For many years, it has been understood that protein phosphorylation-dephosphorylation constitutes one of the most ubiquitous mechanisms for controlling the functional properties of proteins. Although originally believed to be a eukaryotic phenomenon, protein phosphorylation is now known to occur in all three domains of life <i>Eukarya, Bacteria,</i> and Archaea</i>. Very little is known, however, concerning the origins and evolution of protein phosphorylation-dephosphorylation. Knowledge of the structure and properties of the protein kinases resident in the members of the <i>Archaea</i> represents a key piece of this puzzle. The extreme acidothermophilic archaeon, <i>Sulfolobus solfataricus</i>, exhibits a membrane-associated protein kinase activity. Solubilization of the kinase activity requires the presence of detergent such as Triton X-100 or octyl glucoside, indicating its activity reside in an integral membrane protein. This protein kinase utilizes purine nucleotides as phosphoryl donors <i>in vitro</i> with a requirement for a divalent metal ion cofactor, favoring Mn⁺². A preference for NTPs over NDPs and for adenyl nucleotides over the analogous guanyl nucleotides was observed. The enzyme appears to be a glycoprotein that displays catalytic activity on SDS-PAGE corresponding to a molecular mass of ≈67 kDa, as well as an apparent molecular mass of –125 kDa on a gel filtration column. Challenged with several exogenous substrates revealed the protein kinase to be relatively selective. Only casein, reduced carboxyamidomethylated and maleylated lysozyme (RCM lysozyme), histone H4 proved, and a peptide modeled after myosin light chains (KKRAARATSNVFA) were phosphorylated to appreciable levels <i>in vitro</i>. All of the aforementioned substrates were phosphorylated on threonine, while histone H4 was phosphorylated on serine as well. When the phosphoacceptor threonine in the MLC peptide was substituted with serine an appreciable decrease in phosphorylation was noted. The protein kinase underwent autophosphorylation on threonine and was relatively insensitive to several known "eukaryotic" protein kinase inhibitors. Primary sequence motifs based on known conserved subdomains of eukaryotic protein kinases were used to search the genome of <i>S. solfataricus</i> for eukaryotic-like protein kinase sequences. Six hypothetical proteins were identified from <i>S. solfataricus</i> whose primary sequence exhibited noticeable similarities to eukaryotic protein kinases. The hypothetical protein encoded by <i>ORF sso0197</i> contained 7 putative subdomains, <i>ORFs sso0433, sso2291, sso2387</i>, and <i>sso3207</i> contained 8 putative subdomains, and <i>ORF sso3182</i>, contained 9 putative subdomains of the 12 characteristically conserved subdomains found within eukaryotic protein kinases. <i>ORF sso2387</i> was cloned and expressed in <i>Escherichia coli</i>. The expressed protein, SsPK2, was solubilized from inclusion bodies using 5 M urea. SsPK2 was able to phosphorylate casein, BSA, RCM lysozyme, and mixed histones <i>in vitro</i>. Phosphoamino acid analysis of casein, BSA, and mixed histones revealed that they were all phosphorylated on serine. SsPK2 underwent autophosphorylation on serine at elevated temperature using both purine nucleotide triphosphates as phosphoryl donors in vitro, but exhibited a noticeable preference for ATP. Autophosphorylate of SsPK2 also occurred at elevated temperature using a variety of divalent metals cofactors in order of Mn⁺² > Mg⁺² >> Ca²⁺ ≈ Zn⁺². Polycations such as polyLys stimulated the phosphorylation of exogenous substrates while polyanions such as poly(Glu:Tyr) were shown to inhibit the phosphorylation of exogenous substrates. Of the "eukaryotic" protein kinases inhibitors tested, only tamoxifen had any noticeable effect of the catalytic activity of SsPK2 towards itself and exogenous substrates. A truncated form of SsPK2 containing the perceived catalytic domain also exhibited protein kinase activity towards itself and exogenous substrates. The observed protein kinase activity for SsPK2trunk was similar to that observed for SsPK2. Proteins from the membrane fraction of <i>S. solfataricus</i> subject to phosphorylation <i>in vitro</i> on serine or threonine residues were identified using MALDI-MS / peptide fingerprinting techniques. Nine phosphoproteins were assigned a tentative identification using the ProFound protein search engine from Rockefeller University. The identity of two of nine phosphoproteins, a translational endoplasmic reticulum ATPase and an ≈ 42 kDa hypothetical protein, were determined with a relatively high degree of confidence. Collectively the results suggested MALDI-MS peptide mapping coupled with [³²P] labeling <i>in vivo</i> will have a tremendous potential for mapping out a major portion of the phosphoproteome of <i>S. solfataricus</i>. / Ph. D.

The Proterozoic period saw some of the most fundamental revolutions in the biological and geological world. During this period, life diversified and set the stage for the radiation of multicellular life, altering the face of the planet in the process. The fossil record of this time is not yet fully understood, and a revisitation of a historically reported fossil deposit in the 1 Ga Torridon rocks of northwest Scotland shows that they host the fossils of the earliest non-marine eukaryotes, as well as a full and diverse fossil assemblage preserved in sedimentary phosphates and shales. Fine scale sedimentology of the fluvio-lacustrine rocks of the Torridon Group reveals them to be laid down in a laterally variable basin with distinctly different palaeoenvironments. The resident biota is seen to be similarly variable between lithofacies. New criteria for classifying taphonomic effects are presented, and used to characterise assemblages from different palaeoenvironments, with broader applications beyond this study. The Torridon rocks are also host to macrostructures on the surfaces and soles of beds, and these are interpreted as of likely biological origin, with their variability mapped between different lithofacies. High-resolution studies of both the preserved biota and the mineralogy of the preserving medium reveal in detail not only the fine scale structure of the fossil organisms, but also the reasons for their exceptional preservation. Phosphate is analysed in detail to explain its enigmatic occurrence in Proterozoic lakes. To place the Torridon deposits in context, both older and younger rocks were examined in comparison, from the 2 Ga Gunflint Formation of Ontario, Canada, and the Precambrian-Cambrian successions of eastern Newfoundland respectively. New finds of phosphate in these rocks help to reveal biochemical interactions and evolution on the early Earth, with implications for further understanding life on our own planet and elsewhere.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第23236号 / 農博第2443号 / 新制||農||1083(附属図書館) / 学位論文||R3||N5326(農学部図書室) / 京都大学大学院農学研究科応用生物科学専攻 / (主査)教授 吉田 天士, 教授 澤山 茂樹, 准教授 神川 龍馬 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

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Jusqu’à 40% des protéines sont connues pour fixer des métaux, ces hétéroatomes jouant un rôle capital dans la régulation, la catalyse ou le maintien de la structure de ces protéines. Ces métalloprotéines sont ubiquitaires et d’une importance primordiale dans les trois domaines du vivant. Cependant, les méthodes actuelles dédiées à l’identification des membres de cette grande famille dans les protéomes bactériens sont soit inadaptées pour des approches à grande échelle, soit présentent des performances relativement limitées en l’absence d’une structure tridimensionnelle résolue. Dans ce contexte, différents outils d’analyse de séquence ont été testés, en recherchant des descripteurs de ces protéines (e.g. motifs, domaines conservés, empreintes phylogénétiques). Pour pallier le relatif manque de sensibilité de ceux-ci, de nouveaux descripteurs ont été construits, dédiés spécifiquement à l’identification des protéines à centre fer-soufre : (i) des profils de co-conservation des ligands du métal et (ii) des profile-HMMs adaptés à la détection d’homologues distants. Les pouvoirs prédictifs respectifs de ces catégories de descripteurs ont été évalués sur un jeu de protéines fer-soufre expertisé, en les considérant soit séparément soit en combinaison. L’ensemble de ces descripteurs a finalement été intégré dans un modèle linéaire généralisé en utilisant la technique d’elastic-net. Le modèle prédictif obtenu a été évalué sur le protéome complet d’Escherichia coli, sur lequel il atteint une précision de 89% et une sensibilité de 83%. Enfin, il a été appliqué à environ 300 protéomes pour explorer différentes relations biologiques comme l’abondance relative des protéines Fe-S et la tolérance à l’oxygène des organismes auxquelles elles appartiennent. / Up to 40% of all proteins are known to bind metals, the intrinsic metal atoms providing catalytic, regulatory and/or structural roles critical to their functions. These metalloproteins are ubiquitous and of major importance within the three domains of life. However, current methods dedicated to identifying members of this large family within bacterial proteomes are either not suitable for large-scale approach or are of relatively limited performance when no 3D structural template is available. Within this context, different sequence analysis tools relying on different category of protein descriptors (e.g. patterns, conserved domains, phylogenetic prints) were assessed. To overcome their relative lack of sensibility, new descriptors, specific towards iron-sulfur proteins identification were built: (i) co-conservation profiles of the metal ligands and (ii) tailored profile-HMMs for remote homologs detection. Their respective predictive power towards the identification of a manually curated iron-sulfur proteins dataset were assessed, either separately or in combination. All relevant descriptors were finally gathered into a generalized linear model by using the elastic-net method. The predictive model has been evaluated on Escherichia coli whole proteome resulting in a precision of 89% and a recall of 83%. Eventually, it has been applied to 300 proteomes allowing investigating different biological relationships, such as iron-sulfur proteins relative abundances and the oxygen dependency of bacterial organisms.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第24677号 / 農博第2560号 / 新制||農||1100(附属図書館) / 学位論文||R5||N5458(農学部図書室) / 京都大学大学院農学研究科応用生物科学専攻 / (主査)教授 吉田 天士, 教授 澤山 茂樹, 准教授 神川 龍馬 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DGAM

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La famille des NADPH oxydases est constituée de complexes multi protéiques, dont un des composants est la sous unité catalytique NOX. Il s'agit de protéine transmembranaire qui assure le transport des électrons à travers la membrane, à partir d'un donneur d'électrons, le NADPH, à un accepteur final, l'oxygène moléculaire. Il en résulte la production de superoxydes, précurseur d'espèces réactives de l'oxygène. Les NOX sont impliquées dans divers processus physiologiques et pathologiques qui les ont placés au rang des cibles thérapeutiques à forte valeur ajoutée.Les NOX sont reportées comme des protéines membranaires propres aux eucaryotes supérieures. Ainsi toutes les données fonctionnelles disponibles pour cette famille d'enzyme, ont été le fruit des études structure-fonction et de données putatives indirectes. D'où l'idée et l'intérêt d'identifier chez les procaryotes des candidats homologues aux Nox eucaryotes et susceptibles d'être de bons modèles pour des études structurales. En se servant d'outils bio-informatiques, nous avons définis des signatures de séquences propres aux NOX et avons identifié chez les procaryotes des centaines de séquences homologues. SpNox de chez Streptococcus Pneumoniae, a été sélectionnée et surexprimée chez E. Coli. SpNox a été purifiée et a fait l'objet d'une caractérisation fonctionnelle et biochimique approfondie. Au vue des résultats obtenus, SpNox se rapproche de part ses propriétés structurales et mechanistiques des NOX eucaryotes. Ainsi elle se présente comme le premier modèle procaryote de protéine NOX. Les premiers cristaux de cette famille de protéines ont été obtenus et son rôle in vivo reste à exploiter.En parallèle à l'approche procaryote, nous avons mené une étude structure-fonction sur la protéine NOX2 des neutrophiles PLB-985. Deux arginines conservées chez toutes les NOX eucaryotes ont été sélectionnées et leur rôle a été étudié par mutagenèse dirigée. Apres évaluation des propriétés enzymatiques des mutants NOX2, nous avons pu identifier l'arginine 513 comme étant impliquée dans la spécificité de NOX2 vis a vis du NADPH. Ces résultats nous ont permis de proposer une nouvelle orientation du NADPH dans son site d'ancrage à la protéine NOX2. / The NADPH oxidase complex was the first identified example of a system that generates reactive oxygen species in a dedicated manner. NOX are proteins involved in the transmembrane transfer of electrons to the molecular oxygen, resulting in the production of superoxides. In addition to ROS related damages, deregulation of Nox-dependant ROS production induces pathological consequences. Accordingly, the Nox family became a potential drug target, making the understanding of their function at molecular basis crucial.In the literature, it has always been reported that Nox proteins exist only in eukaryotes. Since eukaryotic membrane proteins have proven to be difficult to study, all the data available on Nox enzymes are obtained from putative assignments or structure-function studies.In our project, to overcome the difficulty of working on eukaryotic membrane proteins, we used an original approach based on bioinformatics tools. Through using specific filters and a novel program, we were able to identify hundreds of prokaryotic candidates. Among them, we selected SpNox, as a prokaryotic model from Streptococcus Pneumoniae. We have developed its expression in E. Coli as well as a multistep purification scheme. We also conducted an extensive enzymatic and mechanistic characterization of the purified enzyme. Our data support a strong structural and functional homology with known NOX enzymes. Finally, crystallization trials are performed leading to first crystals ever obtained for this family of protein. The understanding of Nox's physiological function in bacteria remains to investigate.In parallel to the prokaryotic approach, a structure-function study was conducted on the human model NOX2 in the PLB-985 neutrophils. Conserved arginines among eukaryotic Nox sequences were selected. Site directed mutagenesis followed by activity tests, lead us to identify a crucial role for arginine 513. It is implicated in the specificity towards NADPH as an electron donor for NOX2. With these data, we were able to suggest a new orientation of the NADPH, notably the phosphate moiety, in the binding site.

L'étude des modifications post-traductionnelles a connu au cours des dernières années un regain d'intérêt notable. Tout d'abord car elle s'effectue aujourd'hui au travers d'approches basées sur la spectrométrie de masse, technique qui pendant cette période a connu de profonds bouleversements, conduisant à des études plus aisées et systématiques.Mais aussi car tant par leur variété que par le rôle qu'elles jouent dans la vie et la régulation cellulaire, ces modifications ne peuvent plus être négligées. Par ailleurs au cours de ces quinze dernières années, nous avons assisté concernant les procaryotes à un changement total de paradigme. En effet à la fin des années 90, l'idée dominante était que ces modifications pouvaient exister chez ceux-ci mais de façon très partielle et/ou très particulière.Dans ce travail, les divers degrés d'iodation de la tyrosine ont été sondés par une approche de type «shotgun » sur un organe entier, la thyroïde de souris. L'efficacité de ce type d'approche démontrée, les modifications post-traductionnelles potentiellement présentes dans des organismes modèles radiorésistants, la bactérie Deinococcus deserti et l'archée Thermococcus gammatolerans ont été analysées. Dans le premier cas, les données de protéomique montrent que de nombreuses acétylations N-terminales portent sur un motif spécifique (essentiellement des thréonines et sérines), cas très atypique pour une bactérie. Chez Thermococcus gammatolerans les acétylations N-terminales sont rares, mais la présence d'acétylations sur les chaînes latérales des lysines est notable. La présence de phosphorylations sur ces mêmes protéines, laisse entrevoir un possible phénomène de « cross talk » entre les lysines acétylées et les sérines et/ou thréonines phosphorylées.Ici, nous démontrons que la complexité du protéome chez les procaryotes par le biais des MPT est bien réelle et que de possibles interdépendances entre MPT mériteraient un regard nouveau. / Recently, the study of post-translational modifications has greatly evolved, mainly because of crucial progresses in mass spectrometry methodology which have allowed high-throughput, high resolution analysis. Their variety and their role in the regulation of key molecular mechanisms are increasingly documented. In this work, the different degrees of iodination of tyrosine were probed with a "shotgun" approach carried out from an entire organ, the mice thyroid. Post-translational modifications present in two radioresistant organism models, the bacterium Deinococcus deserti and the archaeon Thermococcus gammatolerans, were analyzed. The large scale exploration of N-terminal acetylation in D. deserti indicates a specific pattern of this modification on serine and threonine, as well as an atypical, high propension to acetylation with 50% of modified N-termini. In T. gammatolerans, N-terminal acetylation is rare, but the presence of acetylation on lysine side chains is significant. The presence of phosphorylation on these proteins suggests a potential "cross talk" between the acetylated lysine and phosphorylated serine or threonine residues. This work demonstrates that the complexity of the proteome in prokaryotes through post-translational modifications is higher than expected when extremophiles are scrutinized compared to classical prokaryote models. Interdependencies between post-translational modifications definitively deserve a fresher look.

Les cheminées et sédiments hydrothermaux actifs du Bassin de Guaymas (Mexique) hébergent diverses communautés microbiennes présentant différents métabolismes, y compris ceux impliqués dans les cycles biogéochimiques du soufre et du fer. Il est établi, que, dans ces écosystèmes dynamiques, les micro-organismes qui dépendent pour leur croissance des substrats présents dans leur environnement pourraient à leur tour, affecter localement la composition du fluide hydrothermal et la minéralogie des cheminées, la composition des sédiments, en favorisant la dissolution et/ou la précipitation de certaines phases minérales. Pour étudier ces interactions procaryotes-biotopes, et établir des liens entre la structure, l’activité et les signatures isotopiques des communautés microbiennes et les caractéristiques physico-chimiques des systèmes hydrothermaux du Bassin de Guaymas, une approche pluridisciplinaire mettant en oeuvre des techniques de microbiologie, de géochimie et d’isotopie, lors des cultures d’enrichissements en bioréacteur et des études de colonisation de substrats basaltiques a été réalisée. Ces travaux ont permis : 1) de caractériser la diversité des micro-organismes de différents compartiments de l’écosystème hydrothermal (cheminée et sédiments) du Bassin de Guaymas par des approches culturales et moléculaires ; 2) de décrypter le fonctionnement des cycles biogéochimiques du soufre et du fer en mettant en évidence la présence simultanée, à haute température et en anaérobiose, de micro-organismes sulfo-réducteurs, sulfato-réducteurs, sulfo-oxydants mais également ferri-réducteurs et ferro-oxydants ; et 3) de mieux comprendre les interactions procaryotes-minéraux-fluide en soulignant le rôle des microorganismes dans la modification des conditions environnementales, la formation de minéraux ainsi que leur rôle direct ou indirect dans les fractionnements des isotopes du Fer et Soufre. Ces études ont donc permis de montrer l’importance des interactions croisées entre les différents composantes : communautés microbiennes, le fluide (fluide hydrothermal, eaux interstitielles des sédiments, eau de mer) et les structures minérales des écosystèmes hydrothermaux. / Active hydrothermal chimney and sediments of the Guaymas Basin (Mexico) host various microbial communities with different metabolisms, including those involved in biogeochemical cycles of sulfur and iron. It is established that, in these dynamic ecosystems, microbial activity depends on the availability of substrates in their environment and that prokaryotes could, in return locally affect the composition of the hydrothermal fluid and mineralogical composition of the chimney or sediment, by mediating the dissolution and / or precipitation of some mineral phases. In order to study these prokaryotes-biotope interactions, and establish links between the structure, the activity and the isotopic signatures of microbial communities with the physico-chemical characteristics of hydrothermal systems of Guaymas Basin, a multidisciplinary approach based on the implementation of microbiology, geochemistry and isotope technics was performed using enrichment cultures in bioreactors and the study of the colonization of basaltic substrates. This work led to: 1) characterize the diversity of microorganisms in different hydrothermal compartments (chimney and sediments) of the Guaymas Basin using both cultural and molecular approaches; 2) to decrypt the functioning of sulfur and iron biogeochemical cycles, by highlighting the occurrence, at high temperature and anaerobic condition, of sulfur-reducing, sulfate-reducing, sulfur-oxidizing and also iron-reducing and iron-oxidizing prokaryotes ; and 3) to better understand the prokaryote-mineral-fluid interactions by pointing out the role of microorganisms in environmental condition changes, mineral precipitation and their direct or indirect role in iron and sulfur isotope fractionation. Thus these studies have demonstrated the importance of the cross-interactions between the different hydrothermal components: microbial communities, fluids (hydrothermal fluid, sediment pore water, sea water) and mineral structures.