Spelling suggestions: "subject:"promiscuity."" "subject:"promiscuous.""
1 |
Analyses mutationnelles et cinétiques de la [bêta]-lactamase TEM-1 de Escherichia coli : vers une meilleure compréhension du phénomène de résistance aux antibiotiquesDe Wals, Pierre-Yves January 2007 (has links)
Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.
|
2 |
Molecular evolutionary perspectives of amylosucrases : from natural substrate promiscuity to tailored catalysis / Perspectives sur l’évolution moléculaire des amylosaccharases : De la promiscuité de substrat naturelle vers une catalyse contrôléeDaude, David 02 July 2013 (has links)
La promiscuité des enzymes joue un rôle primordial pour l’évolution des protéines et la divergence des fonctions catalytiques. Comprendre les déterminants moléculaires qui régissent cette promiscuité enzymatique représente un enjeu scientifique majeur pour identifier les trajectoires évolutives pouvant entrainer l’émergence de nouvelles fonctions. L’objectif de cette thèse a consisté d’une part à sonder la promiscuité catalytique de l’amylosaccharase de Neisseria polysaccharea, une transglucosidase d’intérêt biotechnologique majeur, dans le but d’identifier des substrats alternatifs et d’autre part à étendre ses capacités naturelles par des techniques d’évolution moléculaire. Une trentaine de molécules ont été testées et ont permis de mettre en évidence la forte spécificité de l’enzyme pour son substrat donneur ainsi que sa large promiscuité vers les substrats accepteurs. Le rôle des résidus impliqués dans la reconnaissance des substrats a par la suite été considéré au travers d’une stratégie rationnelle basée sur des prévisions de stabilité thermodynamique. Deux histidines (H187 et H392), ont ainsi été ciblées par mutagénèse à saturation. La stabilité de ces mutants a été étudiée ainsi que ainsi que leur activité envers différents substrats. Des enzymes à la stabilité améliorée ou montrant des changements de spécificité de produits ont ainsi été identifiées. Afin d’étudier plus amplement la promiscuité de cette amylosaccharase, une deuxième stratégie d’ingénierie a été menée pour mimer in vitro les mécanismes moléculaires de la dérive génétique neutre. Ce phénomène dit de “Neutral-Drift” a préalablement été décrit comme un facteur impliqué dans les changements de promiscuité catalytique. Quatre cycles de mutagénèse ont ainsi été réalisés et 440 clones ont été sélectionnés pour avoir conservé leur fonction originelle (i.e. leur activité sur saccharose). Des variants aux propriétés catalytiques améliorées envers des substrats alternatifs ont été caractérisés et des groupes de positions corrélées ont été identifiés. L’effet des mutations neutres sur la thermostabilité a également été étudié. Enfin, de façon remarquable, une nouvelle activité envers un substrat non reconnu par l’enzyme native, le méthyl-α-L-rhamnopyranoside, a été détectée. Ce variant possédant quatre substitutions a été caractérisé et la résolution de sa structure tridimensionnelle par cristallographie aux rayons-X permettra d’approfondir les relations unissant séquence, structure et activité de l’enzyme / Investigation of substrate promiscuity is of prime interest to understand the way enzymes evolve. Understanding the molecular determinants involved in substrate promiscuity is challenging to determine the evolutionary trajectories that lead to the emergence of catalytic functions and to take further advantage of their evolvability to develop original biocatalysts. The objective of this thesis aimed to investigate the substrate promiscuity of the amylosucrase from Neisseria polysaccharea, a transglucosidase of prime biotechnological interest, to identify alternative donor and acceptor molecules and further extend its catalytic properties through enzyme engineering. About thirty molecules were assayed and the strong specificity for the natural donor sucrose was emphasized, as well as the broad acceptor promiscuity. The rational engineering of active site residues responsible for substrate recognition was undertaken through thermodynamic stability predictions. Two residues, namely H187 and H392, were rationally targeted for site-directed mutagenesis. The stability of these variants was investigated as well as their activity toward both natural and promiscuous substrates. Variants with enhanced stability or altered product distribution were identified. These results highlighted that mutations responsible for stability changes may also lead to substrate promiscuity or product specificity changes. To further investigate the promiscuity of amylosucrase, we considered another engineering strategy to mimic in vitro the neutral enzyme evolution. Neutral genetic drift was previously shown to be related to promiscuity changes. On this basis, four repeated round of mutagenesis were performed and 440 clones were selected because they maintained the protein original function (i.e. the activity on sucrose). Variants with enhanced properties towards promiscuous donors and acceptors were characterized and clusters of correlated amino acid substitutions were identified. The impact of neutral mutations on thermodynamic stability was also discussed. Remarkably, a totally new activity towards methyl-α-L-rhamnopyranoside, an acceptor not recognized by the parental wild-type enzyme, was detected. The variant harboring four amino acid substitutions was characterized and the determination of its three-dimensional structure by X-ray crystallography will be useful to further investigate the structure-sequence-activity relationships of this enzyme
|
3 |
Amélioration rationalisée de l'enzyme hyperthermostable SsoPOX. : Perpespectives de développement d'un bio-décontaminant d'organophosphorés et d'un agent anti-virulence bactérienne.Hiblot, Julien 13 June 2013 (has links)
Issue de l'Archaea extrêmophile Sulfolobus solfataricus, SsoPox est une enzyme à fort potentiel biotechnologique du fait de son extrême stabilité. Nous avons caractérisé son activité lactonase naturelle ainsi que son activité de promiscuité phosphotriestérase. Elle est capable d'hydrolyser les organophosphorés (OPs), des agents neurotoxiques utilisés en tant qu'insecticide et arme chimique de guerre dont les méthodes actuelles de décontamination restent insatisfaisantes. Non optimale, l'activité phosphotriestérase de SsoPox a été améliorée en redessiné in silico son site actif de afin qu'il ressemble à celui des PTEs, hydrolysant très efficacement les OPs. L'enzyme ainsi développée offre des perspectives d'utilisation pour la décontamination des pollutions aux OPs. L'activité lactonase de l'enzyme a également été améliorée envers certaines N-Acyl Homosérine Lactones (AHLs), des molécules impliquées dans la communication inter-bactérienne (quorum sensing). Or, le quorum sensing régule notamment la virulence bactérienne (e.g. Pseudomonas aeruginosa). Ainsi, l'utilisation de lactonases telles que SsoPox constituerait une alternative aux antibiotiques par interférence au quorum sensing (i.e. quorum quenching). L'ensemble de ces travaux a conduit au dépôt d'un brevet protégeant les séquences des variants améliorés ainsi que leurs domaines d'applications. Ils permirent également d'étudier des phénomènes clés dans l'évolution des enzymes tels que l'épistasie, la promiscuité et la flexibilisation. Ce projet, mêlant Sciences fondamentales et appliquées, pourrait, in fine, mener à la valorisation d'un projet de recherche académique. / Issued from the extremophilic Archaea Sulfolobus solfataricus, SsoPox exhibits an important biotechnological potential because of its extreme stability. Belonging to the phosphotriesterase-like lactonase family, its natural lactonase and promiscuous phosphotriesterase activities were characterized. The enzyme is able to hydrolyze organophosphates (OPs), i.e. nerve agents used as insecticides and chemical warfare agents for which current methods of decontamination are unsatisfactory. The phosphotriesterase activity of SsoPox is suboptimal unlike some mesophilic enzymes (PTEs). To develop a robust bio-decontaminant of OPs, we redesigned, in silico, SsoPox active site in the aim to mimic that of PTEs. Using a mutation database in an in vitro evolution protocol, we screened, selected and characterized efficient enzymes for OPs insecticides hydrolysis, offering prospects in OPs decontamination. SsoPox lactonase activity was also improved for some N-Acyl Homoserine Lactones (AHLs), molecules involved in the inter-bacterial communication (quorum sensing). Quorum sensing regulates several functions such as virulence of some pathogens (e.g. Pseudomonas aeruginosa). The use of lactonases such as SsoPox could constitute an alternative to antibiotics by quorum sensing (and thus virulence) inhibition (i.e. quorum quenching). These works were patented, protecting the sequences of improved variants and their fields of application. They also allowed to study key phenomena in enzyme evolution such as epistasis, promiscuity and flexibility. This project, combining basic and applied Sciences, could lead, in fine, to the promotion of an academic research project.
|
Page generated in 0.0313 seconds