M.Sc.(Med.), Faculty of Health Sciences, University of the Witwatersrand, 2009 / Community-acquired pneumonia (CAP) is a major cause of morbidity and mortality worldwide. Knowledge of the predominant agents associated with CAP locally is essential, as it represents the basis for empiric antibiotic treatment. The objective of this study was to establish polymerase chain reaction (PCR)-based methods that could be used to identify CAP pathogens. Real-time PCR assays were developed to detect 10 viral and 5 non-viral pathogens as well as 2 internal controls using SYBR Green I and TaqMan probes, in singleplex and multiplex reactions. Six multiplex assays, with sensitivities of 1-10 copies/μl, were successfully developed to simultaneously detect 12 organisms. These reactions were used to test a limited number of patient and simulated samples. Data from the real-time PCR methods compared favourably to those from commercially available conventional PCR kits. These detection methods could be used to complement each other in prevalence studies and in selected diagnostic applications.

Yu Man Him. / Thesis (M.Sc.)--Chinese University of Hong Kong, 2000. / Includes bibliographical references (leaves 45-50). / Abstracts in English and Chinese. / Abstract --- p.ii / Acknowledgement --- p.ii / Chapter 1. --- Introduction / The mitochondrion --- p.1 / The mitochondrial genome --- p.3 / Mitochondrial DNA and diseases --- p.7 / Circulating plasma DNA --- p.8 / Project aims --- p.8 / Chapter 2. --- Materials and Methods / Choice of gene quantification system --- p.9 / Real time quantitative PGR --- p.11 / 7700Sequence Detection System --- p.14 / The LightCycler ´ؤ an alternative fast analyzer --- p.15 / Quatntitation of starting copy number using real time PCR --- p.17 / Primer and probe design rules --- p.18 / Hot start PCR technique --- p.19 / Other anti-contamination measures --- p.20 / Test subjects --- p.21 / Sample processing --- p.23 / DNA extraction --- p.24 / Chapter 3. --- System Development / Choice of primer and probe sequences --- p.28 / Optimization of PCR conditions --- p.30 / Imprecision of TaqMan assays --- p.33 / MTRNR2 vs. MTCYB probes --- p.33 / Construction of standard curve --- p.35 / Chapter 4. --- Research Application / The trauma model --- p.37 / Plasma DNA as a marker for trauma severity --- p.37 / Results --- p.38 / Disussion --- p.41 / Chapter 5. --- Conclusion --- p.44 / Chapter 6. --- References --- p.45

Bartoneloses são infecções causadas por Bartonella spp e constituem zoonoses de importância crescente devido à gravidade da infecção em pacientes imunodeficientes. Existem muitas síndromes clínicas associadas às bartoneloses, desde quadros típicos de doença da arranhadura do gato até lesões cutâneas linfoproliferativas (angiomatose bacilar), ou granulomatosas em órgãos (peliose bacilar), passando por quadros neurológicos, oculares, endocardites e febre prolongada. O diagnóstico laboratorial deveria ser baseado em isolamento da bactéria em cultura, resultados de sorologias e exames imunohistoquímicos, porém estas técnicas não se encontram disponíveis em nosso meio. A Reação da Cadeia da Polimerase (PCR) tem sido utilizada para aprimorar o diagnóstico das bartoneloses, e o presente estudo teve como objetivo padronizar três sistemas de dupla amplificação para detecção de DNA de Bartonella henselae em amostras biológicas de pacientes com suspeita de bartonelose e determinar dentre os sistemas de dupla amplificação (nested-PCR), aquele com melhor desempenho. Os nested-PCR empregaram oligonucleotídeosiniciadores das sequências ITS, HSP e FtsZ da Bartonella spp. Foram incluídos 19 pacientes, sendo 14 crianças/adolescentes e cinco adultos, tendo oito deles referido contato com gatos. Dos pacientes, 10 não tinham doenças de base, e nove apresentavam doença de base (três evoluíram a óbito). Foram coletadas 25 amostras: 14 de sangue periférico, sete biópsias de gânglios, duas punções de gânglios e duas biópsias de pele. Do total de 19 pacientes, 14 tiveram resultados positivos por PCR, e considerando as 25 amostras, 18 foram positivas por PCR (nove amostras de sangue, cinco biópsias de gânglios, duas punções de gânglios e duas biópsias de pele). Dez das 18 amostras positivas por PCR só foram detectadas pelo nested-FtsZ (seis amostras de sangue periférico, duas punções de gânglios, uma biópsia de gânglio e uma biópsia de pele). A primeira amplificação do sistema HSP-PCR detectou uma amostra positiva em 25 (1/25 ou 4%), e após o nested-HSP este percentual foi de 24% (6/25). Na primeira amplificação do sistema ITS-PCR a positividade foi de 20% (5/25), e no nested-ITS 32% (8/25). Após a primeira amplificação do sistema FtsZ-PCR a positividade foi de 16% (4/25), e no nested-FtsZ foi de 72% (18/25). O teste de McNemar testou a concordância ou discordância dos resultados obtidos pelos três sistemas de nested-PCR e revelou que os mesmos foram discordantes, com superioridade do sistema nested-FtsZ em relação aos outros dois nested-PCR, sendo a diferença estatisticamente significante (p<0,05). Os resultados do presente estudo permitiram concluir que o nested-FtsZ apresentou vantagens para o diagnóstico das bartoneloses em relação aos outros sistemas testados, em materiais biológicos previamentedescritos na literatura (biópsias e punções de gânglios), e até mesmo em sangue periférico de pacientes sem doença de base. Além disso, foi possível determinar, no presente estudo, que as infecções foram causadas por B. henselae, uma vez que não houve nenhuma PCR positiva pelos outros dois sistemas que não tenha sido detectada pelo nested-FstZ, e este amplifica apenas DNA de Bartonella henselae após a segunda amplificação. / Bartonellosis are infections caused by Bartonella spp and this zoonosis is of growing importance due to the severity of infection in immunodeficient patients. Many clinical syndromes are associated with bartonellosis, varying from typical manifestations of cat scratch disease, to lymphoproliferative skin lesions (bacillary angiomatosis) or granulomatous ones in organs (bacillary peliosis), and also neurologic and ocular manifestations, endocarditis and prolonged fever. The laboratory diagnosis should be based on bacteria isolation in culture, serological tests and immunohistochemical examination, but these techniques are not available in our country. The Polymerase Chain Reaction (PCR) has been used to improve the diagnosis of bartonellosis, and this study has aimed at standardizing three nested-amplifications for detection of Bartonella henselae DNA in biological samples of patients with suspected bartonellosis, and establishing among the three nested-PCR, the one presenting with the best performance. Nested-PCR amplifications were performed using the ITS, the HSP and the FtsZ gene sequences of Bartonella spp. We included 19 patients, being 14 children / adolescents andfive adults, and eight reported contact with cats. From these patients, 10 had no underlying disease, and nine patients had underlying conditions (3 evolved to death). We collected 25 samples: 14 peripheral blood samples, seven lymph nodes biopsies, two lymph nodes punctures and two skin biopsies. From the total of 19 patients, 14 had positive results by PCR, and considering the 25 samples, 18 were positive by PCR (nine peripheral blood samples, five lymph nodes biopsies, two lymph nodes punctures and two skin biopsies). Ten of the 18 PCR-positive samples were only detected by the nested-FtsZ (six peripheral blood samples, two lymph nodes punctures, one lymph node biopsy and one skin biopsy). The first HSP-PCR amplification detected one positive sample in 25 (1 / 25 or 4%), and after the nested-HSP this percentage was 24% (6 / 25). In the first ITS-PCR amplification the positivity was 20% (5 / 25), and after the nested-ITS 32% (8 / 25). The first FtsZ-PCR amplification positivity was 16% (4 / 25), and after the nested-FtsZ it was 72% (18/25). The McNemar test was used to verify the concordance or discordance of the results obtained by the three nested-PCR systems and showed that they were discordant, with superiority of the nested-FtsZ in relation to the other two nested-PCR, being the difference statistically significant (p<0.05). The results of this study indicated that the nested-FtsZ showed advantages for the diagnosis of bartonellosis with respect to the other two systems when biological materials previously described in literature were tested (punctures and lymph nodes biopsies), and also in peripheral blood of patients without underlying conditions. Furthermore, it was possible to determine that the infections were caused byB. henselae, since there was no positive PCR results obtained by the other two systems that were not detected by the nested-FstZ, that only amplifies DNA from Bartonella henselae after the second round of amplification.

Introdução: A tuberculose (TB) é uma das infecções mais prevalentes na humanidade, sendo o comprometimento pulmonar a principal causa de morbimortalidade. A cultura é o padrão de referência para diagnóstico, porém apresenta baixa sensibilidade. Das formas extrapulmonares, a TB pleural é a mais comum e apresenta diagnóstico confirmatório difícil por ser paucibacilar e conter interferentes intrínsecos na amostra. A reação em cadeia da polimerase (PCR), por amplificar o DNA da micobactéria, apresenta-se como teste mais sensível que a cultura, sendo positivo em amostras que apresentam a partir de 102 UFC/mL (unidades formadoras de colônia por mL) de M. tuberculosis (MTB). Entretanto, quando utilizada em amostras de escarro, lavado broncoalveolar e/ou líquido pleural pode ter seu desempenho comprometido pela presença de inibidores intrínsecos da amostra (variáveis pré-analíticas) e pelas técnicas de amplificação e detecção (variáveis analíticas) utilizadas na reação. Objetivo: Avaliar a influência de variáveis pré-analíticas (concentração de células, hemácias e proteínas) na detecção do DNA do M. tuberculosis em amostras de escarro, lavado broncoalveolar (LBA) e líquido pleural (LP), utilizando combinações de métodos de extração/detecção. Métodos: Amostras de escarro, lavado broncoalveolar e líquido pleural de pacientes não infectados pelo M. tuberculosis foram obtidas através de indução à expectoração, broncoscopia respiratória e/ou toracocentese, respectivamente, em volumes suficientes para o estudo. Para testar o limiar de detecção do M. tuberculosis, as amostras foram preparadas \"in vitro\" de maneira a conter concentrações variadas dos interferentes pré-analíticos e de UFC/mL da micobactéria. Para a técnica de PCR, o DNA foi extraído pelo método de extração QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) e pelo AMPLICOR® Respiratory Specimen Preparation (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, USA) e amplificado e detectado por três métodos: 1) COBAS® TaqMan® MTB Test (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, USA); 2) MTB Q - PCR Alert Kit (Nanogen Advanced Diagnosis, Trezzano, Italy) e 3) \"in-house\" ou caseiro. Desta maneira, foram testadas as seguintes combinações: Extração Roche/detecção Roche (R/R); Extração Roche/detecção Nanogen (R/N); Extração Roche/detecção \"in house\" (R/IH); Extração Qiagen/detecção Roche (Q/R); Extração Qiagen/detecção Nanogen (Q/N) e Extração Qiagen/detecção \"in house\" (Q/IH). Resultados: Em amostras de escarro, a quantidade de células e de hemácias não interferiu na detecção do M. tuberculosis, com exceção do método de extração/detecção Roche. Nas amostras de LBA, médias e altas concentrações de células e altas concentrações de hemácias contribuíram para menor detecção do MTB quando utilizado o método de detecção Roche, enquanto que no líquido pleural, a concentração de hemácias foi a variável que mais interferiu na detecção do agente. Em ambas as situações a menor detecção foi obtida com a combinação Q/N. Conclusão: A qualidade pré-analítica das amostras biológicas recebidas no laboratório clínico pode interferir no desempenho diagnóstico dos testes moleculares. A escolha dos métodos de extração e detecção é de fundamental importância na sensibilidade analítica do teste, para garantia de melhores resultados, especialmente quando trabalhamos com amostras paucibacilares que contém potenciais inibidores da reação / Introduction: Tuberculosis (TB) is one of the most prevalent infections in humanity, and pulmonary compromise is the leading cause of morbidity and mortality. Culture is the reference standard for diagnosis, but has low sensitivity. Of the extrapulmonary forms, pleural TB is the most common and presents difficult confirmatory diagnosis due to be paucibacillary and to contain intrinsic interfering in the sample. The polymerase chain reaction (PCR), for amplifying DNA of the mycobacterium, appears as more sensitive test than the culture, with positive results from 102 CFU/ml (colony forming units per ml) of M. tuberculosis (MTB). However, when used in sputum samples, bronchoalveolar lavage and/or pleural fluid, this test can also have its performance compromised by the presence of intrinsic sample inhibitors (pre-analytical variables) and by the amplification and detection techniques (analytical variables) used in the reaction. Objective: To evaluate the influence of pre-analytical variables (concentration of cells, red blood cells and proteins) in DNA detection of M. tuberculosis from sputum, bronchoalveolar lavage (BAL) and pleural fluid (PF) samples by using combinations of extraction/detection methods. Methods: Samples of sputum, bronchoalveolar lavage and pleural fluid of patients not infected with M. tuberculosis were obtained by inducing sputum, respiratory bronchoscopy and/or thoracentesis, respectively, in sufficient volumes for the study. To test the detection threshold of M. tuberculosis, samples were prepared \"in vitro\" to contain variable concentrations of pre-analytical interfering and CFU/mL of mycobacteria. For PCR, DNA was extracted by two methods: the QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) and Respiratory Specimen Preparation Amplicor (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, USA) and amplified and detected by three methods: 1) COBAS® TaqMan® MTB Test (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, USA); 2) MTB Q - PCR Alert Kit (Nanogen Advanced Diagnosis, Trezzano, Italy) and 3) \"in-house\". Thus, the following combinations were tested: Roche extraction and detection (R/R); Roche extraction and Nanogen detection (R/N); Roche extraction and \"in house\" detection (R/IH); Qiagen extraction and Roche detection (Q/R); Qiagen extraction and Nanogen detection (Q/N) and Qiagen extraction and \"in house\" detection (Q/IH). Results: In sputum samples, the amount of cells and red blood cells did not interfere with M. tuberculosis detection, an exception for Roche extraction/detection method. In BAL samples, medium and high cell concentrations and high concentrations of red blood cells contributed to lower detection of MTB when using the Roche detection method, while in the pleural fluid, the concentration of red blood cells was the variable that most interfered with the MTB detection. In both situations, the smallest detection was obtained with the combination Q/N. Conclusion: The pre-analytical quality of biological samples received in the clinical laboratory can interfere with the performance of molecular diagnostic tests. The choice for the extraction/detection methods is of fundamental importance in the analytical sensitivity of PCR, in order to guarantee better results, especially when working with paucibacillary samples containing potential reaction inhibitors

Bartoneloses são infecções causadas por Bartonella spp e constituem zoonoses de importância crescente devido à gravidade da infecção em pacientes imunodeficientes. Existem muitas síndromes clínicas associadas às bartoneloses, desde quadros típicos de doença da arranhadura do gato até lesões cutâneas linfoproliferativas (angiomatose bacilar), ou granulomatosas em órgãos (peliose bacilar), passando por quadros neurológicos, oculares, endocardites e febre prolongada. O diagnóstico laboratorial deveria ser baseado em isolamento da bactéria em cultura, resultados de sorologias e exames imunohistoquímicos, porém estas técnicas não se encontram disponíveis em nosso meio. A Reação da Cadeia da Polimerase (PCR) tem sido utilizada para aprimorar o diagnóstico das bartoneloses, e o presente estudo teve como objetivo padronizar três sistemas de dupla amplificação para detecção de DNA de Bartonella henselae em amostras biológicas de pacientes com suspeita de bartonelose e determinar dentre os sistemas de dupla amplificação (nested-PCR), aquele com melhor desempenho. Os nested-PCR empregaram oligonucleotídeosiniciadores das sequências ITS, HSP e FtsZ da Bartonella spp. Foram incluídos 19 pacientes, sendo 14 crianças/adolescentes e cinco adultos, tendo oito deles referido contato com gatos. Dos pacientes, 10 não tinham doenças de base, e nove apresentavam doença de base (três evoluíram a óbito). Foram coletadas 25 amostras: 14 de sangue periférico, sete biópsias de gânglios, duas punções de gânglios e duas biópsias de pele. Do total de 19 pacientes, 14 tiveram resultados positivos por PCR, e considerando as 25 amostras, 18 foram positivas por PCR (nove amostras de sangue, cinco biópsias de gânglios, duas punções de gânglios e duas biópsias de pele). Dez das 18 amostras positivas por PCR só foram detectadas pelo nested-FtsZ (seis amostras de sangue periférico, duas punções de gânglios, uma biópsia de gânglio e uma biópsia de pele). A primeira amplificação do sistema HSP-PCR detectou uma amostra positiva em 25 (1/25 ou 4%), e após o nested-HSP este percentual foi de 24% (6/25). Na primeira amplificação do sistema ITS-PCR a positividade foi de 20% (5/25), e no nested-ITS 32% (8/25). Após a primeira amplificação do sistema FtsZ-PCR a positividade foi de 16% (4/25), e no nested-FtsZ foi de 72% (18/25). O teste de McNemar testou a concordância ou discordância dos resultados obtidos pelos três sistemas de nested-PCR e revelou que os mesmos foram discordantes, com superioridade do sistema nested-FtsZ em relação aos outros dois nested-PCR, sendo a diferença estatisticamente significante (p<0,05). Os resultados do presente estudo permitiram concluir que o nested-FtsZ apresentou vantagens para o diagnóstico das bartoneloses em relação aos outros sistemas testados, em materiais biológicos previamentedescritos na literatura (biópsias e punções de gânglios), e até mesmo em sangue periférico de pacientes sem doença de base. Além disso, foi possível determinar, no presente estudo, que as infecções foram causadas por B. henselae, uma vez que não houve nenhuma PCR positiva pelos outros dois sistemas que não tenha sido detectada pelo nested-FstZ, e este amplifica apenas DNA de Bartonella henselae após a segunda amplificação. / Bartonellosis are infections caused by Bartonella spp and this zoonosis is of growing importance due to the severity of infection in immunodeficient patients. Many clinical syndromes are associated with bartonellosis, varying from typical manifestations of cat scratch disease, to lymphoproliferative skin lesions (bacillary angiomatosis) or granulomatous ones in organs (bacillary peliosis), and also neurologic and ocular manifestations, endocarditis and prolonged fever. The laboratory diagnosis should be based on bacteria isolation in culture, serological tests and immunohistochemical examination, but these techniques are not available in our country. The Polymerase Chain Reaction (PCR) has been used to improve the diagnosis of bartonellosis, and this study has aimed at standardizing three nested-amplifications for detection of Bartonella henselae DNA in biological samples of patients with suspected bartonellosis, and establishing among the three nested-PCR, the one presenting with the best performance. Nested-PCR amplifications were performed using the ITS, the HSP and the FtsZ gene sequences of Bartonella spp. We included 19 patients, being 14 children / adolescents andfive adults, and eight reported contact with cats. From these patients, 10 had no underlying disease, and nine patients had underlying conditions (3 evolved to death). We collected 25 samples: 14 peripheral blood samples, seven lymph nodes biopsies, two lymph nodes punctures and two skin biopsies. From the total of 19 patients, 14 had positive results by PCR, and considering the 25 samples, 18 were positive by PCR (nine peripheral blood samples, five lymph nodes biopsies, two lymph nodes punctures and two skin biopsies). Ten of the 18 PCR-positive samples were only detected by the nested-FtsZ (six peripheral blood samples, two lymph nodes punctures, one lymph node biopsy and one skin biopsy). The first HSP-PCR amplification detected one positive sample in 25 (1 / 25 or 4%), and after the nested-HSP this percentage was 24% (6 / 25). In the first ITS-PCR amplification the positivity was 20% (5 / 25), and after the nested-ITS 32% (8 / 25). The first FtsZ-PCR amplification positivity was 16% (4 / 25), and after the nested-FtsZ it was 72% (18/25). The McNemar test was used to verify the concordance or discordance of the results obtained by the three nested-PCR systems and showed that they were discordant, with superiority of the nested-FtsZ in relation to the other two nested-PCR, being the difference statistically significant (p<0.05). The results of this study indicated that the nested-FtsZ showed advantages for the diagnosis of bartonellosis with respect to the other two systems when biological materials previously described in literature were tested (punctures and lymph nodes biopsies), and also in peripheral blood of patients without underlying conditions. Furthermore, it was possible to determine that the infections were caused byB. henselae, since there was no positive PCR results obtained by the other two systems that were not detected by the nested-FstZ, that only amplifies DNA from Bartonella henselae after the second round of amplification.

Introdução: A tuberculose (TB) é uma das infecções mais prevalentes na humanidade, sendo o comprometimento pulmonar a principal causa de morbimortalidade. A cultura é o padrão de referência para diagnóstico, porém apresenta baixa sensibilidade. Das formas extrapulmonares, a TB pleural é a mais comum e apresenta diagnóstico confirmatório difícil por ser paucibacilar e conter interferentes intrínsecos na amostra. A reação em cadeia da polimerase (PCR), por amplificar o DNA da micobactéria, apresenta-se como teste mais sensível que a cultura, sendo positivo em amostras que apresentam a partir de 102 UFC/mL (unidades formadoras de colônia por mL) de M. tuberculosis (MTB). Entretanto, quando utilizada em amostras de escarro, lavado broncoalveolar e/ou líquido pleural pode ter seu desempenho comprometido pela presença de inibidores intrínsecos da amostra (variáveis pré-analíticas) e pelas técnicas de amplificação e detecção (variáveis analíticas) utilizadas na reação. Objetivo: Avaliar a influência de variáveis pré-analíticas (concentração de células, hemácias e proteínas) na detecção do DNA do M. tuberculosis em amostras de escarro, lavado broncoalveolar (LBA) e líquido pleural (LP), utilizando combinações de métodos de extração/detecção. Métodos: Amostras de escarro, lavado broncoalveolar e líquido pleural de pacientes não infectados pelo M. tuberculosis foram obtidas através de indução à expectoração, broncoscopia respiratória e/ou toracocentese, respectivamente, em volumes suficientes para o estudo. Para testar o limiar de detecção do M. tuberculosis, as amostras foram preparadas \"in vitro\" de maneira a conter concentrações variadas dos interferentes pré-analíticos e de UFC/mL da micobactéria. Para a técnica de PCR, o DNA foi extraído pelo método de extração QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) e pelo AMPLICOR® Respiratory Specimen Preparation (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, USA) e amplificado e detectado por três métodos: 1) COBAS® TaqMan® MTB Test (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, USA); 2) MTB Q - PCR Alert Kit (Nanogen Advanced Diagnosis, Trezzano, Italy) e 3) \"in-house\" ou caseiro. Desta maneira, foram testadas as seguintes combinações: Extração Roche/detecção Roche (R/R); Extração Roche/detecção Nanogen (R/N); Extração Roche/detecção \"in house\" (R/IH); Extração Qiagen/detecção Roche (Q/R); Extração Qiagen/detecção Nanogen (Q/N) e Extração Qiagen/detecção \"in house\" (Q/IH). Resultados: Em amostras de escarro, a quantidade de células e de hemácias não interferiu na detecção do M. tuberculosis, com exceção do método de extração/detecção Roche. Nas amostras de LBA, médias e altas concentrações de células e altas concentrações de hemácias contribuíram para menor detecção do MTB quando utilizado o método de detecção Roche, enquanto que no líquido pleural, a concentração de hemácias foi a variável que mais interferiu na detecção do agente. Em ambas as situações a menor detecção foi obtida com a combinação Q/N. Conclusão: A qualidade pré-analítica das amostras biológicas recebidas no laboratório clínico pode interferir no desempenho diagnóstico dos testes moleculares. A escolha dos métodos de extração e detecção é de fundamental importância na sensibilidade analítica do teste, para garantia de melhores resultados, especialmente quando trabalhamos com amostras paucibacilares que contém potenciais inibidores da reação / Introduction: Tuberculosis (TB) is one of the most prevalent infections in humanity, and pulmonary compromise is the leading cause of morbidity and mortality. Culture is the reference standard for diagnosis, but has low sensitivity. Of the extrapulmonary forms, pleural TB is the most common and presents difficult confirmatory diagnosis due to be paucibacillary and to contain intrinsic interfering in the sample. The polymerase chain reaction (PCR), for amplifying DNA of the mycobacterium, appears as more sensitive test than the culture, with positive results from 102 CFU/ml (colony forming units per ml) of M. tuberculosis (MTB). However, when used in sputum samples, bronchoalveolar lavage and/or pleural fluid, this test can also have its performance compromised by the presence of intrinsic sample inhibitors (pre-analytical variables) and by the amplification and detection techniques (analytical variables) used in the reaction. Objective: To evaluate the influence of pre-analytical variables (concentration of cells, red blood cells and proteins) in DNA detection of M. tuberculosis from sputum, bronchoalveolar lavage (BAL) and pleural fluid (PF) samples by using combinations of extraction/detection methods. Methods: Samples of sputum, bronchoalveolar lavage and pleural fluid of patients not infected with M. tuberculosis were obtained by inducing sputum, respiratory bronchoscopy and/or thoracentesis, respectively, in sufficient volumes for the study. To test the detection threshold of M. tuberculosis, samples were prepared \"in vitro\" to contain variable concentrations of pre-analytical interfering and CFU/mL of mycobacteria. For PCR, DNA was extracted by two methods: the QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) and Respiratory Specimen Preparation Amplicor (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, USA) and amplified and detected by three methods: 1) COBAS® TaqMan® MTB Test (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, USA); 2) MTB Q - PCR Alert Kit (Nanogen Advanced Diagnosis, Trezzano, Italy) and 3) \"in-house\". Thus, the following combinations were tested: Roche extraction and detection (R/R); Roche extraction and Nanogen detection (R/N); Roche extraction and \"in house\" detection (R/IH); Qiagen extraction and Roche detection (Q/R); Qiagen extraction and Nanogen detection (Q/N) and Qiagen extraction and \"in house\" detection (Q/IH). Results: In sputum samples, the amount of cells and red blood cells did not interfere with M. tuberculosis detection, an exception for Roche extraction/detection method. In BAL samples, medium and high cell concentrations and high concentrations of red blood cells contributed to lower detection of MTB when using the Roche detection method, while in the pleural fluid, the concentration of red blood cells was the variable that most interfered with the MTB detection. In both situations, the smallest detection was obtained with the combination Q/N. Conclusion: The pre-analytical quality of biological samples received in the clinical laboratory can interfere with the performance of molecular diagnostic tests. The choice for the extraction/detection methods is of fundamental importance in the analytical sensitivity of PCR, in order to guarantee better results, especially when working with paucibacillary samples containing potential reaction inhibitors

A novel probe was developed from genomic DNA of Helicobacter pylori ATCC type strain 43629. It hybridized with all 73 H. pylori clinical isolates tested but not with any of 183 non-H. pylori DNAs in dot blot hybridization. Typing tests revealed 41 different HaeIII-digestion patterns from 57 H. pylori strains tested. Based on the sequence of the probe, a nested PCR was developed that detected as little as 2 fg of H. pylori DNA or approximately equivalent to one cell. No PCR products were amplified from any of 21 non-H. pylori strains tested. Using this nested PCR, H. pylori DNA was detected in 33 of 45 (73%) saliva samples collected from patients with gastric H. pylori infection. These data suggest that the probe is useful for typing H. pylori and that the nested PCR is a valuable tool for detecting H. pylori DNA in saliva.

A doença de Wilson é um distúrbio da excreção biliar de cobre devido a um defeito na proteína ATP7B. Em caráter pioneiro na América do Sul, seqüenciou-se o gene ATP7B em 60 pacientes brasileiros pertencentes a 46 famílias; os resultados foram relacionados com aspectos demográficos e fenotípicos. Detectaram-se 25 mutações, 12 das quais novas. A 3402delC (34,8%) e a L708P (14,1%) ocorreu em 58,3% das famílias de São Paulo e em 44,4% das de Minas Gerais, respectivamente. As substituições novas, pesquisadas por RFLP ou PCR alelo-específica, não ocorreram em 60 indivíduos controle; portanto, não são polimorfismos comuns. O estudo comparativo de haplótipos dos portadores da L708P da coorte atual e de Gran Canaria sugeriu um efeito-fundador comum para ambos os grupos. O fenótipo variou amplamente para genótipos idênticos / ATP7B protein. As the first study of its kind in South America, the ATP7B gene was sequenced and the results were related to demographic and phenotypic aspects of 60 Brazilian patients, from 46 distinct families. Twenty-five mutations were detected, 12 of which are novel. The 3402delC (34.8%) and the L708P (14.1%) occurred in 58.3% of the families from Sao Paulo and in 44.4% of those from Minas Gerais, respectively. The novel substitutions were shown not to be common polymorphisms by RFLP or allele-specific PCR studies performed in 60 control subjects. Haplotype analysis comparing carriers of the L708P from this cohort study with patients from Gran Canary suggests the same founder-effect for both groups. Phenotype varied widely for identic genotypes.

A doença de Wilson é um distúrbio da excreção biliar de cobre devido a um defeito na proteína ATP7B. Em caráter pioneiro na América do Sul, seqüenciou-se o gene ATP7B em 60 pacientes brasileiros pertencentes a 46 famílias; os resultados foram relacionados com aspectos demográficos e fenotípicos. Detectaram-se 25 mutações, 12 das quais novas. A 3402delC (34,8%) e a L708P (14,1%) ocorreu em 58,3% das famílias de São Paulo e em 44,4% das de Minas Gerais, respectivamente. As substituições novas, pesquisadas por RFLP ou PCR alelo-específica, não ocorreram em 60 indivíduos controle; portanto, não são polimorfismos comuns. O estudo comparativo de haplótipos dos portadores da L708P da coorte atual e de Gran Canaria sugeriu um efeito-fundador comum para ambos os grupos. O fenótipo variou amplamente para genótipos idênticos / ATP7B protein. As the first study of its kind in South America, the ATP7B gene was sequenced and the results were related to demographic and phenotypic aspects of 60 Brazilian patients, from 46 distinct families. Twenty-five mutations were detected, 12 of which are novel. The 3402delC (34.8%) and the L708P (14.1%) occurred in 58.3% of the families from Sao Paulo and in 44.4% of those from Minas Gerais, respectively. The novel substitutions were shown not to be common polymorphisms by RFLP or allele-specific PCR studies performed in 60 control subjects. Haplotype analysis comparing carriers of the L708P from this cohort study with patients from Gran Canary suggests the same founder-effect for both groups. Phenotype varied widely for identic genotypes.

A Glutamina (Gln) melhora a regeneração hepática em ratos nutridos. Para avaliar o efeito molecular da Gln endovenosa no remanescente hepático, 52 ratos foram classificados em: 1. Nutridos com hepatectomia parcial (HP) e Gln (N-Gln=10) ou prolina (N-Pro=10); 2. Desnutridos com HP: (D-Gln=10) ou (D-Pro=10); 3. Nutridos e Desnutridos sem HP (N-Controle=6) e (D-Controle=6). Após 96 horas da HP os resultados foram: DNA = (D-Gln, D-Pro e D-Controle < N-Gln, N-Pro e N-controle), (N-Gln, N-Pro, D-Gln e D-Pro < N e D-Controle), (N-Gln > D-Gln); RNA= (N-Gln, N-Pro, D-Gln e D-Pro < N e D-Controle), (N-Gln > D-Gln e N-Pro). Não houve diferença nos genes transcritos (GT) para HGF, TGF-a e timidina kinase. Concluímos que: A desnutrição e HP reduzem DNA e RNA; A Gln não altera os GT estudados em ratos desnutridos 96 horas após HP / Glutamine dipeptide (Gln) improve hepatic regeneration of nourished rats. To evaluate molecular effect of Gln on liver remnant 52 rats was classified into: 1. Nourished with partial hepatectomy (PH) and Gln (N-Gln=10) or proline (N-Pro=10); 2. Malnourished (MN) with PH: (MN-Gln=10) or (MN-Pro=10); 3. Nourished and Malnourished rat without PH (N-Control=6) and (MN-Control=6). Results: DNA = (MN-Gln, MN-Pro and MN-Control < N-Gln, N-Pro and N-control), (N-Gln, N-Pro, MN-Gln and MN-Pro < N and MN-Control), (N-Gln > MN-Gln); RNA= (N-Gln, N-Pro, MN-Gln and MN-Pro < N and MN-Control), (N-Gln > MN-Gln and N-Pro). There was no difference on transcript genes (TG) for HGF, TGF-a and thymidine kinase. Conclusions: Malnutrition and PH decrease hepatic DNA and RNA; Gln does not modify TG studied 96 hours after PH in MN rats