Moderne Methoden für die Einzelzellanalyse werden dank der fortschreitenden Weiterentwicklung immer sensitiver. Dabei steigen jedoch auch die Anforderungen an das Probenmaterial. Viele Aufbereitungsprotokolle adhärenter Zellen beinhalten eine enzymatische Spaltung der Oberflächenproteine, um die Ablösung vom Zellkultursubstrat zu ermöglichen. Verschiedene Methoden, wie die Patch-Clamp-Technik oder eine auf der Markierung extrazellulärer Domänen von Membranproteinen basierende Durchflusszytometrie können dann nur noch eingeschränkt eingesetzt werden. Daher ist die Etablierung neuer Zellablösemethoden dringend notwendig. In der vorliegenden Arbeit werden erstmals PEG-basierte thermo-responsive Oberflächen erfolgreich für die Zellkultur eingesetzt. Dabei wird das zerstörungsfreie Ablösen verschiedener Zelllinien von den Oberflächen durch Temperatursenkung realisiert. Die Funktionalität der Oberflächen wird durch Variation der Polymerstruktur, sowie der Konzentration der Beschichtungslösung, durch Beschichtung der Oberflächen mit einem zelladhäsionsfördernden Protein (Fibronektin) und durch Adsorption zelladhäsionsvermittelnder Peptide (RGD) optimiert. Um den Zellablösungsprozess detaillierter zu untersuchen, wird hier zum ersten Mal der direkte Zellkontakt mit thermo-responsiven Oberflächen mittels oberflächensensitiver Mikroskopie (TIRAF) sichtbar gemacht. Mit dieser Technik sind die exakte Quantifizierung und die Analyse der Reduktion der Zelladhäsionsfläche während des Abkühlens möglich. Hierbei werden in Abhängigkeit von der Zelllinie Unterschiede im Zellverhalten während des Ablösens festgestellt: Zellen, wie eine Brustkrebszelllinie und eine Ovarzelllinie, die bekanntermaßen stärker mit ihrer Umgebung in Kontakt treten, vergrößern im Verlauf des Beobachtungszeitraumes den Abstand zwischen Zellmembran und Oberfläche, reduzieren jedoch ihre Zell-Substratkontaktfläche kaum. Mausfibroblasten hingegen verkleinern drastisch die Zelladhäsionsfläche. Der Ablösungsprozess wird vermutlich aktiv von den Zellen gesteuert. Diese Annahme wird durch zwei Beobachtungen gestützt: Erstens verläuft die Reduktion der Zelladhäsionsfläche bei Einschränkung des Zellmetabolismus durch eine Temperatursenkung auf 4 °C verzögert. Zweitens hinterlassen die Zellen Spuren, die nach dem Ablösen der Zellen auf den Oberflächen zurückbleiben. Mittels Kombination von TIRAF- und TIRF-Mikroskopie werden die Zelladhäsionsfläche und die Aktinstruktur gleichzeitig beobachtet. Die Verknüpfung beider Methoden stellt eine neue Möglichkeit dar, intrazelluläre Prozesse mit der Zellablösung von thermo-responsiven Oberflächen zu korrelieren. / Modern methods for single-cell analysis are becoming increasingly sensitive. At the same time, requirements for the sample material are on the rise. Today, sample preparation of adherent cells usually includes steps of enzymatic treatment to digest surface proteins thus, inducing cell detachment from culture substrates. This strongly limits the application of different techniques like patch clamp or labelling of extracellular domains of membrane proteins for flow cytometry. Therefore, a new cell detachment method is urgently required. In the present work, new PEG-based thermo-responsive polymers are used for cell culture for the first time. Here, non-destructive detachment of different cell lines from polymer-coated surfaces is realised by controlled temperature reduction. The surface functionality is systematically optimised by varying the concentration of the coating solutions, by artificial surface coating of a cell adhesion-mediating protein (fibronectin) and by co-adsorption of a cell adhesion-mediating peptide (RGD). For detailed analysis of the cell detachment process, TIRF microscopy is used to directly visualise the cell contacts on the thermo-responsive surfaces. Using this technique allows both the quantification and analysis of the reduction of the cell adhesion area during sample cooling. Furthermore, for several cell lines, different behaviours in cell detachment are observed. Cells that have close contact to their substrate like MCF-7 breast cancer cell line and CHO-K1 ovary cells increase the distance between cell membrane and surface, but there is only little decrease of cell-substrate adhesion area. In contrast, L929 fibroblasts reduce the cell adhesion area drastically. Furthermore, the hypothesis that the cell detachment is an active process is shown by lowering the cell metabolism by temperature reduction to 4 °C and by the cell traces that are left behind after rinsing the surfaces. A combination of TIRAF and TIRF enables visualising the cell adhesion area and actin structures. Measuring both parameters simultaneously opens up new possibilities to correlate intracellular and cell detachment processes on thermo-responsive surfaces.

In dieser Arbeit wird die Entwicklung und Charakterisierung neuer „smarter“ Redoxhydrogele mit drei verschiedenen funktionellen Eigenschaften und deren erfolgreicher Einsatz zur elektrochemischen Kontaktierung von Oxidoreduktasen beschrieben. Diese neuen Redoxpolymere 1. tragen kovalent integrierte Redoxzentren umgeben von einer hydrophilen Polymermatrix, 2. reaktive Kopplungsgruppen für den Aufbau selbstassemblierter Polymerschichten auf Elektrodenoberflächen und 3. lassen sich in ihrer Redoxaktivität durch Verwendung „intelligenter“ Polymere über externe Stimuli kontrollieren. Die Redoxhydrogele wurden nach dem Vorbild eines Baukastensystems in einfachen Ein-Stufen-Synthesen synthetisiert. Dazu wurden verschiedene Redoxzentren (Ferrocen, 1,10-Phenanthrolin-5,6-dion und 4-Carboxy-2,5,7-Trinitro-9-fluorenon), reaktive Kopplungsgruppen (Epoxy-, Amino-, Thiol- oder Disulfidfunktionen) und Polymermatrices (Poly-(N-Isopropylacrylamid) (PNIPAM) und Poly(ethylenglykolmethacrylat) (PEGMA)) in unterschiedlichen Zusammensetzungen miteinander copolymerisiert. Die Polymere wurden in Form von dünnen Polymerfilmen über die wiederholenden Funktionalitäten auf Elektrodenoberflächen aufgebracht und physiko- und elektrochemisch charakterisiert. Durch die erstmals gezeigte, derartige Ankopplung der Polymere, entstehen dreidimensionale, hydrophile selbstassemblierte Polymerschichten. Die Elektronentransferwege sind kurz und der Elektronentransfer effizient. Diese Polymer-modifizierten Elektroden wurden für die Kontaktierung von zwei exemplarisch ausgewählten Oxidoreduktasen eingesetzt, die Nicotinsäureamid-adenin-dinucleotid-abhängige Glucosedehydrogenase (NAD-GDH), welche ein freibewegliches Coenzym und die Pyrrolochinolinchinon-abhängige Glucosedehydrogenase (PQQ-GDH), welche ein prosthetisches Coenzym verwenden. Die Redoxaktivitäten des PNIPAMFoxy- und PEGMA-Fc-Polymers ließen sich durch externe Stimuli in Form von Temperatur und Calciumkonzentrationen kontrollieren. Ein Modell für die Komplexierung der Calciumionen durch die PEG-Seitenketten unter Ausbildung Kronenether-ähnlicher Strukturen und der daraus resultierenden Steigerung des Elektronentransfers wurde gezeigt. / This work describes the development and characterization of new, smart redox polymeres with three functionalities and their use in electrochemical wiring of oxidoreductases. These polymers 1. bear redox-active sites surrounded by hydrophilic polymeric matrix 2. surface-reactive groups to create self-assembled monolayers on electrodes 3. ionic-tunable redox activities by using stimuli-responsive polymers The syntheses of the redoxpolymers were resolved in simple one-step approaches using a building block system. Different mediators (ferrocene, 1,10-phenanthroline-5,6-dione and 4-carboxy-2,5,7-trinitro-9-fluorenone), reactive anchoring groups (groups epoxide, amine, thiol and disulfide) and polymer matrices (poly-(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM), poly(ethylene glycol methacrylate) (PEGMA)) were copolymerized in different compositions. The polymers were anchored to electrode surfaces via the repetitive functionalities and physico- and electrochemical characterized. This kind of anchoring of the redoxpolymers was shown for the first time and three-dimensional hydropilic self-assembled polymer monolayers are created. The electron transfer pathways are short and the electron tranfer efficient. The polymer-modified electrodes were applied for wiring two oxidoreductases, nicotinamide-adenine-dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase (NAD-GDH) with a diffusing coenzyme and the pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase (PQQ-GDH) with a prosthetic coenzyme. The redox activities of PNIPAMFoxy and PEGMA-Fc-SS are tuneable with external stimuli like temperature and calcium concentrations. A model for the complexation of calcium by PEG side chains and the explanation of the resulting effects was shown.

Predložená diplomová práce se zabývá syntézou biodegradabilních polyuretanu (bio-PU) na bázi polyethylenglykolu (PEG-u) a polykaprolaktonu (PCL) pro využití k medicínským úcelum. Cílem práce bylo vyvinout metodiku prípravy elastomerního polyuretanu, ze kterého by se dal v budoucnu pripravit skafold (nosic bunek) použitelný v tkánovém inženýrství pro humánní regenerativní medicínu. Teoretická cást práce shrnuje informace o materiálech využitelných pro zamýšlenou aplikaci. Zahrnuty jsou také techniky prípravy skafoldu, jejich biokompatibilita a charakterizace vlastností výsledného materiálu. Praktická cást je pak zamerena na navržení vhodné metodiky pro prípravu funkcních vzorku obsahujících PEG, PCL, hexamethylen-diisokyanát (HMDI) a ethylhexanoát cínatý jako katalyzátor. U pripravených vzorku byl zjištován vliv jejich složení (predevším ruzný obsah a molekulová hmotnost PEG-u) na botnání a hydrolytickou stabilitu spolecne s testováním mechanických vlastností, sledováním kinetiky sítování a stanovením stupne konverze. Morfologie vzorku byla sledována pomocí optické mikroskopie, chemické složení bylo potvrzeno infracervenou spektroskopií a tepelné vlastnosti byly urceny diferencní kompenzacní kalorimetrií. Vývoj v metodice prípravy ukázal, že je nezbytné odstranit pred syntézou z výchozích látek veškeré necistoty, predevším vodu a kyslík, jinak vznikaly nedokonale zreagované vzorky s velkým obsahem póru ruzných velikostí. Syntéza všech vzorku probíhala pod dusíkovou atmosférou ve dvou krocích, kdy v prvním se pouze homogenizovaly oba polyoly (PEG i PCL) na vakuové lince pri 130 °C a ve druhém pak vznikaly výsledné bio-PU za pridání HMDI pri 65 °C v inertní atmosfére manipulacního boxu. Vzorky pak byly dopolymerovány ve forme pri 65 °C pod dobu 48 hodin v sušárne. Ruzné fyzikální podmínky metodiky vedly k príprave jak nepruhledných bílých filmu, tak i vzorku s viditelnou separací fází až po flexibilní transparentní filmy. Pozorování optickým mikroskopem vzorku s fázovou separací prokázalo prítomnost sférolitické struktury krystalické fáze PCL v amorfní fázi matrice PEG-u. Sledování kinetiky sítování pomocí soxhletovy extrakce potvrdilo maximální konverzi polymerace (96 %) již za 4 h dopolymerování v sušárne. Testování zkouškou v tahu ukázalo, že výrazný vliv na pevnost v tahu má isokyanátový index (pomer NCO/OH skupin). Molekulová hmotnost PEG-u ovlivnovala pevnost v tahu jen u vzorku zcela zesítovaných. Merení botnání vzorku ve vode prokázalo, že s rustem molekulové hmotnosti PEG-u roste i obsah vody (od cca 28 až po 58 hm.%) ve vzorcích. Také degradace filmu ve vode pri 37 °C probíhala dle predpokladu rychleji u vzorku s vyšší molekulovou hmotností PEG-u. V predložené diplomové práci bylo potvrzeno, že množstvím a molekulovou hmotností polyethylenglykolu je možné rídit hydrolytickou stabilitu výsledných biodegradabilních polyuretanových elastomeru.

Předkládaná dizertační práce se zabývá novým způsobem přípravy biodegradabilních polyuretanů (PU) a jejich modifikací biologicky aktivními celulózovými nanokrystaly. Literární rešerše se zaměřuje na bioresorbovatelné PU v tkáňovém inženýrství. Shrnuje příklady těchto PU elastomerů, skafoldů (nosičů buněk) i injektovatelných PU společně se způsoby biodegradace na netoxické produkty. Poslední část je zaměřena na nanocelulózu, která si získala pozornost díky svým pozoruhodným fyzikálním (velký specifický povrch, mechanické vlastnosti) a biologickým (biokompatibilita, biodegradabilita a nízká toxicita) vlastnostem jako materiál pro biomedicínu. V experimentální části byly charakterizovány amfifilní biodegradovatelné polyuretanové filmy (bio-PU) syntetizované bez použití rozpouštědla polyadiční reakcí z hydrofilního poly(ethylenglykolu) (PEG) a hydrofobního poly(e-kaprolaktonu) (PCL) jako makrodiolů společně s hexamethylen diizokyanátem. Připravené bio-PU filmy byly charakterizovány pro různé poměry jak mezi PEG/PCL, tak i mezi NCO/OH reagujícími skupinami (izokyanátový poměr). Bio-PU filmy projevily markantní nárůst mechanických vlastností při hmotnostním poměru PEG/PCL rovnému nebo menšímu než 20/80 díky vzniku krystalických domén PCL. Přítomnost PEGu zvyšovala schopnost bio-PU filmu absorbovat vodu i urychlila jeho hydrolytickou degradaci. Oproti tomu nižší absorpční schopnost a delší čas hydrolytické degradace materiálu způsobil vyšší izokyanátový poměr, a tedy i vyšší síťová hustota. Třetí část práce se zabývá přípravou polyuretanových nanokompozitů unikátní metodou bez použití rozpouštědla za využití bio-PU matrice a celulózových nanokrystalů buď nemodifikovaných, nebo povrchově roubovaných PEGem. Strukturní analýza prokázala, že přítomnost tyčinkovitých nanočástic způsobuje imobilizaci polymerních segmentů, v důsledku čehož se zvýšila tuhost a křehkost materiálu. Nastavením vhodného poměru mezi PEG/PCL, množstvím izokyanátu, či přídavkem modifikovaného nanoplniva může být bio-PU materiál "ušit na míru" s vhodnými mechanickými (houževnatost, tažnost) a fyzikálními (botnání, degradace) vlastnostmi. Díky přípravě bez použití rozpouštědla by mohly být připravené materiály využity v regenerativní medicíně např. jako cévní štěpy.

We report on a novel and simple approach to surface ligand design of CdSe-based nanocrystals (NCs) with biocompatible, heterobifunctional polyethylene glycol (PEG) molecules. This method provides high transfer yields of the NCs into aqueous media with preservation of the narrow and symmetric emission bands of the initial organic-capped NCs regardless of their interior crystal structure and surface chemistry. The PEG-functionalized NCs show small sizes, high photoluminescence quantum yields of up to 75%, as well as impressive optical and colloidal stability. This universal approach is applied to different fluorescent nanomaterials (CdSe/CdS, CdSe/CdSCdxZn1–xS, and CdSe/CdS/ZnS), extending the great potential of organic-capped NCs for biological applications.

The presented diploma thesis is focused on the preparation, characterization and study of membrane properties of liposomal systems which were composed of the neutral phosphatidylcholine (DPPC), cholesterol, negatively charged phosphatidylglycerol (DPPG), polyethylenglycol bounded to phosphatidylethanolamine (PEG5000–PE) and polycation N,N,N-trimethylchitosan (TMC). The influence of individual components and their concentrations on the average particle size, zeta potential and changes in the outer and inner part of the bilayer was investigated. In this matter, methods of dynamic and electrophoretic light scattering and fluorescence spectroscopy with the application of laurdan and DPH probes were used. Based on the above-mentioned parameters, concentrations of components that most suitably influence properties of liposomes in terms of the intended application were selected for the definite complex. It was managed to prepare a liposomal complex stealth liposome–N,N,N-trimethylchitosan, which, due to the optimized composition, could have suitable attributes as a drug delivery system for inhalation administration of biologically active substances.

No description available.