Les polykétides sont des composés naturels. Ces composés possèdent des rôles thérapeutiques variés tels que antifongiques, antibiotiques, anticancéreux, immunosuppresseurs ou encore anticholestérolémiques. Par conséquent, la recherche de nouvelles structures possédant des bioactivités diverses se révèlent être intéressante. Une stratégie prometteuse pour créer des nouveaux polykétides est l’ingénierie génétique des enzymes synthétisant ces molécules, les polykétide synthases modulaires (PKS), une approche désignée sous le terme de « biologie synthétique ». Pour ce faire, il faut comprendre de façon détaillée le fonctionnement de ces systèmes multienzymatiques. Plusieurs points restent à éclaircir, dont : i) le contrôle de la stéréochimie du polykétide ; et ii) l’interaction des sous-unités composant la PKS. Lors de ma thèse, j’ai identifié deux kétoréductases (KR) qui, introduites dans un contexte modulaire intrinsèquement non-épimérisant, sont capables d’épimériser le méthyle en Cα de façon efficace. Cependant, la modification de la stéréochimie du polykétide ne dépend pas exclusivement des propriétés intrinsèques de la KR mais aussi du contexte modulaire. J’ai également contribué à la réalisation d’un second projet, pour lequel notre équipe a mis en évidence une nouvelle classe de domaine de docking de PKS de type trans-AT présentant une nouvelle topologie. L’un des DD étudié est une protéine intrinsèquement désordonnée dont le repliement est induit par son partenaire. Nous avons caractérisé l’interface complète entre deux sous-unités de PKS de type trans-AT, révélant une chambre de réaction protégée dans laquelle les chaînes de polykétide peuvent croître / Polyketides are natural products which exhibit a variety of therapeutic activities, including anti-fungal, antibiotic, anticancer, immunosuppressant and anti-cholesterolemic properties. Given their medical and economic importance, there is significant interest in identifying new structures with new biological activities. A promising strategy to create such analogues is to genetically engineer the enzymes responsible for synthesizing these molecules, the modular polyketide synthases (PKSs), an approach referred to as ‘synthetic biology’. However, in order to increase the efficacy of this approach, we must understand in detail how the PKS multienzymes work. A number of issues remain to be clarified, including: i) polyketide stereocontrol, ii) the interaction of the component subunits PKS. During my thesis, I identified two ketoreductase (KR) domains which when introduced into an intrinsically non-epimerizing modular context, were able to efficiently epimerise at the Cα of a model polyketide. I also showed that the modular context in which the KR functions has an influence on the ultimate stereochemical outcome. I also made essential contributions to a second project, in which the group identified a novel family of docking domains (DD) in the trans-AT type of PKS which present a novel topology. One of the two model DDs studied is an intrinsically disordered protein whose folding is induced by its partner. Finally, we were able to visualize a complete intersubunit interface within a trans-AT PKS, revealing a protected reaction center in which polyketide chains can grow.

Le polymère de sporopollénine est un constituant majeur de l'exine, la partie externe de la paroi du grain de pollen. Son exceptionnelle résistance permet de les protéger des stress environnementaux de nature mécanique ou chimique. Il constitue une des clefs de la colonisation du milieu terrestre par les plantes. Au cours de ma thèse, j'ai caractérisé deux Polykétide Synthases (PKS-A et PKS-B) et deux Tétrakétide α-Pyrone Réductases (TKPR1 et TKPR2) d'Arabidopsis thaliana. Par immunolocalisation, hybridation in situ et des études de microscopie j'ai montré que ces protéines intervenaient dans la synthèse de la paroi pollinique. In vitro, les deux PKS catalysent la condensation de 2 ou 3 molécules de malonyl-CoA sur différents esters de CoA d'acide gras pour former les tri et tétrakétide α-pyrones correspondants, substrat de TKPR1 et TKPR2. In vitro, celles-ci réduisent la fonction cétone en alcool secondaire formant des composés hydroxylés, précurseurs du polymère de sporopollénine. Dans les cellules du tapétum, la synthèse des monomères de sporopollénine se déroule en quelques heures seulement. Par immunodétection et en fusionnant les protéines à la GFP, j'ai montré que ces enzymes se trouvent à la surface du réticulum endoplasmique à l'exception de TKPR2. Des expériences de HIS-pull-down, de FLIM-FRET et de double hybride nous ont ensuite permis de suggérer que ces protéines forment un métabolon. L'identification de gènes homologues dans de nombreuses espèces végétales y compris une mousse révèle que nous avons identifié une voie métabolique très ancienne conservée au sein des angiospermes.

Le polymère de sporopollénine est un constituant majeur de l’exine, la partie externe de la paroi du grain de pollen. Son exceptionnelle résistance permet de les protéger des stress environnementaux de nature mécanique ou chimique. Il constitue une des clefs de la colonisation du milieu terrestre par les plantes. Au cours de ma thèse, j’ai caractérisé deux Polykétide Synthases (PKS-A et PKS-B) et deux Tétrakétide α-Pyrone Réductases (TKPR1 et TKPR2) d’Arabidopsis thaliana. Par immunolocalisation, hybridation in situ et des études de microscopie j’ai montré que ces protéines intervenaient dans la synthèse de la paroi pollinique. In vitro, les deux PKS catalysent la condensation de 2 ou 3 molécules de malonyl-CoA sur différents esters de CoA d’acide gras pour former les tri et tétrakétide α-pyrones correspondants, substrat de TKPR1 et TKPR2. In vitro, celles-ci réduisent la fonction cétone en alcool secondaire formant des composés hydroxylés, précurseurs du polymère de sporopollénine. Dans les cellules du tapétum, la synthèse des monomères de sporopollénine se déroule en quelques heures seulement. Par immunodétection et en fusionnant les protéines à la GFP, j’ai montré que ces enzymes se trouvent à la surface du réticulum endoplasmique à l’exception de TKPR2. Des expériences de HIS-pull-down, de FLIM-FRET et de double hybride nous ont ensuite permis de suggérer que ces protéines forment un métabolon. L’identification de gènes homologues dans de nombreuses espèces végétales y compris une mousse révèle que nous avons identifié une voie métabolique très ancienne conservée au sein des angiospermes. / .onferes a high degree of resistance to various mechanical and chemical stresses. During the evolution, this properties enabled the plant to adapat to land conditions. We caracterized two Polyketide Sythases (PKSA and PKSB) and two Tetraketide -pyrone Reductases (TKPR1 and TKPR2). By immunolocalisation, in situ hybridization and microscopy analysis we showed those proteins are involved in the pollen wall synthesis.We investigated the in vitro activity of the recombinant proteins and showed that the two PKS catalyzed the condensation of 2 or 3 malonyl-CoA with various fatty acid CoA esters, producing the corresponding tri and tetraketides. We also demonstrated that the tetraketides produced by PKS were substrates of the TKPR1 and TKPR2. In vitro, they reduced the cetone function of the lateral chain to a secondary alcohol forming hydroxylated compounds involved in the polymerization of sporopollenin.In tapetum cells, the synthesis of sporopollenin monomers is achieved in a few hours. To explain the underlying metabolic rate, I studied the cellular organization of the metabolic pathway. By immunodetection and GFP fusion experiments I localized PKSA, PKSB and TKPR1 to the endoplasmic reticulum while TKPR2 was mainly cytosolic. Then, interaction studies by HIS pull-down, FLIM-FRET and double hybride experiments showed the occurrence of a metabolon localized to the ER. Finally, by phylogenetic analysis, we showed the conservation of the genes involved in sporopollenin biosynthesis pathway, from mosses to higher plants.

Les composés de type pyrrocidine sont des polykétides PKS-NRPS possédant des activités biologiques intéressantes comme antifongique ou antibiotique. La synthèse totale de ces composés est un réél challenge comme il est constitué de 10 centres chiraux et d'un macrocycle complexe. L'étude de leur biosynthèse pourrait être d'une aide importante afin de comprendre le mécanisme de formation de cette structure spéciale, et en particulier l'étape de la cyclisation complexe.Le précurseur linéaire de ces polykétides étant composé par une chaine nonakétide (partie PKS) et d'une L-tyrosine (partie NRPS), des hypothèses sur leur biosynthèse ont été émises dans cette thèse. Des expériences d'incorporation de précurseurs marqués ou non vont être réalisées dans différents milieux de culture en vue d'obtenir des informations sur cette biosynthèse, et plus précisément le passage du précurseur linéaire vers la structure polycyclique complexe. En parallèle, des supplémentations des cultures d'A. zeae avec des dérivés de la tyrosine seront faites dans le but d'obtenir des analogues pouvant avoir des activités biologiques nouvelles ou meilleures que les pyrrocidines. / Pyrrocidine and its related compounds are PKS-NRPS polyketides having biological interests such as antifungal or antibiotic activities. The total synthesis of these entities has been challenging since the family of hirsutellone is composed by 10 chiral centers and a complex macrocycle. Studying the biosynthesis of these compounds can be an asset for the comprehension of this special molecular structure, especially for the complex cyclization step. Knowing that the linear precursor of these molecules is constituted by a nonaketide chain (PKS part) and by an L-tyrosine (NRPS part), hypotheses about the biosynthesis of hirsutellone-related compounds have been developed in this thesis. Some incorporation experiments of labeled or unlabeled compounds has been done in different culture media in order to have more information about this biosynthesis, in particular the conversion of the linear precursor into this complex polycyclic structure. In parallel, the supplementation of L-tyrosine derivatives will help us to get some analogs of pyrrocidine which can have new or better activities than natural products.

Les polykétides sont des molécules complexes possédant des rôles thérapeutiques divers (antibiotiques, anticancéreux, immunosuppresseurs, etc..). Ces composés sont synthétisés par les polykétides synthases (PKS) qui présentent donc un intérêt certain. Une stratégie prometteuse et en développement, appelée biologie synthétique, consiste en l’ingénierie protéique des PKS pour produire de nouveaux polykétides. Cependant, un prérequis au succès de cette méthode est la compréhension du fonctionnement des PKS. En effet, les PKS sont des systèmes complexes composés de plusieurs sous-unités. Celles-ci comportent chacune un ou plusieurs modules responsable d’un cycle d’extension du polykétide. Les modules sont composés également de plusieurs domaines assurant chacun un rôle biosynthétique. Il est ainsi nécessaire de comprendre comment s’opère la communication entre domaines au sein d’un module. Pour cela, nous avons étudié le module 5 de la PKS synthétisant la virginiamycine M par une approche combinant la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS), la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la modélisation par homologie. Ainsi nous sommes parvenus à caractériser la structure en solution du module 5, mais également à positionner les structures à haute résolution des domaines à l’intérieur de l’enveloppe SAXS. De plus, notre étude de la dynamique du module 5 a montré que les deux domaines acyl carrier protein (ACP) composant le module semblent non-équivalents, et que l’ACP5b doit être doté d’une certaine mobilité afin d’être fonctionnel, ceci dû à la flexibilité du linker reliant les deux ACP. L’interaction entre les sous-unités consécutives est également primordiale pour assurer la fidélité de la synthèse des polykétides. Ces interactions sont assurées, au moins en partie, par des domaines de petite taille appelés « domaine de docking (DD) ». Jusqu’alors, les DD avaient été caractérisés uniquement chez les PKS de type cis-AT. Nous avons caractérisé une nouvelle classe de DD, la première chez les PKS trans-AT. Grâce à une approche pluridisciplinaire, nous avons montré que l’un des DD constitue probablement une protéine intrinsèquement désordonnée (IDP) : son interaction avec le DD partenaire induirait son repliement. Nous avons résolu la structure RMN d’une protéine de fusion entre les deux DD, affichant une nouvelle topologie pour une interaction protéine-protéine. Cette interface de docking a ensuite été replacée dans son contexte modulaire par SAXS. Contrairement aux autres DD qui ne forment qu’une seule interface de docking, ces DD forment deux complexes de docking à l’intersection des deux sous-unités. Nos données SAXS nous avons également permis de proposer un modèle de l’interface créée entre deux sous-unités PKS dans laquelle une chambre réactionnelle est formée, qui pourrait servir à protéger des intermédiaires réactifs de polykétide. Des enzymes post-PKS interviennent suite à la synthèse du polykétide pour maturer ce dernier. Cette étape est d’une importance considérable puisqu’elle confère la structure et l’activité finale du polykétide. Dans ce contexte, nous avons mené une étude structure/fonction de l’enzyme post-PKS catalysant la macrocyclisation de l’antibiotique lankacidine C. Après un phasage par SAD sur la protéine séléniée, nous avons résolu la structure de l’enzyme en complexe avec des analogues de substrats, puis procéder à la conception de mutants pour résoudre la structure de l’enzyme avec son substrat naturel / Polyketides are structurally complex molecules which exhibit diverse therapeutic activities (antibiotic, antitumor, immunosuppressant…). These compounds and the enzymes responsible for their synthesis, the polyketide synthases (PKSs), are thus of significant biomedical interest. An emerging though promising strategy for the generation of novel polyketides is the engineering of the PKS proteins, an approach called synthetic biology. Nevertheless, a fundamental understanding of the mode of operation of the PKS enzymes is directly correlated with the success of this methodology. Indeed, PKSs are molecular-scale assembly lines which are composed of several subunit, each of which includes one or several modules catalyzing a polyketide elongation cycle. The module themselves are composed of several domains each with a specific role in the biosynthesis. It is therefore necessary to understand how the domains within a module communicate with each other. To address this question, we studied module 5 of the PKS responsible for virginiamycin M using an approach combining small angle X-ray scattering (SAXS), nuclear magnetic resonance (NMR) and homology modeling. This strategy allowed us to characterize the solution structure of module 5, but additionally to position high-resolution domain structures inside the SAXS envelopes. We also studied the dynamics of module 5, demonstrating that the two component acyl carrier proteins (ACPs) appear to be non-equivalent, and that the function of ACP5b is likely dependent on the mobility conferred on it by the flexible linker between the two domains. The interaction between the consecutive subunits is also critical to ensuring the fidelity of polyketide synthesis. This communication is assured, at least in part, by small domains called docking domains (DD), which have to date only been characterized from cis-AT PKS. Here, we have identified a new class of DD, the first shown to be present in trans-AT PKSs. Using a multidisciplinary approach, we have demonstrated that the N-terminal DD (VirFG NDD) is likely to be an intrinsically disordered protein (IDP), whose interaction with its partner DD (VirA CDD) induces its folding. We have solved the NMR structure of a fusion protein between the two DD, revealing a new topology for a protein-protein interaction. This docking interface was then placed into its modular context by SAXS. In contrast to the other classes of DD which form a single docking complex, this new type of DD gives rise to two docking interfaces at the intersubunit junction. Finally, our SAXS data have allowed us to propose a model for the complete interface between two PKS subunits in which a reaction chamber is formed, which may allow reactive polyketide intermediates to be protected. Post-PKS enzymes catalyze maturation of the polyketide after its release from the last module of the PKS. This processing is critical as it yields the final structure and activity of the polyketide. In this context, we conducted a structure/function study of the post-PKS enzyme catalyzing the macrocyclisation of the antibiotic lankacidine C. After phasing by SAD using a seleniated protein, we solved the structure of the enzyme in complex with substrate analogues. We then proceeded to site-directed mutagenesis of specific residues, in order to solve the structure of the enzyme in complex with its natural substrate