutation in PV, ET and PMF is an important advance for understanding the biology of MPN. Differences in the frequency of this mutation are reported among different studies and it is believed that technical sensitivity could be the major reason for this variability. Currently, several techniques for detection of JAK2V617F have been developed, tested and validated for their sensitivity and specificity, including: PCR-RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphysm), PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System), PCR-HRM (High-Resolution Melt analysis) and Sanger Direct Sequencing. The present study, evaluated all four molecular diagnostic methods mentioned above blood samples from 136 patients (PV=20; MFP=20; ET=28 and other MPN=68). Comparable results were observed for PV and PMF when all technics were applied. Patients with diagnosis of ET JAK2V617F mutations were detected in 67.8% when PCR-ARMS and PCR-HRM were used whilst PCR-RFLP and direct sequencing detected 71.4% and 64.2% respectively. In 68 patients with suspicion of MPN discordant results were seen between PCR-RFLP (4.4%) and PCR-HRM (1.5%) when compared to PCR-ARMS (3%) and direct sequencing (3%) related to JAK2V617F frequency. In conclusion PCR-ARMS was considered the most reliable methodology for JAK2V617F detection by presenting the lowest risk for cross contamination, less laborious, and the ability in determining allele burden that is becoming an important tool for risk stratification