Zugl.: Giessen, Universiẗat, Diss., 2007.

Zugl.: Berlin, Freie Univ., Diss., 2006 / Dateiformat: zip, Dateien im PDF-Format

Freie Universiẗat, Diss., 2006--Berlin. / Dateiformat: zip, Dateien im PDF-Format.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’apport des modèles de transplantation chez le rongeur pour des protocoles d’induction de tolérance chez l’homme est limité. La création d’un modèle pré-clinique visant à induire une tolérance aux allogreffes chez le gros animal comme le porc s’avère pertinent. L’activation de cellules dendritiques (DC) porcines par le CD40L ou le mélange de TNFa, d’INFa et de LPS augmente l’expression des molécules B7, induit l’expression de novo de CD25 et augmente leur capacité allostimulatrices. Par ailleurs, le CD40L ou le mélange TNF+INF+LPS induit des DC orientant la réponse allogénique vers Th1 et Th17. Les lymphocytes T régulateurs naturels CD4+CD25+ porcins ont été mis en évidence grâce à l’expression de Foxp3. Une stimulation de cellules CD4+ par la PHA en présence de TGFß induit l’expression de Foxp3. L’ajout de rapamycine maintien cette expression et renforce l’activité suppressive ce qui pourrait être expliqué par le fait que la rapamycine bloque l’expression d’IL 17 induite par le TGFß. / The contribution of rodent models of transplantation for protocols of induction of tolerance in humans has been disappointing. It therefore seems relevant to create a pre-clinic model in large animals. The activation of swine dendritic cells (DC) by CD40L or a combination of TNF+INF+LPS increases the expression of B7 molecules and induced de novo expression of CD25 on DC associated with an increase of allogeneic lymphocyte stimulation ability. In addition, CD40L and TNF+IFN+LPS induced DC polarizing to Th1 and Th17 response respectively. Swine natural CD4+CD25+ regulatory T lymphocytes have been highlighted through the expression of Foxp3. Stimulation of CD4+ cells by PHA and IL-2 in the presence of TGFß induces the expression of Foxp3 and the addition of rapamycin enhances the suppressive activity while maintaining the expression of Foxp3. Rapamycin blocks the expression of IL-17 induced by TGFß. This effect could explain the increase of the suppressive activity caused by rapamycin.

Einleitung: Das kontrollierte Zusammenspiel zwischen glatter Muskulatur und enterischen Nervenzellen ist eine essentielle Voraussetzung für einen auf die Erfordernisse der Verdauungsprozesse angepassten Transport des Chymus im Magen-Darm-Kanal. Obwohl es zahlreiche Untersuchungen zu den einzelnen Komponenten dieses Zusammenspiels gibt, liegen nur wenige Erkenntnisse zur simultanen Steuerung der Zirkulär- (ZM) und Longitudinalmuskulatur (LM) durch nervale Komponenten vor. Aus meiner Diplomarbeit war für diesen Zweck ein neues Messsystem hervorgegangen, das simultane Motilitätsableitungen an den verschiedenen Muskelschichten im Darm ermöglicht. Ziele der Untersuchungen: In der vorliegenden Arbeit sollte das neue Messystem zur funktionellen Charakterisierung intrinsischer nervaler Schaltkreise insbesondere im Hinblick auf die Beteiligung cholinerger und nitrerger enterischer Nervenzellen am porcinen Colon angewendet und evaluiert und mit der bisher verfügbaren, eindimensionalen Messmethode verglichen werden. Tiere, Material und Methoden: Die Untersuchungen erfolgten an Präparationen aus dem distalen Colon 21 adulter Schlachtschweine. Die Präparate bestanden aus ZM und LM und dem dazwischen liegenden myenterischen Plexus. Als Referenzmethode wurde die bisher standardmäßig eingesetzte eindimensionale Messmethode (Apparatur 1) angewendet. Diese beurteilte die Colonmotilität für ZM und LM getrennt voneinander, in je 2 Organbädern je Muskulaturrichtung, an Präparationen mit einer Größe von 1x3 cm. Mit dem neuen Messsystem (Apparatur 2) erfolgten simultane, zweidimensionale Motilitätsmessungen an je drei Messpunkten der ZM bzw. LM im Abstand von 2 cm innerhalb eines größeren Darmpräparates (5x5 cm). In beiden Messapparaturen wurden mittels elektrischer Feldstimulation (EFS) evozierte Nerv-Muskel-Antworten hervorgerufen. Diese EFS-Antworten setzten sich aus einer ON-Kontraktion (während der Stimulation) und einer OFF-Kontraktion (im unmittelbaren Anschluss an die Stimulation) zusammen. In Apparatur 2 erfolgte die EFS lokal an drei verschiedenen Positionen im Präparat. Es wurden in N=15 Versuchsansätzen vergleichende Untersuchungen zwischen Apparatur 1 und 2 zur Spontanmotilität sowie zu den nach EFS erzeugten Nerv-Muskel-Antworten gemacht. Um die Beteiligung intrinsischer cholinerger und nitrerger Komponenten in der Kontrolle der Darmmotilität zu untersuchen, wurden sowohl der Einfluss der cholinergen Antagonisten Atropin und Hexamethonium als auch eine Hemmung der NO- Synthese durch L-NAME (NG Nitro L arginine methylester Hydrochlorid) in je 3 Konzentrationsstufen und N=5 Versuchsansätzen je Hemmstoff erfasst. Für die statistische Analyse wurden nichtparametrischen Verfahren verwendet. Für Einstichprobentests wurde der Wilcoxon-Vorzeichenrangtest genutzt und zur Testung nach Unterschieden innerhalb von Gruppen der Test nach Friedman und der Post-hoc Test nach Wilcoxon mit angepasstem Signifikanzniveau für Mehrfachvergleiche nach Bonferroni. Paarweise Vergleiche erfolgten durch den Wilcoxon-Test. Ergebnisse wurden als statistisch signifikant bezeichnet, wenn das Signifikanzniveau (p) < 0,05 war. Ergebnisse: Apparatur 1 und 2 lieferten unter Kontrollbedingungen qualitativ gleichwertige Messergebnisse sowohl für die Spontanmotilität als auch für die EFS-Antworten an ZM und LM. Die Spontanmotilität wurde in beiden Messapparaturen durch die Hemmstoffe kaum beeinflusst. Zwischen den Messmethoden bestanden insbesondere an der LM teils signifikante Unterschiede in der Hemmstoffwirkung. Alle drei Hemmstoffe hatten an der LM in Apparatur 1 einen erregenden Einfluss auf die Spontanmotilität sowie die OFF-Antworten, während mit Apparatur 2 ein hemmender Einfluss festgestellt wurde. Mit Apparatur 2 gelang es, lokal begrenzt im Abstand von 2 cm enterische Neurone durch EFS zu erregen und deren Muskel-Antworten am Ort der Stimulation wie auch an weiter entfernten Messorten oral und anal der Stimulationsstelle zu detektieren. Unter Kontrollbedingungen waren die OFF-Antworten der ZM signifikant vom Ort der Stimulation abhängig. Die OFF-Kontraktionen waren an anal zur Stimulationsstelle gelegenen Messpunkten signifikant niedriger ausgeprägt, während sie oral zum Stimulationsort signifikant stärker waren als am Stimulationsort selbst. Atropin und Hexamethonium führten an der ZM zu einer signifikanten Hemmung der OFF-Antworten, blockierten diese allerdings nicht komplett und waren unabhängig vom Ort der Stimulation. L-NAME demaskierte insbesondere direkt am Stimulationsort signifikant lokal erregende Anteile der EFS-Antworten. Schlussfolgerungen: Die Spontanmotilität unterliegt im porcinen Colon, unabhängig von der Messmethode, kaum cholinergen und nitrergen Einflüssen. Unterschiede in den Ergebnissen zwischen den Messmethoden an der LM unter Hemmstoffeinfluss könnten Folge des Größenunterschiedes zwischen den Darmpräparaten sein und auf unterschiedliche Projektionslängen cholinerger wie auch nitrerger Neurone hinweisen. Acetylcholin ist zwar ein wichtiger, aber nicht der einzige Transmitter aus myenterischen Nervenzellen, der Muskelkontraktionen am porcinen Colon induziert. Nitrerge hemmende Motoneurone haben kurze Projektionslängen (< 2 cm) und die entfernt vom Stimulationsort registrierten EFS-Antworten wurden eher durch nicht-nitrerge Interneurone oder nicht-nitrerge lang projizierende hemmende Motoneurone vermittelt. Cholinerge Interneurone sind an den EFS-Antworten beteiligt und spielen sowohl bei den lokalen als auch bei den weiter vom Stimulationsort entfernt registrierten EFS-Antworten eine Rolle. Es ist mit dieser Arbeit gelungen, neue Erkenntnisse zu cholinergen und nitrergen enterischen Schaltkreisen am porcinen Colon zu gewinnen und eine neue Messmethode für zukünftige Untersuchungen zum Zusammenspiel von ZM und LM zu evaluieren und etablieren. Aufgrund der qualitativen Vergleichbarkeit der Messergebisse zwischen beiden Messapparaturen kann in Folgeuntersuchungen mit Apparatur 2 auf bestehende Befunde aus eindimensionalen Untersuchungen zurückgegriffen werden. Vertiefend können durch die simultanen Motilitätsmessungen an ZM und LM sowohl Ausbreitungsrichtung als auch Zeitunterschiede zwischen den spontanen sowie evozierten Motilitätsmustern beider Muskelschichten bewertet werden.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Funktionen des porcinen Colons 2.2 Aufbau des Colons 2.2.1 Makroskopischer Aufbau 2.2.2 Mikroskopischer Aufbau 2.3 Darmmotilität 2.3.1 Myogene Mechanismen 2.3.2 Gastrointestinale Hormone 2.3.3 Enterisches Nervensystem (ENS) 2.3.4 Extrinsische Steuerung 2.3.5 Motilitätsmuster im Colon verschiedener Tierarten 2.3.6 Spezielle Motilitätsmuster im porcinen Colon 2.4 Untersuchungen der Darmmotilität 2.4.1 Untersuchungen in vivo 2.4.2 Untersuchungen in vitro 2.5 Bedeutung der Befunde für die vorliegende Arbeit 3 Material und Methoden 3.1 Versuchsvorbereitung 3.1.1 Gewinnung des Organmaterials 3.1.2 Gewebeaufbereitung 3.2 Versuchsanordnung 3.2.1 Apparatur: 1: eindimensionale Motilitätsmessung 3.2.2 Apparatur 2: zweidimensionale Motilitätsmessung 3.2.3 Elektrische Feldstimulation (EFS) 3.2.4 Hemmstoffe 3.3 Versuchsdurchführung 3.3.1 Voruntersuchungen 3.3.2 Funktionelle Charakterisierung enterischer Schaltkreise 3.3.3 Datenauswertung und Statistik 4 Ergebnisse 4.1 Voruntersuchungen 4.1.1 TTX-Sensitivität der EFS-induzierten Muskelantworten 4.1.2 Funktioneller Ausschluss einer direkten EFS-Wirkung außerhalb des Stimulationsortes 4.2 Funktionelle Charakterisierung enterischer Schaltkreise 4.2.1 Spontanmotilität 4.2.2 Nerv-Muskel-Antworten nach elektrischer Feldstimulation 5 Diskussion 5.1 Methodendiskussion 5.2 Diskussion der Messergebnisse von Apparatur 1 und 2 5.2.1 Spontanmotilität 5.2.2 Nerv-Muskel-Antworten nach Elektrischer Feldstimulation 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis Danksagung

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