Ce travail de thèse s’est focalisé sur le développement des approches génériques de spectrométrie de masse (MS) pour la quantification des anticorps monoclonaux (mAbs) et de leurs produits dérivés dans des études précliniques. Premièrement, le développement des protocoles de préparation d’échantillons basée sur la digestion directe à partir de sérum ou comportant une étape d’immuno-précipitation spécifique par anticorps a permis la quantification des mAbs couvrant une large gamme d'étalonnage de cinq ordres de grandeur. En outre, l'emploi de peptides provenant de la région constante du mAb a démontré la polyvalence de telles approches génériques de chromatographie liquide en tandem MS (LC-MS/MS). Deuxièmement, les instruments de MS à haute résolution (HRMS) ont étés évalués dans le cadre de cette thèse en tant qu'alternative aux spectromètres de masse de type triple quadripôle traditionnellement utilisés pour l’analyse bottom-up quantitative. L’avantage majeur de l’intégration des analyseurs de HRMS a été associé à la possibilité de l’analyse quantitative simultanée des mAbs et leurs produits associés directement au niveau de la protéine fournissant un niveau d'informations bien au-delà de celui obtenu avec des approches bottom-up. Par conséquent, l’apport essential de la HRMS pour les analyses qualitative et quantitative des protéines thérapeutiques de type mAbs et produits associés a été démontré dans cette thèse. / This PhD thesis focused on the development of generic mass spectrometry (MS)-based workflows for monoclonal antibody (mAb)-related therapeutic protein quantification in pre-clinical species. First, the development of bottom-up sample preparation protocols either based on direct serum digestion or immuno-capture allowed mAb-related therapeutic protein quantification over five orders of magnitude whereas the employment of peptides from the constant region of the mAb demonstrated the versatility of such generic liquid chromatography tandem MS (LC-MS/MS)-based approaches. Second, high-resolution MS (HRMS) instruments were evaluated as an alternative to triple quadrupole mass analyzers, traditionally utilized for bottom-up mAb quantification by LC-MS/MS. The major benefit of HRMS incorporation into the workflow was associated with the possibility to quantify simultaneously mAb-related therapeutic proteins directly at an intact level, providing an information level far beyond the one obtained with bottom-up LC-MS/MS methodologies. Hence, the pivotal role of HRMS for the qualitative and quantitative analyses of mAb-related therapeutic proteins was further outlined throughout this doctoral work.

Avec 42 000 nouveaux cas diagnostiqués en 2012, le cancer colorectal (CCR) représente en France le troisième cancer en termes d’incidence. Les métastases, qui surviennent principalement au niveau du foie et des poumons, en constituent la principale cause de décès. Malgré les progrès récents de la chimiothérapie et des agents ciblés, le taux de survie à 5 ans des patients présentant un CCR métastasé reste faible. Aujourd’hui, la résection chirurgicale est le seul traitement curatif, cependant moins de 20% des patients porteurs de métastases sont opérables. Il existe donc un grand nombre de patients présentant un CCR métastasé pour lequel aucun traitement curatif ne peut être proposé. La formation des métastases à partir d’une tumeur primaire résulte d’une longue série d’étapes séquentielles liées les unes aux autres. L’issue de ce processus dépend à la fois des propriétés intrinsèques des cellules tumorales et de la réponse de l’hôte. Il a récemment été montré que les couples chimiokines/récepteurs interviennent dans le contrôle des différentes étapes de la progression tumorale.Le projet de recherche développé au cours de mon travail de thèse avait pour objectif d’utiliser les chimiokines et leurs récepteurs dans de nouvelles stratégies thérapeutiques pour bloquer et/ou éradiquer les métastases hépatiques et pulmonaires des CCRs. Le travail s’est articulé selon deux axes dans lesquels nous avons montré d’une part que, le blocage du récepteur de chimiokines CXCR7 permet de limiter les métastases pulmonaires de CCRs et d’autre part que, le transfert de gène codant CX3CL1 au niveau du foie entraîne une réponse anti-tumorale efficace dans les métastases hépatiques de CCRs. / With 42 000 newly-diagnosed patients in 2012, the colorectal cancer (CRC) represents the third type of cancer in terms of incidence in France. The leading cause of death from CRC is the development of metastases and these metastases will occur mostly within the liver (50% of the patients) and within the lungs (15%). Despite recent progress, notably in the chemotherapies now used and the targeted agents, the rate of 5-years survival for late stage CRC remains low. Nowadays, the surgical resection is the only curative treatment proposed to patients with metastatic CRC, however less than 20% of them have an operable tumour. There is therefore a high number of patients for whom no cure is currently available. A primary tumour’s dissemination to a second organ is the result of a long process made of numerous cross-linked steps. The final outcome of this process depends on the intrinsic properties of tumour cells as well as the host response. Recently, it has been shown that the chemokine-chemokine receptor pairs (initially described as regulating the leukocyte migration) play crucial roles in the various stages involved in tumour progression. The aim of the research project developed during my PhD was to assess the use of the chemokines and their receptors in new therapeutic strategies to block and/or eradicate the hepatic and pulmonary metastases of CRC. Our work has been organized along two main lines of approach. We have shown that the blockage of the CXCR7 chemokine receptor enables the limitation of the CRC metastases within the lungs and that the CX3CL1 gene transfer into the hepatocytes leads to an efficient anti-tumor response in the CRC metastases within the liver.

Le cancer de la prostate, premier cancer chez l’homme en France, a bénéficié largement des avancées thérapeutiques de la chirurgie, de la chimiothérapie, de la radiothérapie et, depuis une dizaine d’années, de l’hormonothérapie. Lorsque le cancer devient hormono-résistant, la chimiothérapie par docetaxel et prednisone est désormais le traitement de référence. Actuellement les traitements de deuxième ligne sont décevants et tout reste à faire. Notre travail a eu pour but d’évaluer l’impact de thérapies ciblées visant EGFR et VEGFR dans cette situation clinique actuellement très défavorable, données seules ou en association au docetaxel. Nous avons pour celà utilisé un modèle cellulaire PC3 xénogreffé sur la souris nude. Matériels et méthodesUn premier travail a consisté à tester l’efficacité anti-tumorale du sunitinib (agent anti-angiogénique), du cetuximab (agent anti-EGFR) et du docetaxel en monothérapies, bithérapies ou trithérapie in vivo, à partir d’une lignée cellulaire PC3 xénogreffée à la souris nude. Un deuxième travail a consisté à tester l’efficacité anti-tumorale du vandetanib (agent anti-VEGFR et anti-EGFR) associé ou non au docetaxel in vivo, à partir de deux lignées PC3 xénogreffées à la souris nude. Une lignée sauvage sensible au docetaxel, et une lignée résistante au docetaxel.Résultats :Dans notre premier travail, nous avons montré un effet supra-additif de l’association sunitinib – docetaxel et sunitinib - cetuximab, avec une bonne tolérance du traitement évaluée sur le poids des souris. Dans notre deuxième travail, le vandetanib n’a pas montré d’efficacité sur la souche sauvage, et même un effet activateur de croissance tumorale à faible dose. Sur la souche résistante, il n’a pas montré d’effet de resensibilisation au docetaxel. In vitro, il n’a pas montré d’effet modulateur sur MDR1.ConclusionSi le sunitinib a présenté des résultats intéressants dans le cadre de notre modèle préclinique pour le cancer de prostate hormono-résistant, il semble que le vandetanib soit à réserver éventuellement aux cancers de prostate hormono-résistants devenus docetaxel résistants, en deuxième ligne et en monothérapie, dans le cadre d’essais cliniques à venir. / Prostate cancer is the first male cancer men in France. Clinical benefits were realized during the ten last year’s concerning surgery, cytotoxic chemotherapy, hormonotherapy and radiotherapy. The reference treatment for homone-refractory prostate cancer combines docetaxel and prednisone. The current responses to second-line treatments are disappointing and considerable progress remains to be made. The aim of our studies was to test novel therapeutics approaches by combining docetaxel with EGFR and VEGFR targeting agents. Mice bearing well-established PC3 prostate tumors were used.MethodsThe aim of our first study was to test a rational therapeutic approach by combining docetaxel with an EGFR-targeting agent (cetuximab) and with an anti-angiogenic agent (sunitinib), using mice bearing PC3 prostate tumors.The aim of our second study was to test a novel therapeutic approach by combining docetaxel with vandetanib, a dual EGFR and VEGFR targeting agent. Mice bearing docetaxel-sensitive-or-resistant PC3 were used.ResultsIn our first study, supra-additive effects were observed with the sunitinib-docetaxel combination. Stable mean mouse weight suggested that no drug-induced toxicity was evident.In our second study, vandetanib had growth-stimulation effects at the smallest concentration on PC3 wild type, and no effect concerning the other conditions on PC3 wild type. MDR1 was expressed in PC3 resistant only, but was neither modulated nor its action inhibited, by vandetanib in vitro.ConclusionUse of sunitinib might support innovative strategies in the management of hormone-refractory prostate cancer, in our preclinical model. Concerning vandetanib, it would be use for hormone-refractory prostate cancer only after relapse under docetaxel, as a second-line treatment.

Le cancer de l'ovaire est la première cause de décès par cancer gynécologique. Cette thèse avait pour objectif la prospection de nouvelles solutions thérapeutiques fondées sur la délivrance prolongée d'agents anti tumoraux à l'aide de systèmes macromoléculaires de synthèse. L'un des obstacles majeurs était la disposition d'un modèle de tumeur pertinent chez l'animal. Après un examen bibliographique des connaissances acquises, le deuxième chapitre examine le potentiel d'un panel de xénogreffes dérivées de tumeurs ovariennes humaines directement greffées chez la souris immunodéprimée. Il est montré que les principales caractéristiques phénotypiques et moléculaires des tumeurs originales sont maintenues au niveau des greffes. Les résultats traduisent la présence d'une hétérogénéité intra-tumorale et d'une oligoclonalité au niveau des tumeurs primaires. L'ensemble confirme l'importance du choix du modèle tumoral pour l'évaluation de nouveaux traitements et l'étude des mécanismes aboutissant aux rechutes de la maladie et au développement d'une chimiorésistance. Un troisième chapitre traite l'exemple d'un système de délivrance prolongée fondé sur le couplage d'un agent antitumoral modèle, la doxorubicine, associé de diverses manières à un vecteur macromoléculaire biorésorbable, le poly(L-lysine citramide). Le premier conjugué obtenu par couplage direct sur le vecteur étant trop stable, divers systèmes ont été conçus pour obtenir la libération souhaitée. L'utilisation d'un bras espaceur clivable de type ester-hydrazone a fourni le meilleur résultat. Pour pallier la complexité de ces conjugués, une stratégie innovante fondée sur le piégeage de la doxorubicine dans une gélatine artificielle à base de poly(N-acryloyl glycinamide) est prospectée qui devrait permettre l'utilisation simultanée de plusieurs principes actifs piégés temporairement par voie physique dans un gel adhésif et fournir des solutions mieux adaptées aux contraintes cliniques des traitements intrapéritonéaux. / Ovarian carcinoma is the most lethal gynecologic malignancy. The aim of this PhD thesis was to develop new therapeutic approaches based on novel synthetic macromolecular drug delivery systems for intraperitoneal chemotherapy. These objectives were limited by the requirement of reliable tumor models for experimental studies. After a concise review of knowledge published in the literature, the potential interest of the establishment of a collection of tumor grafts derived from samples of human tumors is examined in a second chapter. Data show that the major phenotypic and genotypic features of the original tumors are maintained in the xenografts. They also confirm the importance of this tumor model to test new drugs and to analyze intratumoral heterogeneity and oligoclonality in primary ovarian carcinoma. The collection will be also helpful to study the mechanisms leading to disease recurrences and resistance to chemotherapies. An example of drug delivery system based on the different associations of a model chemotherapeutic drug (doxorubicin) with a bioresorbable macromolecular vector, namely poly(L-lysine citramide), is addressed in a third chapter. Direct amid linkage in the first conjugate was too stable with respect to antitumoral cytotoxicity desired after in vivo administration and different systems were generated subsequently to increase drug release in tumor deposits. The best results were obtained with a hydrazone cleavable spacer containing an ester group. To overcome the complexity of these conjugates, a novel strategy based on doxorubicin entrapment in a synthetic gelatin made of (poly(N-acryloyl glycinamide) is developed. This strategy should allow physical temporary entrapment of different drug molecules in a adhesive gel and could provide new solutions to the therapeutic challenges of intraperitoneal administration.

Le glioblastome (GBM) est une tumeur maligne du cerveau très agressive et actuellement incurable. Après le traitement standard, le GBM récidive toujours à cause de son caractère invasif et de sa résistance aux agents chimiothérapeutiques alkylants. Dans cette thèse, nous avons évalué la faisabilité, l'efficacité et la tolérance de l’hydrogel « nanocapsules lipidiques chargées en Lauroyl-gemcitabine » (GemC12-LNC) pour le traitement local du GBM. GemC12-LNC a été préparé par un procédé d'inversion de phase. Il est injectable, adapté à l'implantation cérébrale et capable de libérer de façon prolongée le médicament in vitro. Chez les souris saines, aucune inflammation, apoptose ou activation de la microglie n’a été observée après exposition à l'hydrogel, ce qui suggère que ce système est bien toléré. L'injection intra-tumorale de GemC12-LNC dans un modèle de GBM U87 sous-cutané et orthotopique a réduit de façon significative la croissance tumorale et a augmenté la survie médiane de l'animal par rapport aux contrôles, respectivement. De plus, en vue d’une meilleure relevance clinique, une technique de résection tumorale reproductible du GBM U87 et du gliosarcome 9L a été mise au point et l'hydrogel GemC12-LNC a réduit les récidives chez les souris et les rats, respectivement. En conclusion, l'efficacité et la tolérance de l’hydrogel GemC12-LNC ont été démontrées in vitro et in vivo. Cette formulation simple peut être injectée directement dans la cavité de résection du GBM, et combine les propriétés avantageuses des nanomédecines et des hydrogels. GemC12-LNC peut donc être considéré comme un système d'administration prometteur et innovant pour le traitement local du GBM. / Glioblastoma (GBM) is an aggressive malignant brain tumor characterized by rapid proliferation and propensity to infiltrate healthy brain tissue. Despite aggressive standard of care therapy GBM always recur, mainly because of its high invasiveness and chemoresistance to alkylating drugs. In this Thesis, we evaluate the feasibility, efficacy and safety of the nanomedicine hydrogel Lauroyl-gemcitabine lipid nanocapsule (GemC12-LNC) for the local treatment of GBM. GemC12-LNC was prepared by a phase-inversion technique process. It is injectable, adapted for brain implantation and able to sustainably release the drug in vitro. In healthy mice brain, no inflammation, apoptosis or microglia activation was observed after exposure to the hydrogel suggesting that this system is well tolerated and suitable for an application in the brain. Intratumoral injection of GemC12-LNC hydrogel in a U87subcutaneous and orthotopic GBM model significantly reduced tumor growth and increased the animal’s median survival compared to the controls, respectively. Moreover, to mimic the clinical setting, a reproducible tumor resection technique of U87 GBM and 9L gliosarcoma was developed and the GemC12-LNC hydrogel slowed down the formation of recurrences in mice and rats brain, respectively. In conclusion, the feasibility efficacy and safety of GemC12-LNC have been shown in vitro and in several preclinical in vivo models showing that this nanomedicine hydrogel is a promising and innovative delivery system for the local treatment of GBM. This gel can be directly injected in the GBM resection cavity, has a very simple formulation and combines the properties of nanomedicines and hydrogels.

La recherche dans le domaine de la prise en charge de la douleur, notamment chronique, a un besoind’innovation car les traitements disponibles à l’heure actuelle sont pour la plupart anciens et souventliés à des effets indésirables. Il est maintenant admis que les études précliniques de la douleur ont denombreuses limites : pertinence des modèles, utilisation d’une stimulation douloureuse surajoutée,détermination d’un simple seuil ou délai, prise en compte de la seule composante sensoridiscriminative…De ce fait, certaines molécules efficaces chez l’animal et donc prometteuses, n’ontpas eu les effets escomptés chez l’homme. La base de notre travail de recherche s’attache donc àproposer de nouvelles méthodes d’appréciation de la douleur chronique chez l’animal en prenant encompte ses aspects multidimensionnels. De nombreuses études ont mis en évidence une altération dela qualité de vie chez des patients atteints de douleur chronique. Cette altération se caractérisenotamment par des perturbations émotionnelles et cognitives. Ces paramètres ne sont pas toujours prisen compte chez l’animal dans l’évaluation de traitements antalgiques mais pourrdouleurnt amener denouvelles possibilités et perspectives précliniques. Notre travail a consisté à étudier l’impact de ladouleur sur les comportements spontanés (automatisation du test au formol), la composanteémotionnelle et les capacités cognitives chez le rongeur. Il a été complété par l’exploration du rôle del’amygdale dans les mécanismes impliqués dans ces modifications comportementales.L’amélioration du test au formol a été réalisée dans le but de visualiser au mieux les comportementsspécifiques observés lors d’une douleur aiguë de type inflammatoire. Notre adaptation a permis, chezles mêmes animaux, de pouvoir dissocier l’effet antalgique et l’effet sédatif d’une molécule à l’aided’une méthode automatisée plus rapide et moins subjective.Parallèlement, nous avons apprécié l’impact de la douleur chronique sur la composante émotionnelleet les performances cognitives dans deux modèles de douleur chronique (inflammatoire etneuropathique). Les animaux souffrant de douleur chronique inflammatoire présentent desperturbations plus importantes que les animaux neuropathiques, perturbations pouvant être amélioréespar un traitement pharmacologique. Des études mécanistiques utilisant des micro-injections demorphine au niveau de l’amygdale ont souligné une implication importante du complexe basolatéraldans ces composantes émotionnelles et cognitives de la douleur.Ces nouvelles approches comportementales pourrdouleurnt permettre de mieux caractériser l’impact globalde la douleur chronique chez l’animal et de compléter la batterie de tests couramment utilisés enpréclinique. Ceci pourrait déboucher sur une transposition plus réaliste des résultats obtenus chezl’animal à l’homme, et donc conduire à une meilleure prédictibilité clinique de l’efficacité destraitements. Enfin, la mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques innovantes implique l’étudedes mécanismes responsables de ces altérations comportementales. / Research in the field of pain management, including chronic pain management, needs innovationbecause available treatments are mostly old and often associated with many side effects. It is now wellrecognized that preclinical studies on pain have many limitations: the relevance of the models, the useof imposed painful stimulations, determination of simple thresholds or delays, taking into account thesensory-discriminative component of pain alone… Indeed, some molecules that are efficient inanimals and that are considered as promising, didn’t have the desired effect in humans. Therefore, thebasis of our research aims to propose new methods to assess chronic pain in animals taking intoaccount its multidimensional aspects. Many studies have shown impaired quality of life in patientssuffering from chronic pain. This alteration is characterized by emotional and cognitive disturbances.These components of pain are not always taken into account in animal when studying analgesictreatments, but could bring new preclinical possibilities and perspectives. Our work consisted instudying the impact of pain on spontaneous behaviours (automated formalin test), emotionalcomponent and cognitive capacities in rodents. This work has been completed by the exploration ofthe role of the amygdala in the mechanisms underlying those behavioural modifications.Improvement of the formalin test was conducted in order to better visualize the specific behaviorsobserved during an acute inflammatory pain. Our adaptation has allowed dissociating the analgesicand sedative effect of a molecule in a same animal, using an automated method which is faster and lesssubjective than the manual method.In the meantime, we assessed the impact of chronic pain on the emotional and cognitive performancesin two models of chronic pain (inflammatory and neuropathic). Animals suffering from chronicinflammatory pain have more important impairments than animal suffering from neuropathic pain,impairments that can be improved with a pharmacological treatment. Mechanistic studies using microinjectionsof morphine in the amygdala have emphasized an important involvement of the basolateralcomplex in these emotional and cognitive components of pain.These new behavioural approaches may help better characterize the overall impact of chronic pain inanimals and complete the battery of tests commonly used in preclinical studies. This could lead to amore realistic transposition of the results obtained from animals to humans, and thus lead to betterpredictability for the clinical efficacy of treatments. Finally, the identification of new targets forinnovative therapies involves the study of mechanisms responsible for these behavioral impairments.

Sanofi Pasteur travaille depuis plus de 20 ans au développement d’un vaccin contre la Dengue, maladie virale pouvant présenter des formes sévères. Ce vaccin, dénommé Dengue CYD est composé de quatre virus recombinants basés sur la souche vaccinale contre la Fièvre Jaune dans laquelle les gènes codant les protéines prM et E ont été remplacés par ceux des différents sérotypes de virus Dengue.Dans les études décrites ici, nous avons démontré la stabilité génétique des souches vaccinales au cours des étapes de production, et nous avons mis au point un système de qRT-PCR pour quantifier le génome viral afin de caractériser les lots et suivre les virémies post-vaccinales.De plus, différentes études précliniques menées chez le macaque ont permis :1) d’évaluer l’immunogénicité du vaccin après immunisation par différentes formulations vaccinales et selon différents schémas visant à réduire les interférences entre les sérotypes. L’administration de vaccins bivalents complémentaires à des sites anatomiques différents ou de façon séquentielle, l’établissement d’une pré-immunité hétérologue, une moindre dose relative du sérotype vaccinal dominant ou l’administration d’un rappel à un an ont ainsi permis de mettre en évidence des pistes d’amélioration du schéma vaccinal.2) d’évaluer la biodistribution et l’excrétion du vaccin afin de confirmer son innocuité.3) de tester la neutralisation d’un panel de souches virales par des sérums des singes vaccinés pour montrer que les anticorps induits par le vaccin peuvent neutraliser des souches Dengue circulantes d’origines géographiques et de génotypes variés.Enfin, l’absence de risque de dissémination du virus dans l’environnement via les tiques, arthropodes vecteurs d’autres Flavivirus, a été confirmée.Ces études ont permis d’apporter des éléments démontrant l’intérêt du vaccin Dengue CYD pour lancer des études cliniques et compléter les dossiers réglementaires visant à l’enregistrement du vaccin Dengvaxia® / Sanofi Pasteur has been working for more than 20 years to develop a vaccine against Dengue, viral disease that can cause life-threatening forms. The CYD Dengue vaccine is a tetravalent recombinant virus based on Yellow fever vaccine strain in which genes encoding prM and E proteins have been replaced by the corresponding genes from the different Dengue virus serotypes.In the studies described here, we demonstrated the genetic stability of the vaccine strains during the manufacturing steps and we set-up a qRT-PCR system to quantify viral genome in order to characterize batches and to follow post-vaccination viremia.In addition, different pre-clinical studies were conducted in macaques in order:1) To evaluate the vaccine immunogenicity after immunizations according to different schedules and formulations aiming at decreasing interferences between serotypes. Different parameters were shown to improve vaccine immunogenicity, such as administration of complementary bivalent vaccines at separate anatomical sites or sequentially, establishment of a heterologous pre-immunity, adaptation of the formulation by decreasing the dose of the dominant serotype or administration of a 1-year booster.2) To evaluate the biodistribution and shedding of the vaccine to confirm its safety3) To test neutralization by vaccinated-monkey sera of a panel of circulating viral strains to demonstrate that antibodies elicited by the vaccine should neutralize Dengue strains from different geographical origins and genotypesFinally, the absence of risk of dissemination of the virus in the environment via ticks, i.e. arthropods responsible for transmission of other Flaviviruses, was confirmed.These studies brought elements demonstrating the interest of the CYD Dengue vaccine to allow starting clinical trials and filing of technical dossiers supporting Dengvaxia® submission and registration

En raison du manque d'efficacité et de la toxicité des thérapies conventionnelles contre le cancer, la recherche s'est concentrée sur le développement de nouvelles stratégies. Ces efforts ont été à l'origine de l'essor de l'immunothérapie, dont les acteurs les plus récents sont les anticorps monoclonaux ciblant les points de contrôles immunitaires (PCI). Parmi ces inhibiteurs des PCI, on retrouve les anticorps ciblant la protéine de surface « Programmed Cell Death 1 », les anti-PD1, et ceux ciblant son ligand, « Programmed Cell Death Ligand 1 », les anti-PDL-1. Ces anticorps ont démontré une efficacité spectaculaire dans plusieurs types de cancers, et sont aujourd'hui couramment utilisés en clinique comme thérapies dans le mélanome, le cancer du poumon, de la vessie et du rein. Cependant, ces traitements ne profitent pas à tous les patients atteints de cancer, avec en moyenne 60% de résistance innée, et 25% de résistance acquise après une réponse primaire aux anticorps, variable selon le type de tumeur. Les phénomènes impliqués dans la résistance sont à l'heure actuelle peu connus. Ainsi, l'objectif de mon projet de recherche consistait à établir des modèles in vivo de résistance acquise aux anti-PD1 et anti-PDL 1. Pour ce faire, nous avons utilisé des tumeurs syngéniques de rein (RENCA), de vessie (MB49 et MBT-2) et de colon (MC38) et des souris immunocompétentes, que nous avons rendues résistantes aux traitements en les soumettant à des séries de réimplantation de tumeurs et de traitements, induisant une pression de sélection jusqu'à l'obtention d'un phénotype résistant. Le succès du blocage de l'axe PD1/ PDL-1 étant fortement lié à l'état du microenvironnement tumoral, nous avons mis en place un protocole d'immunophénotypage. Nous avons ainsi pu observer les cellules au profil « anti-tumoral », telles que les cellules T, les Natural Killer, et les macrophages M1, mais également les cellules ayant une fonction immunosuppressive, telles que les macrophages M2, les MDSC, les Treg. Enfin, certaines études ayant identifié une sur-régulation des PCI inhibiteurs alternatifs dans les cas de résistance acquise à l'anti-PD1, nous avons également observé l'expression de LAG3, TIM3 et TIGIT en plus de l'expression de PD1 et PDL-1. Nous avons ainsi pu déterminer que la résistance semble très fortement dépendante du modèle tumoral, même si nous avons pu identifier une diminution des macrophages M1 anti-tumoraux dans l'ensemble des modèles résistants à l'anti- PD1, et une augmentation des Treg dans les modèles résistants à l'anti-PDL-1, suggérant un mécanisme commun de résistance propre respectivement à l'anti-PD1 et à l'anti-PDL-1. Suite à l'identification par Zaretsky et al. de gènes impliqués dans la voie interféron dans des cas de résistance acquise de mélanome traité à l'anti- PD1, nous avons également décidé d'étudier le profil moléculaire des tumeurs résistantes. Cela nous a permis d'identifier 5 gènes communs entre les modèles anti- PD1 et anti-PDL-1 résistants, dont SERPINF1 et FCNA qui semblent prometteurs comme cibles à valider. Enfin, en parallèle de l'établissement et de la caractérisation des modèles de résistance acquise, nous avons testé de nouvelles approches thérapeutiques de potentialisation des anticorps anti-PD1 et anti-PDL-1 en combinaison avec des chimiothérapies de référence pour le cancer étudié. Nous avons ainsi démontré une potentialisation dans les modèles sauvages de cancer du côlon MC38 et de la vessie MB49, aucun effet de la combinaison dans le modèle de cancer du sein métastatique 4T1, et une inhibition de l'effet de l'anti-PDL-1 avec la combinaison dans le modèle de vessie MBT-2. L'immunophénotypage nous a permis de constater ici aussi des différences très importantes entre les modèles tumoraux, au niveau basal et après traitement [etc...] / Because of the limited efficacy and the toxicity of conventional therapies to fight cancer, researchers focused on the new trategies. These efforts lead to the emergence of immunotherapies, whose msot recent actors are the monoclonal antibodies targeting immune checkpoint (ICP). Among those ICP inhibitors, we found antibodies targeting the surface protein « Programmed Cell Death 1 », called anti- PD1, and those targeting its ligand, « Programmed Cell Death Ligand 1 », called anti- PDL-1. Those antibodies shown a great efficacy in a wide diveristy of cancers, and are currently used for clinical practice in the case of melanoma, lung cancer, bladder cancer and renal cell carcinoma. However, those treatments don’t benefit to all tumor bearing patients, with a mean of 60% of innate resistance, and 25% of acquired resistance following a primary response, variable according to tumor type. Phenomena involved in resistance are currently poorly described. In this context, the aim of my project was to establish in vivo preclinical models of acquired resistance to anti-PD1 and anti-PDL-1. To do that, we used syngeneic renal cancer (RENCA), bladder cancer (MB49 and MBT-2), and colorectal cancer (MC38), and immunocompetent mice, that we have made resistant by serial reimplantations of tumors pieces and serial treatments, inducing a selection pressure until we obtained a resistant phenotype. The efficiency of PD1/PDL-1 axis blocking is strongly linked to the microenvironment composition, as a result we realized an immunophenotyping protocol. We observed anti-tumor cells as T cells, Natural Killer cells, and M1 macrophages, but also cells harboring immunosuppressive functions, as M2 macrophages, MDSC, and Treg. Moreover, some studies have identified an upregulation of alternatives ICP in the context of acquired resistance to anti-PD1, so we also observed the expression of LAG3, TIM3 and TIGIT besides PD1 and PDL-1 expression. We shown that resistance is strongly dependant to the tumor model, even if we identified a decrease of anti-tumor M1 macrophages is models resistant to anti-PD1, and an increase of Treg in models resistant to anti-PDL-1, suggesting a common mechanism of resistance specific to respectively anti PD1 and anti-PDL-1. Following Zaretsky and al. identification of genes involved in interferon pathway in the case of acquired resistance to anti-PD1 in melanoma, we decided to study the molecular profile of resistant tumors. We identified 5 common genes differently modulated between anti-PD1 and anti-PDL-1 resistant models, including SERPINF1 and FCNA which seems to be promising as targets to validate. Lastly, in parallel to establishment and characterization of preclinical models of acquired resistance, we tested new therapeutical approches of anti-PD1 and anti- PDL-1 potentiation in combination with reference chemotherapies. We shown a synergy in wild-type colorectal and bladder cancers (MC38 and MB49), no effect of the combination in metastatic breast cancer 4T1, and an inhibition of anti-PDL 1 effect in bladder cancer MBT-2. Immunphenotyping of tumors allowed us to observe here also high differences between tumor models, both at baseline and after treatments initiation. To conclude, even if our results need a validation with patients samples, we demonstrated that different cellular and molecular modifications could be involved in resistance to anti-PD1 and anti-PDL-1, and that resistance could be bypass with chemotherapy combination, according to tumor type

Les glioblastomes (GBs) sont les tumeurs primitives du SNC les plus agressives de l’adulte. Les causes d’échec thérapeutiques sont multiples, comme une résistance des cellules tumorales à l’apoptose, l’existence de cellules souches cancéreuses ou un microenvironnement pro-tumoral. La découverte de molécules thérapeutiques qui pourraient avoir une action pléiotrope est particulièrement attractive. Dans ce contexte nous nous sommes intéressés aux mimétiques de Smac (MS), antagonistes des inhibiteurs de l’apoptose (IAP), qui inhibent le plus souvent cIAP1, cIAP2, XIAP et ML-IAP. Nous avons recherché si les IAP pouvaient être des cibles thérapeutiques dans les GBs humains en étudiant leur expression et leurs valeurs pronostiques éventuelles : les IAP sont exprimés dans les GBs et ML-IAP est associé à un plus mauvais pronostic. Nous avons choisi d’utiliser pour la suite de nos expériences, un MS qui avait une action sur les IAP et en particulier ML-IAP : le GDC-0152. Le GDC-0152 induit l’apoptose in vitro, augmente la survie des souris porteuses de GB et ralentit la croissance tumorale in vivo. Ensuite nous avons recherché si l’effet du GDC-0152 pouvait être différent en fonction du taux d'oxygène. En effet, les GBs sont des tumeurs hypoxiques. Nous avons cultivé en normoxie et en hypoxie, quatre lignées de cellules souches de GBs. En normoxie, le GDC-0152 induit la différenciation des cellules souches (voie NF-κB) et en hypoxie il induit l’apoptose et diminue la prolifération cellulaire (voie ATR).Ces travaux soulignent l’importance du modèle préclinique utilisé dans la caractérisation de l'effet de nouvelles molécules et le potentiel thérapeutique des MS dans les GBs. / Glioblastomas (GBs) are the most aggressive primary brain tumors in adults. The causes of therapeutic failure are unknown and are multiples, such as tumor cell resistance to apoptosis, the presence of cancer stem cells or a pro-tumor microenvironment. Thus, the discovery of therapeutic molecules with pleiotropic action is particularly interesting. In this context, we are interested in smac mimetics (SM), antagonists of inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) and most often antagonize cIAP1, cIAP2, XIAP and ML-IAP.We investigated whether IAPs could be attractive therapeutic targets in human GBs by studying their expression and their possible prognostic values. All IAPs were expressed in various degrees in GBs and ML-IAP was associated with a worse prognosis. Therefore, we chose GDC-0152 for the rest of our experiments because it antagonizes the different IAPs and in particular ML-IAP. We showed that GDC-0152 induces apoptosis in vitro, increases the survival of GB-bearing mice and slows tumor growth in vivo.We investigated whether the effect of GDC-0152 could be different depending on the oxygen level. Indeed, GBs are part of the most hypoxic tumors. For this purpose, four GB stem cell lines were grown in normoxia and hypoxia. We found that GDC-0152 has an anti-tumor effect regardless of oxygen level, but the signaling pathways involved were different. In normoxia, GDC-0152 induces differentiation of GB stem cells (NF-κB pathway) and in hypoxia it induces apoptosis and decreases cell proliferation (ATR pathway).This work highlights the importance of the preclinical model used in the characterization of a new molecule effects and the therapeutic potential of SM in GBs.

L’adénocarcinome épithélial de l’ovaire (CEO) est le cancer gynécologique le plus mortel. La recherche de nouvelles thérapies repose principalement sur des modèles précliniques 2D et in vivo avec des lignées cellulaires (LC) pour générer les évidences nécessaires à l’initiation d’essais cliniques. Ce processus requiert des fonds substantiels en recherche/santé qui est associé à un taux d’attrition élevé laissant supposer des lacunes dans le modèle actuel. Nos publications antérieures suggèrent que la sensibilité in vitro de nos LC du CEO à la chimiothérapie carboplatin varie en 2D ou 3D. Il reste à élucider lequel de ces modèles est le plus représentatif de la réponse in vivo. De ce fait, nous avons émis l’hypothèse que le modèle 3D refléterait plus étroitement la sensibilité in vivo. L’objectif de cette étude était de caractériser la réponse au carboplatin de nos LC du CEO en monocouches et en sphéroïdes (3D), puis de les comparer à leur réponse in vivo (xénogreffes). Un total de 6 LC du CEO a été injecté dans des souris qui ont reçues trois différentes concentrations de carboplatin. Leurs réponses ont été évaluées/classées selon leurs mesures de volume tumoral et l’immunofluorescence. Ces mêmes LC ont été ensemencées dans des plaques à très faible adhérence pour former des sphéroïdes et les traiter. Des analyses de cytométrie en flux ont été effectuées afin de classer les LC selon leur concentration inhibitrice médiane (CI50). Nous avons comparé le tout aux résultats 2D (CI50) précédemment publiés. Nos résultats montrent que le système 3D démontre la meilleure concordance avec le modèle in vivo. Notamment, notre LC ultra-résistance en 2D devient plus sensible en modèle murin ou encore en 3D. Inversement, une LC ultra-sensible en 2D est plus résistante en xénogreffe et en sphéroïde. Les résultats découlant de notre étude sont importants à considérer lors d’investissement de temps et de fonds dans les études de criblage et de prédiction de réponses thérapeutiques. / Epithelial ovarian adenocarcinoma (EOC) is the most lethal gynecological cancer. The drug discovery pipeline is heavily based on preclinical models. Typically, 2D cell line (CL)-based models are used to screen compounds followed by validation in animal models to generate the evidence needed to design clinical trials. This process incurs a high cost to the research pipeline and still results in high drug attrition rates. This may in part reflect the poor translation of preclinical to clinical results and points to deficiencies in modeling. Previous work from our laboratory shows that the sensitivity of our EOC CLs to carboplatin therapy varies between 2D and 3D in vitro models, however it is unclear how these differences align with the in vivo response. We hypothesize that 3D models will more closely reflect therapeutic in vivo response. The objective of this study was to characterize the carboplatin sensitivity of EOC CLs in 2D and 3D-spheroids and compare them to in vivo response using mouse xenografts. We injected mice with 6 different EOC CLs that were treated with 3 different carboplatin concentrations. Tumor volume measurements and immunofluorescence viability stains were used to categorize CLs by their sensitivity. The same CLs were seeded in low attachment plates to form, and thereafter treat, spheroids. Flow cytometry analysis was used to classify CLs by their 50% inhibitory response (IC50). The 2D response (IC50) for these CLs has previously been published. Our results show that therapeutic response changes significantly for a single CL between different systems, and the 3D model was most concordant with the in vivo model. Our ultra-resistant CL in 2D became more sensitive in 3D/mouse models. In contrast, the highly 2D sensitive CL became more resistant in our xenograft/spheroid models. The results are important to consider when investing time/funds in drug screening and therapeutic response prediction studies.