Outil d’évaluation des risques microbiologiques d’origine alimentaire, et d’optimisation des procédés de transformation, la microbiologie prévisionnelle ne considère pas l’influence de l’état physiologique des microorganismes sur leur comportement. L’objectif de ce travail est d’identifier des marqueurs permettant de rendre compte de l’impact de l’adaptation cellulaire face à un stress acide. Dans ce cadre, la résistance acide de Bacillus weihenstephanensis a été étudiée et des ARNm ont été identifiés en tant que biomarqueurs de résistance.(i) La résistance acide a été quantifiée via des méthodes culturales pour différents passés cellulaires. L’adaptation à un stress salin est défavorable à la résistance acide en comparaison à des conditions optimales de croissance ou à une adaptation spécifique au stress acide. Néanmoins,la résistance acide de B. weihenstephanensis est modulée de la même façon par l’acidité de l’environnement, indépendamment des conditions de culture préalablement rencontrées.(ii) Un outil basé sur la technologie Pall GeneDisc®a été développé pour permettre la quantification de l’expression génique par RT-qPCR.(iii) La corrélation des données Omic et de résistance acide a permis la sélection de biomarqueurs permettant de différencier les cellules les plus résistantes des cellules les plus sensibles présentent au sein d’une population bactérienne.(iv) Des corrélations linéaires et non linéaires ont également permis de définir des ‘direct biomarker’ qui correspondent aux gènes dont l’expression peut être linéairement corrélée à la résistance; et des ‘long-acting biomarker’ qui correspondent aux gènes dont l’expression transitoire est corrélée à une résistance acide stable.(v) Une analyse multivariée a été utilisée afin de prendre en compte les interactions entre l’expression des différents gènes impliqués dans la résistance acide et a permis la sélection de 9 gènes comme biomarqueurs de résistance acide. Enfin, des premières données prometteuses ont été obtenues. Il serait ainsi possible d’utiliser l’expression génique d’une population bactérienne à un instant donné pour prévoir sa survie dans un environnement létal. / Predictive microbiology is a tool to assess food microbiological risks and optimise food processes. However predictive microbiology which predicts the bacterial behaviour does not take bacterial physiological state into consideration. The aim ofthis work is to identify molecular biomarkers to assess the impact of bacterial adaptation on the subsequent acid resistance. In this study, the acid resistance of Bacillus weihenstephanensis wasinvestigated and mRNAs were identified as acid resistance biomarkers.(i) The bacterial acid resistance of different mildstress adapted cells was quantified using cultural methods. Mild salt-adapted cells were less resistant than cells grown in optimal conditions;and the latter less resistant than acid-adaptedcells. However, the bacterial resistance of B.weihenstephanensis followed the same patternwhen facing acidic changes of the environment and that, whatever the environmental condition previously encountered.(ii) For RT-qPCR gene expression quantifications a specific rotative PCR device based on the PallGeneDisc® Technology was developed.(iii) Omic data and bacterial acid resistances correlation allows the selection of biomarkers to track the more resistant and the more sensitive cells present within the bacterial population.(iv) Both linear and non linear correlations allowed to define two types of biomarkers: ‘Directbiomarker’ for which expression patterns uponmild stress treatment were linearly correlated to the subsequent acid resistance and ‘long-actingbiomarkers’ which were transiently up-regulatedduring mild stress exposure and correlated to increased acid resistance over time.(v) A multivariate analysis was performed to correlate the acid bacterial resistance and the gene expression of vegetative cells. This mathematical method provides the advantage to take gene expressions and their interactions into account and allowed the selection of 9 genes as acid resistance biomarkers of B. weihenstephanensis. Finally, some promising results were also obtained. There by, it would be feasible to use gene expression at a given time to predict the bacterialsurvival behaviour in lethal acid conditions.

La malària és encara avui en dia una malaltia que causa aproximadament un milió de morts a l'any a tot el món. La seva eradicació suposa un gran repte per a la humanitat i per a la comunitat científica, en particular. El cultiu in vitro del paràsit és essencial per al desenvolupament de nous medicaments. Els mètodes de cultiu actuals es basen en l'heurística i requereixen millores.En aquesta tesi es presenta una aproximació teòrica al procés d'infecció a eritròcits en cultius in vitro amb Plasmodium falciparum, un dels protozous paràsits causants de la malària. El treball està centrat en la construcció i avaluació de models d'una complexitat adequada per tractar els problemes específics detectats pels experts en l'àmbit, i inclou també la formulació d'algorismes de simulació i el disseny de protocols experimentals.Aquest tipus de treball requereix de la col·laboració multidisciplinària. La visió dels experts en malària es complementa amb la modelització i simulació, que permet la comprovació dels supòsits preestablerts, la comprensió de fenòmens observats i la millora dels mètodes de cultiu actuals. Així doncs, cal establir i desenvolupar eines que permetin crear, analitzar i compartir models amb grups que estudien la malària des d'altres perspectives. En aquesta tesi, s'ha optat per la modelització basada en l'individu (IbM) i orientada a la reproducció de múltiples patrons (PoM). El model s'ha formulat seguint l'ODD, un protocol estàndard en el camp de l'ecologia teòrica, que s'ha adaptat a la representació de comunitats microbianes.Els models basats en l'individu (IbMs) defineixen un conjunt de normes que regeixen el comportament de cada cèl·lula i les seves interaccions amb les altres cèl·lules i amb el seu entorn immediat. A partir d'aquestes regles, i tenint en compte una certa diversitat dins de la població i un cert grau d'aleatorietat en els processos individuals, els IbMs mostren explícitament el comportament emergent del sistema en conjunt. Complementàriament, s'han aplicat conceptes propis de la termodinàmica per tal d'entendrel'aparició de patrons macroscòpics a partir de l'estructura de la població (per exemple de la distribució de les fases d'infecció entre els glòbuls vermells infectats).Aquesta recerca ha comportat la la creació i aplicació del model i simulador INDISIM-RBC, que ha demostrat ser una bona eina per millorar la comprensió dels cultius estudiats. Es tracta d'un model mecanicista, basat en l'individu, que reprodueix quantitativament els patrons observats en cultius reals a diferents nivells de descripció, i que en prediu el comportament sota determinades condicions.Hem demostrat que INDISIM-RBC pot ser emprat per a estudiar en detall alguns aspectes del cultiu del paràsit causant de la malària que calia aclarir. Permet realitzar experiments virtuals i així impulsar noves línies de recerca i explorar noves tècniques de cultiu. En particular, INDISIM-RBC s'ha utilitzat per millorar els protocols experimentals actuals del cultius estàtics, definint la geometria òptima de l'hematòcrit i els protocols de subcultiu més adequats per als cultius continus.El treball realitzat en malària s'ha comparat amb la investigació duta a terme pel grup de recerca em relació amb d'altres comunitats microbianes. D'aquesta manera, podem estudiar les propietats emergents dels sistemes microbians en general en relació als efectes de la individualitat de la cèl·lula, la diversitat de les poblacions, l'heterogeneïtat en el medi, o el caràcter local de les interaccions, entre d'altres. Aquesta visió general proporciona eines conceptuals que poden ser emprades per refinar l'anàlisi dels processos d'infecció sota estudi. / Malaria is still a major burden that causes approximately one million deaths annually worldwide. Its eradication supposes a great challenge to the humanity and to the scientific community, in particular. In vitro cultivation of the parasite is essential for the development of new drugs. Current culture methods are based on heuristics and demand for specific improvements.The present thesis is a theoretical approach to in vitro cultivation of the protozoan parasite Plasmodium falciparum infecting human red blood cells. It mainly focuses on the process of building a model of appropriate complexity to deal with the specific demands above mentioned, but it also includes the formulation and implementation of algorithms, and the design and execution of experimental trials.This kind of work requires multidisciplinary collaboration: the insight of the experts in malaria research is complemented with modeling and simulation, which allows for checking settled assumptions, increasing the understanding on the system and improving the current culturing methods.The use of tools for building, analyzing and sharing models is an imperative to this end. In this thesis, Pattern-oriented Modeling (PoM) has been adopted as the most appropriate way for raising of models and the ODD protocol (Objectives, Design Concepts and Details) has been proposed as the standard tool for communicating them.Individual-based Modeling (IbM) has been used to tackle malaria culture systems. IbMs define a set of rules governing each cell, its interactions with others and with its immediate surroundings. From this set of rules, and taking into account diversity within the population and a certain degree of randomness in the individual processes, IbMs explicitly show the emerging behavior of the system as a whole. Methods from statistical thermodynamics have been applied to understand the emergence of macroscopic patterns from the population structure (e.g. distribution of infection stages among infected red blood cells).The research resulted in the development of the model and simulator INDISIM-RBC, which has proved to be a good tool to improve understanding of the cultures under study. It is a mechanistically rich individual-based model and it quantitatively reproduces and predicts several patterns observed in real cultures at different levels of description.We demonstrated that INDISIM-RBC can be used to study in detail several aspects of malaria cultivation that remained unclear, as well as to perform virtual experiments. Consequently, it can be used to open novel lines of research and to examine potential experimental techniques. INDISIM-RBC has also been used to improve the current experimental culturing protocols in static cultivation by obtaining the optimal geometry of the hematocrit layer and subcultivation periods in the continuous cultures.This study on malaria has been compared to the research carried out by the group regarding other microbial communities. Thereby studying general emerging properties of microbial systems in general, with regard to the effect of cell individuality, heterogeneity and diversity, the local nature of interactions; and biological and spatial complexity. In doing so, the acquired holistic view has been used to develop tools that allow for a better characterization and study of the infection process, in particular.

Orientador: Pilar Rodriguez de Massaguer / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-04T11:48:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LueraPena_WilmerEdgard_D.pdf: 1783533 bytes, checksum: 59fcd5288937a1e607c7124e74e4aef5 (MD5) Previous issue date: 2005 / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutor em Ciência de Alimentos

A ocorrência de surtos de doencas associadas aos vegetais minimamente processados (VMP) tem chamado a atenção para a sua segurança microbiológica. A avaliação quantitativa de riscos permite que o impacto das materias-primas e processamento seja avaliado e os resultados obtidos sejam usados para gestão e comunicação do risco. Desta forma, o presente estudo objetivou quantificar o risco de infecções por Salmonella spp. e Listeria monocytogenes a partir do consumo de VMP no Brasil. Um total de quinhentas e doze amostras de VMP foram analisadas e foi possivel enumerar e detectar Salmonella em 0,4% e 0,4% das amostras, respectivamente. L. monocytogenes foi enumerada e detectada em 0,97% e 3,1% das amostras analisadas, respectivamente. Os isolados de Salmonella spp. (n=4) e L. monocytogenes (n=69) foram confirmados por PCR e caracterizados por sorotipagem tradicional. Os isolados de L. monocytogenes foram caracterizados quanto ao ribotipo, resistencia ao cloro, taxa de multiplicação (µ), capacidade de formação de biofilmes e presença de genes de virulência. O sorovar predominante entre Salmonella spp. foi S. Typhimurium. Em relação a L. monocytogenes, observou-se prevalência do sorotipo 4b e do ribogrupo DUP-1038 e presenca de genes de virulência em 100% (inlA) e 97% (inlC e inlJ) dos isolados. A maioria dos isolados de L. monocytogenes foi resistente a exposição a 125 ppm de cloro livre, e todos foram capazes de aderir ao aco inox, atingindo concentracoes acima de 4 log UFC/cm2. Testes-desafio foram conduzidos para determinar o potencial de multiplicação (δ) de cepas de Salmonella e L. monocytogenes em nove diferentes tipos of VMPs armazenados a 7°C e 15°C por 6 dias. O armazenamento a 15°C por 6 dias resultou nos maiores aumentos nas populações de L. monocytogenes em couve picada (δ= 3,34) e rúcula ((δ= 3,22), enquanto para Salmonella, as maiores populações foram observadas em rúcula (δ= 4,05) e escarola (δ= 2,80). Testes-desafios posteriores indicaram que a multiplicação dos dois patógenos em VMP foi mais pronunciada quando os mesmos foram embalados sob atmosfera modificada em comparação a embalagem em filmes perfurados. Modelos preditivos primários e secundários descrevendo a taxa de multiplicação e tempo de lag de Salmonella spp. e L. monocytogenes em VMP em função da temperatura de armazenamento (7, 10, 15, 20, 25 e 30°C) foram gerados. Verificou-se que os modelos gerados apresentaram a precisão necessária e foram adequados para modelagem da multiplicação dos dois patógenos em VMP. Os modelos de avaliação quantitativa de risco (AQR) foram construidos para determinar a probabilidade de infecção por Salmonella spp. e L. monocytogenes devido ao consumo de VMPs. Os modelos construidos com base nos dados levantados da literatura indicaram risco de infecção por Salmonella spp. e L. monocytogenes de 8.66 x 10-3 e 1.87 x 10-8, respectivamente, sendo necessário que medidas de mitigação do risco sejam adotadas. / The occurrence of foodborne disease outbreaks linked to minimally processed vegetables (MPV) is concerning industries, consumers and governments worldwide. Quantitative risk assessments can estimate the impact of raw materials and processing practices and these estimates are used for risk management and risk communication. This study aimed at quantifying the risks of infection by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes due to consumption of MPV in Brazil. A total of five hundred and twelve samples of MPV were analyzed and Salmonella was detected and enumerated in 0.4% and 0.4% of the samples, respectively. L. monocytogenes was enumerated and detected in 0.97% and 3.1% of the samples analyzed, respectively. Isolates of Salmonella spp. (n=4) and L. monocytogenes (n=69) were confirmed through PCR and characterized by traditional serotyping. The isolates of L. monocytogenes were characterized for their ribotype, resistance to chlorine, growth rate, (µ) and ability to form biofilms and presence of virulence factors. Among Salmonella spp., S. Thyphimurium was the most prevalent serovar. Among L. monocytogenes, prevalence of serotype 4b and ribotype DUP-1038 was observed. Virulence gene inlA was present in 100% of the isolates, and genes inlC and inlJ in 97%. The majority of L. monocytogenes isolates were resistant to up to 125 ppm of free chlorine and all isolates were able to attach to stainless steel coupons, reaching populations of up to 4 log10 CFU/cm2. Challenge tests were carried out to determine the growth potential (δ) of Salmonella and L. monocytogenes in nine types of MPV stored at 7°C and 15°C for 6 days. The storage of MPV at 15°C for 6 days resulted in the greatest increases in L. monocytogenes populations in shredded collard green (δ= 3.34) and arugula (δ= 3.22), whereas for Salmonella, the highest populations were found in arugula (δ= 4.05) and escarole (δ= 2.80). Further challenge tests indicated that multiplication of both pathogens in MPV was more pronounced when these products were packaged under modified atmosphere in comparison to packaging in perforated films. Primary and secondary predictive models describing the growth rate and lag time of Salmonella and L. monocytogenes in MPV as a function of storage temperature (7-30°C) were generated. The generated models were accurate and suitable for modeling the growth of pathogens in MPVs. Quantitative risk assessment (QRA) models were built to determine the probability of infection by Salmonella and L. monocytogenes due to consumption of MPVs. The models built using data available in the literature indicated that the risks of infection by these pathogens were 8.66 x 10-3 and 1.87 x 10-8, respectively, evidencing the need for adoption of risk mitigation measures.

Dans ce travail, un modèle d'appréciation quantitative des risques microbiens a été développé pour proposer des mesures de maitrise sanitaire et les relier à des métriques du risque. A partir d'observations réalisées dans un hôpital, nous avons pu caractériser le procédé de fabrication et de distribution de deux plats de boeuf en sauce, de manière à prédire l'évolution du danger Clostridium perfringens tout au long de ce procédé en utilisant les outils de la microbiologie prévisionnelle. Dans le modèle d'exposition, nous avons construit un modèle décrivant la germination puis la croissance de Clostri- dium perfringens pendant deux étapes du procédé, et un modèle décrivant la destruction thermique finale des cellules végétatives de Clostridium perfrin- gens. Ensuite, pour estimer un risque de diarrhée lié à la consommation de ces plats, nous avons construit un modèle dose réponse. De manière à pouvoir prédire la gamme des situations possibles, nous avons cherché à décrire, dans chacun des modèles, la variabilité de la réponse biologique modélisée en utilisant des données issues de méta analyse, obtenues dans des conditions variées. L'utilisation de l'inférence bayésienne sur des données issues de méta analyse nous a permis de décrire séparément variabilité et incertitude, suivant les recommandations des instances internationales. Des simulations de Monte Carlo à deux dimensions sur l'ensemble du procédé nous ont ensuite permis d'estimer le risque moyen de maladie lié à la consommation des plats et d'estimer l'incertitude sur ce risque moyen. Ces simulations nous ont aussi permis d'identifier deux étapes importantes pour la maitrise du risque et de proposer, pour chacune de ces étapes, des mesures de maitrise sanitaire, dont nous avons ensuite mesuré l'efficacité. / In this study, a quantitative risk assessment model was developed in order to propose control measures making it possible to reach some `risk based' targets. A survey, carried out in an hospital, made it possible to describe a food chain, from raw material until consumption, of two beef-in-sauce products, such as to predict the evolution of Clostridium perfringens along the whole process using predictive microbiology tools. In the exposure assessment model, we described Clostridium perfringens germination, outgrowth and growth in a first model, applied on two process steps, and final thermal inactivation of Clostridium perfringens vegetative cells in a second model. Then, in order to estimate the risk of diarrhea after the consumption of the two products, we established a dose response model. In order to predict in our model the full range of possible outcomes, we aimed at describing, in each proposed model, the variability on the modelled biological response using meta analysis data, obtained on various experimental conditions. Performing Bayesian inference on these published data, we separated variability and uncertainty, according to recommendations of international organizations. Second order Monte Carlo simulations on the whole process made it possible to estimate the mean risk of diarrhea after to the consumption of the products and to estimate the uncertainty on this median risk. Based on these simulations, two key steps for food safety were then identified in the process, leading us to propose, for each step, control measures and to measure their efficacy.

L’objectif de ce travail est de développer une démarche permettant de prédire l’évolution de la charge microbienne à la surface de carcasses de porc lors d’un transport frigorifique selon les conditions opératoires (température et humidité de l’air de soufflage) et des conditions initiales (profil de température en sortie de chambre froide d’abattoir). La croissance microbienne dépendant notamment de la température et de l’activité de l’eau, il est nécessaire d’étudier les transferts de chaleur et de matière de type diffusif au sein des carcasses et de type convectif autour des carcasses. Ces derniers dépendent de la circulation d’air dans le véhicule frigorifique lorsqu’il est chargé de centaines de demi-carcasses ce qui rend la géométrie particulièrement complexe.De ce fait, ce travail fait appel à diverses disciplines : mécanique des fluides, transferts thermiques et microbiologie prévisionnelle. Le couplage de ces trois disciplines permet d’apporter des réponses scientifiques quant à la qualité sanitaire des carcasses de porc.En travaillant sur un dispositif expérimental reproduisant une semi-remorque chargée de carcasses de porc à l’échelle réduite, les écoulements d’air ont pu être caractérisés par vélocimétrie laser Doppler 2D dans deux configurations de distribution d’air (avec et sans conduits). De plus, les coefficients de transfert convectifs locaux ont pu être estimés à la surface de différentes parties des carcasses de porc et à différentes positions dans la semi-remorque à l’échelle réduite. Un schéma simplifié des écoulements d’air a été établi, il permet de localiser les « zones à risque » dans la semi-remorque chargée (faible circulation d’air et faible coefficients de transfert convectif).En se basant sur les résultats de l’étude expérimentale à l’échelle laboratoire et sur ceux récoltés au cours de vrais transports frigorifiques, la variabilité des paramètres caractérisant l’air circulant autour des carcasses a pu être estimée. Ces informations ont servi de conditions aux limites d’un modèle de transfert de chaleur et de matière (eau) au sein de la partie la plus sensible au niveau microbiologique: le jambon. Ce modèle 3D, résolu par la méthode des éléments finis, permet de prédire l’évolution de la température, de la teneur en eau et de la charge microbienne (Pseudomonas) à la surface de la partie maigre du jambon pour différents scénarios de transport frigorifique. Les résultats ont montré que si le transport commence alors que le cœur des carcasses est encore tiède (15°C au lieu de 7°C selon la réglementation actuelle) la croissance des microorganismes à la surface des carcasses de porc n’est globalement pas plus importante entre l’abattage et l’arrivée sur le site de découpe.Enfin, une étude de terrain a permis de valider les données obtenues à l’échelle du laboratoire et de réaliser une étude énergétique. Il apparait que quelle que soit le pourcentage de carcasses tièdes dans la semi-remorque, la capacité frigorifique du système de production de froid est généralement suffisante pour évacuer la chaleur des carcasses.Cette étude a permis de développer des méthodes de caractérisation des écoulements et des transferts dans une géométrie particulièrement complexe. Elle a montré l’intérêt de coupler des modèles de transfert et de microbiologie prévisionnelle. Les expérimentions à l’échelle laboratoire ont été construites en reproduisant au plus près les conditions réelles grâce à l’appui de spécialistes de la filière viande. Ainsi les carcasses modèles ont été réalisées dans des moules obtenus par impression 3D d’après des scanners X de vraies carcasses. Les résultats de cette étude sont directement utilisables par la profession et les pouvoirs publics pour l’adaptation de la réglementation des transports réfrigérés. La démarche développée pourra être adaptée pour des problèmes similaires dans des enceintes ventilées très encombrées. / The objective of this work is to develop an approach allowing to predict the evolution of the microbial load on the surface of pork carcasses during a refrigerated transport according to the operating conditions (temperature and humidity of the blowing air) and initial conditions (temperature profile at the outlet of the slaughterhouse cold room). Since microbial growth depends mainly on temperature and water activity, it is necessary to study heat and mass transfer the transfer within and around the carcasses. These phenomena depend on the circulation of air in the refrigerated vehicle loaded with hundreds of half-carcasses which makes the geometry particularly complex.Thus, this work involves various disciplines: fluid mechanics, heat transfer and predictive microbiology. The coupling of these three disciplines makes it possible to provide scientific answers as to the sanitary quality of the pork carcasses.By conducting experiments on a semitrailer loaded with pork carcasses on a reduced scale, the air flows could be characterized by 2D Doppler laser velocimetry in two air distribution configurations (with and without air ducts). In addition, local convective heat transfer coefficients could be estimated at the surface of different parts of pork carcasses and at different positions in the reduced-scale trailer. A simplified model of the airflow has been established, that makes it possible to identify the "risk zones" in the loaded semi-trailer (low air circulation and low convective transfer coefficients).Based on the results of the experimental laboratory scale study and those collected during actual refrigerated transport, the variability of the parameters characterizing the air circulating around the carcasses could be estimated. This information served as boundary conditions for a model of heat and mass (water) transfer within the most sensitive part at the microbiological level: the ham. This 3D model, solved by the finite element method, makes it possible to predict the evolution of the temperature, the water content and the microbial load (Pseudomonas) on the surface of the lean part of the ham for different scenarios. The results showed that if the transport begins while the heart of the carcasses is still warm (15°C instead of 7°C according to current regulation) the growth of microorganisms on the surface of pork carcasses is generally not more between slaughter and arrival at the cutting site.Finally, a field study validated the data obtained at the laboratory scale and carried out an energy study. It appears that whatever the percentage of warm carcasses in the semi-trailer, the cooling capacity of the cooling system is generally sufficient to evacuate the heat of the carcasses.This study has made it possible to develop a method that characterizes airflow and heat transfer methods in a particularly complex geometry. It showed the interest of coupling transfer models and predictive microbiology models. Experiments at the laboratory scale were built by reproducing the real conditions as closely as possible thanks to the support of specialists in the meat sector. Thus the model carcasses were made in molds obtained by 3D printing from X-Ray scanners of real carcasses. The results of this study are directly usable by the profession and the public authorities for the adaptation of the refrigerated transport regulations. The approach developed may be adapted for similar problems in very congested ventilated enclosures.