Hintergrund: Die Entwicklung von Therapieprinzipien zur Behandlung von Krebserkrankungen hat eine anhaltende, sehr hohe wissenschaftliche Relevanz. Ziel dabei ist es, möglichst selektiv nur das erkrankte Gewebe zu schädigen. Besonders relevant ist dabei die Adressierung von für das Zellüberleben wichtigen Strukturen, wie etwa der DNA. Erreicht werden kann dies zum Beispiel durch eine Sensitivierung der DNA gegenüber energiereicher Strahlung. Ein vielversprechender Ansatz ist dabei die Generierung von Auger-Elektronen, welche auf subzellulärer Reichweite eine hohe Energie abgeben (hoher Linearer Energietransfer) und zu DNA-Strangbrüchen führen können. Dass durch unmittelbar an die DNA gekoppelte Auger-Emitter eine besonders effektive DNA-Schädigung zu erreichen ist, wurde zum Beispiel für 111Indium, 123Iod, 125Iod als auch für 99mTechnetium gezeigt. Es konnte sowohl in Untersuchungen an Zellen, als auch an Plasmid-DNA eine erfolgreiche Anregung nicht-radioaktiver Substanzen zur Auger-Emission durch ionisierende Strahlung, wie auch durch UV-Bestrahlung erreicht werden. Bekannt ist diese Sensitivierung gegenüber energiereicher Strahlung für in die DNA integrierte halogenierte DNA-Basen, wie zum Beispiel Iododeoxyuridin, mit Iod markierte DNA-Farbstoffen, wie etwa Iodo-Hoechst, als auch für DNA-gebundenes Platin. Ein bereits Iod enthaltender DNA-Farbstoff ist der Fluoreszenzfarbstoff Propidiumiodid (PI), welcher in die DNA interkaliert. Ob über die Markierung von DNA mit PI eine Sensitivierung gegenüber energiereicher Strahlung durch die Anregung des Iods zur Auger-Emission erreicht werden kann, wird in dieser Arbeit untersucht. Material und Methode: In den Versuchen wurde das Plasmid pUC 19 (2686 Basenpaare) mit unterschiedlichen Strahlenqualitäten (Röntgenstrahlung, niederenergetische Elektronenbestrahlung durch 99mTechnetium, hochenergetische Elektronenbestrahlung durch 188Rhenium, Partikelbestrahlung durch 223Radium, UV-Bestrahlung (254 nm und 366 nm) und Bestrahlung mit visuellem Licht (530-575 nm)) und Modulatoren (Wasserstoffperoxid H2O2, Zinndichlorid SnCl2, Dimethylsulfoxid DMSO) mit und ohne PI behandelt. Die Entstehung von DNA-Einzel-und Doppelstrangbrüchen führt zu einer Veränderung der Plasmidkonformation von einer superspiralisierten (supercoiled SC) zu entspannteren Formen (Einzelstrangbruch ESB-> open circle OC, Doppelstrangbruch DSB-> linearisiert L). Diese verschiedenen Plasmidkonformationen haben unterschiedliche Laufeigenschaften in der Gelelektrophorese und wurden so aufgetrennt. Nach einer Gelfärbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid (EtBr) erfolgte die quantitative Auswertung der Fluoreszenzintensität der unterschiedlichen Plasmidkonformations-Banden. Ergebnisse: Als grundsätzliche Voraussetzung für die nachfolgenden Versuche wurde zunächst die konzentrationsabhängige Markierung der DNA mit PI nachgewiesen, welche zu einer proportionalen Zunahme der Fluoreszenzintensität führt. Die Markierung ist stabil über die Zeit und verursacht keine DNA-Strangbrüche, jedoch eine Konformationsänderung der DNA. Eine Interaktion zwischen PI und der nachfolgenden Gelfärbung mit EtBr besteht nicht. Untersuchungen zur Chemotoxizität der Modulatoren ergaben für H2O2 keine relevante DNA-Strangbruchinduktion und für SnCl2 einen starken DNA-schädigenden Effekt mit einer konzentrationsabhängigen Induktion von ESB und DSB, welche durch den Radikalfänger DMSO verhinderbar waren, also über Radikale vermittelt wurden. Die Kombination aus H2O2 und SnCl2 führt zu einer Verstärkung der DNA-Schädigung. Für die ionisierende Strahlung konnte für alle Strahlenqualitäten eine dosisabhängige DNA-Schädigung mit Entstehung von ESB und bei höheren Dosen von DSB gezeigt werden, welche weitestgehend durch DMSO verhinderbar, also radikalvermittelt, waren. Die PI-Markierung der DNA führte in Kombination mit ionisierender Strahlung zu keiner Verstärkung der DNA-Schädigung. Es ließ sich sogar eher ein diskret protektiver Effekt durch PI bei hohen Dosen nachweisen. Da bekannt ist, dass für die Anregung eine Energie grade größer als die Energie der K-Schalen-Elektronen des Iods besonders effektiv ist, wurde vergleichend die Röntgenbestrahlung mit unterschiedlichen Beschleunigungspannungen (32 kV und 200 kV) untersucht. Jedoch führte auch hier die PI-Markierung nicht zu der erwarteten stärkeren DNA-Schädigung bei 200 kV. Die Untersuchung zur UV-Bestrahlung ergab für die Wellenlänge 254 nm einen DNA-toxischen Effekt. Durch die PI-Markierung ließ sich eine geringe Zunahme der ESB, jedoch keine DSB verzeichnen, so dass eine Auger-Emission unwahrscheinlich erscheint. Es scheint aber zu einer direkten Wechselwirkung mit der DNA zu kommen, da die Schädigung durch DMSO nicht vollständig verhinderbar ist. Für die Wellenlänge 366 nm wurde eine DNA-Toxizität, sowohl ohne, als auch mit PI-Markierung ausgeschlossen. Eine Kombination mit H2O2 führte zu einer massiven DNA-Destruktion mit Entstehung von ESB und DSB, welche durch Zugabe von DMSO suffizient verhindert werden konnten. Eine Bestrahlung mit visuellem Licht (530 - 575 nm) verursachte keine DNA-Schädigung. Durch die Markierung mit PI ließ sich eine konzentrationsabhängige DNA-Schädigung mit Entstehung von ESB erreichen. Es konnten jedoch keine DSB detektiert werden, so dass eine Auger-Emission unwahrscheinlich ist. DMSO kann die Schädigung nur partiell verhindern, so dass ein anderer direkter Effekt anzunehmen ist, am wahrscheinlichsten durch die optimale Anregung zur Fluoreszenz im Bereich des Absorptionsmaximums des PI. Schlussfolgerung: Es ließ sich für alle untersuchten Strahlenqualitäten, sowohl ionisierende Strahlung als auch Lichtbestrahlung, kein Effekt im Sinne einer Anregung zur Auger-Emission und der damit einhergehenden zu erwartenden Entstehung von DSB durch die Markierung mit PI unter den gegebenen Versuchsbedingungen nachweisen. Jedoch ließen sich Wechselwirkung bei der Bestrahlung mit Licht verzeichnen, so dass das grundlegende Prinzip einer Sensitivierung gegenüber energiereicher Strahlung für die Entwicklung von Therapiekonzepten weiterhin im Fokus steht.:1 Einleitung 1 2 Material und Methoden 3 2.1 Material 3 2.1.1 DNA 3 2.1.2 Chemikalien 4 2.1.3 Radionuklide und Bestrahlungssysteme 6 2.2 Methoden 10 2.2.1 Experimentelles Design 10 2.2.2 Charakterisierung der Plasmidkonformationen 12 2.2.3 Dosimetrie 13 2.2.4 Statistische Auswertung 14 3 Ergebnisse 15 3.1 Standardisierung der Messergebnisse und Quantifizierung 15 3.2 Einfluss physikalischer und chemischer Parameter auf die Plasmid-DNA 15 3.2.1 Festlegung Inkubationstemperatur und pH-Wert 15 3.2.2 Einfluss von DMSO auf die Plasmid-DNA 16 3.2.3 Einfluss von PI auf die Plasmid-DNA 16 3.2.3.1 Einfluss von DMSO auf Konformationsänderung durch PI 21 3.2.4 Einfluss von H2O2 auf die Plasmid-DNA und Wirkung von DMSO 23 3.2.5 Einfluss von H2O2 und PI auf die Plasmid-DNA 24 3.2.6 Einfluss von SnCl2 im TechneScan PYP-Kit auf die Plasmid-DNA 26 3.2.6.1 Einfluss von DMSO auf die Schädigung durch SnCl2 27 3.2.6.2 Einfluss von H2O2 auf die Schädigung durch SnCl2 29 3.2.6.3 Einfluss von DMSO auf die Schädigung durch SnCl2 und H2O2 30 3.3 Dosiswirkungsbeziehungen nach Exposition mit unterschiedlichen Strahlenqualitäten 31 3.3.1 Bestrahlung mit externer Röntgenstrahlung 31 3.3.1.1 Schädigung durch Röntgenbestrahlung und Einfluss von DMSO 31 3.3.1.2 Einfluss von PI auf Schädigung durch Röntgenbestrahlung mit Röhrenspannung von 200 kV und 32 kV 33 3.3.2 Bestrahlung mit 99mTc 36 3.3.2.1 Bestrahlung mit 99mTc und Einfluss von PI 36 3.3.3 Bestrahlung mit 188Re 40 3.3.3.1 Bestrahlung mit 188Re und Einfluss von PI 40 3.3.4 Bestrahlung mit 223Ra 42 3.3.4.1 Bestrahlung mit 223Ra und Einfluss von PI 43 3.3.5 Bestrahlung mit UV-Licht (254 nm) und Einfluss von PI 46 3.3.5.1 Einfluss von DMSO auf die Schädigung durch UV-Bestrahlung mit 254 nm 47 3.3.6 Bestrahlung mit UV-Licht (366 nm) und Einfluss von PI 48 3.3.6.1 Einfluss von H2O2 auf die Bestrahlung mit UV-Licht (366 nm) 49 3.3.6.2 Einfluss von DMSO auf die Schädigung durch H2O2 und UV-Bestrahlung (366 nm) 51 3.3.7 Bestrahlung mit VIS (530-575 nm) und Einfluss von PI 52 3.3.7.1 Einfluss von DMSO auf die Schädigung durch PI und VIS-Bestrahlung 54 4 Diskussion 56 4.1 Experimentelles Designe 58 4.1.1 DNA-Markierung mit PI 58 4.1.2 DNA-Markierung mit EtBr 59 4.2 Untersuchungen zur Chemotoxizität 60 4.2.1 Wechselwirkung zwischen H2O2 und Plasmid-DNA 60 4.2.2 Wechselwirkung zwischen SnCl2 und Plasmid DNA 60 4.2.2.1 Wechselwirkung zwischen H2O2 und SnCl2 61 4.3 Untersuchungen zu ionisierender Strahlung 62 4.3.1 DNA-Schädigung durch ionisierende Strahlung 62 4.3.2 Wechselwirkung zwischen ionisierender Strahlung und PI 63 4.4 Untersuchungen zur Bestrahlung mit Licht 66 4.4.1 Bestrahlung mit UV-Licht (254 nm) 66 4.4.2 Bestrahlung mit UV-Licht (366 nm) 67 4.4.2.1 Wechselwirkung zwischen H2O2 und UV-Licht (366 nm) 67 4.4.3 Bestrahlung mit visuellem Licht (VIS 530 - 575 nm) 68 4.4.4 Grenzen der Methode und Fehlerbetrachtung 69 4.5 Ausblick 70 5 Zusammenfassung 72 6 Summary 75 7 Literaturverzeichnis 77 8 Anhang 84 8.1 Abbildungsverzeichnis 84 8.2 Tabellenverzeichnis 92 8.3 Tabellen mit Daten zu den Abbildungen 96 8.3.1 Einfluss von PI auf die Plasmidkonformation 96 8.3.2 Einfluss von DMSO auf die Konformationsänderung durch PI 99 8.3.3 Einfluss von H2O2 auf die Plasmid-DNA und Wirkung von DMSO 100 8.3.4 Einfluss von H2O2 und PI auf die Plasmid-DNA 101 8.3.5 Einfluss von SnCl2 im TechneScan PYP-Kit auf die Plasmid-DNA 102 8.3.6 Einfluss von DMSO auf die Schädigung durch SnCl2 102 8.3.7 Einfluss von H2O2 auf die Schädigung durch SnCl2 103 8.3.8 Einfluss von DMSO auf die Schädigung durch H2O2 und SnCl2 104 8.3.9 Schädigung durch Röntgenbestrahlung und Einfluss von DMSO 104 8.3.10 Einfluss von PI auf Schädigung durch Röntgenbestrahlung mit Röhrenspannung von 200 kV und 32 kV 105 8.3.11 Bestrahlung mit 99mTc und Einfluss von PI 106 8.3.12 Bestrahlung mit 188Re und Einfluss von PI 107 8.3.13 Bestrahlung mit 223Ra und Einfluss von PI 108 8.3.14 Bestrahlung mit UV-Licht (254 nm) und Einfluss von PI 109 8.3.15 Einfluss von DMSO auf die Schädigung durch UV-Bestrahlung mit 254 nm 110 8.3.16 Bestrahlung mit UV-Licht (366 nm) und Einfluss von PI 110 8.3.17 Einfluss von H2O2 auf die Bestrahlung mit UV-Licht (366 nm) 110 8.3.18 Einfluss von DMSO auf die Schädigung durch H2O2 und UV- Bestrahlung (366 nm) 111 8.3.19 Bestrahlung mit VIS (530-575 nm) und Einfluss von PI 112 8.3.20 Einfluss von DMSO auf die Schädigung durch PI und VIS-Bestrahlung 113 8.3.21 Vergleich Strahlenqualitäten 114 9 Erklärung zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 116 10 Erklärung zur Einhaltung gesetzlicher Vorgaben 117 11 Danksagung 118 / Introduction and aim of the study: The development of therapeutic principles for the treatment of cancer has a lasting, very high scientific relevance. The aim is to damage the diseased tissue only. The addressing of structures that are important for cell survival, such as the DNA, is particularly relevant. This can for example be achieved, by sensitizing the DNA to energized radiation. A promising approach is the generation of Auger electrons, which release high energy (high linear energy transfer) at sub-cellular range and can lead to DNA strand breaks. It has been shown that the direct coupling of Auger emitters to the DNA like indium-111, iodine-123, iodine-125 and technetium-99m cause particularly effective DNA damage. In investigations on cells as well as on plasmid DNA a successful excitation of non-radioactive substances for the emission of Auger electrons by ionizing radiation as well as UV-radiation was achieved. This sensitivity to energized radiation is known for halogenated DNA bases integrated into the DNA, such as iododeoxyuridine, iodine-labelled DNA dyes such as iodo-Hoechst and DNA-linked platinum. A DNA dye that already contains iodine is the fluorescent dye propidium iodide (PI) which intercalates into the DNA. This paper examines whether the labeling of DNA with PI can be used to achieve a sensitivity to energized radiation by excitation the iodine to Auger-emission. Materials and methods: In the experiments, the plasmid pUC 19 (2686 base pairs) was treated with different radiation qualities (X-ray radiation, low-energy electron irradiation by technetium-99m, high-energy electron irradiation by rhenium-188, particle-irradiation by radium-223, UV-irradiation (254 nm and 366 nm) and irradiation with visual light (530-575 nm)) and modulators (hydrogen peroxide H2O2, tin dichloride SnCl2, dimethyl sulfoxide DMSO) both with and without PI. The formation of DNA single- and double-strand breaks leads to alteration in plasmid conformation from superspiralized (supercoiled SC) to more relaxed forms (single strand break SSB-> open circle OC, double strand break DSB-> linear L). These different plasmid conformations have different running properties in gel electrophoresis and were separated this way. After gel staining with the fluorescent dye ethidium bromide (EtBr) the fluorescence intensity of the different plasmid conformational bands was evaluated quantitatively. Results: As a basic prerequisite for the subsequent experiments, the concentration-dependent labelling of the DNA with PI was demonstrated first, which leads to a proportional increase in fluorescence intensity. The labelling is stable over time and does not cause DNA strand breaks, but a conformational alteration of the DNA. There is no interaction between PI and the subsequent gel staining with EtBr. Investigations on the chemotoxicity of the modulators showed no relevant DNA strand breakage induction for H2O2 and a strong DNA-damaging effect for SnCl2 with a concentration-dependent induction of SSB and DSB, which was prevented by the radical scavanger DMSO, i. e. radical induced. The combination of H2O2 and SnCl2 leads to an increase of the DNA damage. For ionizing radiation, dose-dependent DNA damage with the formation of SSB and at higher doses of DSB, which was largely prevented by DMSO, i. e. radical induced, could be shown for all radiation qualities. The PI labeling of the DNA in combination with ionizing radiation did not lead to any amplification of the DNA damage. In fact, a discrete protective effect of PI at high doses could be demonstrated. Because it is known that the excitation with energy just greater than the energy of the K-shell electrons of iodine is particularly effective, the X-ray irradiation with different accelerating voltages (32 kV and 200 kV) was compared. However, the PI-labelling did not lead to the expected stronger DNA damage at 200 kV. The investigation of UV irradiation showed a DNA-toxic effect for the wavelength 254 nm. Due to the PI-labelling, a slight increase in SSB but no DSB were recorded, so that an Auger emission appears unlikely. However, it seems that there is a direct interaction with the DNA, because the damage is not completely preventable by DMSO. For the wavelength 366 nm a DNA toxicity was excluded, both without and with PI-marking. A combination with H2O2 led to a massive DNA destruction with the formation of SSB and DSB, which could be prevented sufficiently by the addition of DMSO. Irradiation with visual light (530-575 nm) did not cause DNA damage. By labelling with PI, concentration-dependent DNA damage with the formation of SSB could be achieved. However, no DSB could be detected, so that an Auger emission is unlikely. DMSO can only partially prevent the damage, so that another direct effect can be assumed, most likely through optimal excitation of the fluorescence around the absorption maximum of PI. Conclusion: For all investigated radiation qualities, i. e. ionizing radiation as well as light irradiation, no effect could be proven in the sense of an excitation to Auger emission and the associated expected development of DSB by labelling with PI under the given test conditions. However, interactions could be observed for the irradiation with light, so that the basic principle of sensitization to energized radiation for the development of therapy concepts remain of interest.:1 Einleitung 1 2 Material und Methoden 3 2.1 Material 3 2.1.1 DNA 3 2.1.2 Chemikalien 4 2.1.3 Radionuklide und Bestrahlungssysteme 6 2.2 Methoden 10 2.2.1 Experimentelles Design 10 2.2.2 Charakterisierung der Plasmidkonformationen 12 2.2.3 Dosimetrie 13 2.2.4 Statistische Auswertung 14 3 Ergebnisse 15 3.1 Standardisierung der Messergebnisse und Quantifizierung 15 3.2 Einfluss physikalischer und chemischer Parameter auf die Plasmid-DNA 15 3.2.1 Festlegung Inkubationstemperatur und pH-Wert 15 3.2.2 Einfluss von DMSO auf die Plasmid-DNA 16 3.2.3 Einfluss von PI auf die Plasmid-DNA 16 3.2.3.1 Einfluss von DMSO auf Konformationsänderung durch PI 21 3.2.4 Einfluss von H2O2 auf die Plasmid-DNA und Wirkung von DMSO 23 3.2.5 Einfluss von H2O2 und PI auf die Plasmid-DNA 24 3.2.6 Einfluss von SnCl2 im TechneScan PYP-Kit auf die Plasmid-DNA 26 3.2.6.1 Einfluss von DMSO auf die Schädigung durch SnCl2 27 3.2.6.2 Einfluss von H2O2 auf die Schädigung durch SnCl2 29 3.2.6.3 Einfluss von DMSO auf die Schädigung durch SnCl2 und H2O2 30 3.3 Dosiswirkungsbeziehungen nach Exposition mit unterschiedlichen Strahlenqualitäten 31 3.3.1 Bestrahlung mit externer Röntgenstrahlung 31 3.3.1.1 Schädigung durch Röntgenbestrahlung und Einfluss von DMSO 31 3.3.1.2 Einfluss von PI auf Schädigung durch Röntgenbestrahlung mit Röhrenspannung von 200 kV und 32 kV 33 3.3.2 Bestrahlung mit 99mTc 36 3.3.2.1 Bestrahlung mit 99mTc und Einfluss von PI 36 3.3.3 Bestrahlung mit 188Re 40 3.3.3.1 Bestrahlung mit 188Re und Einfluss von PI 40 3.3.4 Bestrahlung mit 223Ra 42 3.3.4.1 Bestrahlung mit 223Ra und Einfluss von PI 43 3.3.5 Bestrahlung mit UV-Licht (254 nm) und Einfluss von PI 46 3.3.5.1 Einfluss von DMSO auf die Schädigung durch UV-Bestrahlung mit 254 nm 47 3.3.6 Bestrahlung mit UV-Licht (366 nm) und Einfluss von PI 48 3.3.6.1 Einfluss von H2O2 auf die Bestrahlung mit UV-Licht (366 nm) 49 3.3.6.2 Einfluss von DMSO auf die Schädigung durch H2O2 und UV-Bestrahlung (366 nm) 51 3.3.7 Bestrahlung mit VIS (530-575 nm) und Einfluss von PI 52 3.3.7.1 Einfluss von DMSO auf die Schädigung durch PI und VIS-Bestrahlung 54 4 Diskussion 56 4.1 Experimentelles Designe 58 4.1.1 DNA-Markierung mit PI 58 4.1.2 DNA-Markierung mit EtBr 59 4.2 Untersuchungen zur Chemotoxizität 60 4.2.1 Wechselwirkung zwischen H2O2 und Plasmid-DNA 60 4.2.2 Wechselwirkung zwischen SnCl2 und Plasmid DNA 60 4.2.2.1 Wechselwirkung zwischen H2O2 und SnCl2 61 4.3 Untersuchungen zu ionisierender Strahlung 62 4.3.1 DNA-Schädigung durch ionisierende Strahlung 62 4.3.2 Wechselwirkung zwischen ionisierender Strahlung und PI 63 4.4 Untersuchungen zur Bestrahlung mit Licht 66 4.4.1 Bestrahlung mit UV-Licht (254 nm) 66 4.4.2 Bestrahlung mit UV-Licht (366 nm) 67 4.4.2.1 Wechselwirkung zwischen H2O2 und UV-Licht (366 nm) 67 4.4.3 Bestrahlung mit visuellem Licht (VIS 530 - 575 nm) 68 4.4.4 Grenzen der Methode und Fehlerbetrachtung 69 4.5 Ausblick 70 5 Zusammenfassung 72 6 Summary 75 7 Literaturverzeichnis 77 8 Anhang 84 8.1 Abbildungsverzeichnis 84 8.2 Tabellenverzeichnis 92 8.3 Tabellen mit Daten zu den Abbildungen 96 8.3.1 Einfluss von PI auf die Plasmidkonformation 96 8.3.2 Einfluss von DMSO auf die Konformationsänderung durch PI 99 8.3.3 Einfluss von H2O2 auf die Plasmid-DNA und Wirkung von DMSO 100 8.3.4 Einfluss von H2O2 und PI auf die Plasmid-DNA 101 8.3.5 Einfluss von SnCl2 im TechneScan PYP-Kit auf die Plasmid-DNA 102 8.3.6 Einfluss von DMSO auf die Schädigung durch SnCl2 102 8.3.7 Einfluss von H2O2 auf die Schädigung durch SnCl2 103 8.3.8 Einfluss von DMSO auf die Schädigung durch H2O2 und SnCl2 104 8.3.9 Schädigung durch Röntgenbestrahlung und Einfluss von DMSO 104 8.3.10 Einfluss von PI auf Schädigung durch Röntgenbestrahlung mit Röhrenspannung von 200 kV und 32 kV 105 8.3.11 Bestrahlung mit 99mTc und Einfluss von PI 106 8.3.12 Bestrahlung mit 188Re und Einfluss von PI 107 8.3.13 Bestrahlung mit 223Ra und Einfluss von PI 108 8.3.14 Bestrahlung mit UV-Licht (254 nm) und Einfluss von PI 109 8.3.15 Einfluss von DMSO auf die Schädigung durch UV-Bestrahlung mit 254 nm 110 8.3.16 Bestrahlung mit UV-Licht (366 nm) und Einfluss von PI 110 8.3.17 Einfluss von H2O2 auf die Bestrahlung mit UV-Licht (366 nm) 110 8.3.18 Einfluss von DMSO auf die Schädigung durch H2O2 und UV- Bestrahlung (366 nm) 111 8.3.19 Bestrahlung mit VIS (530-575 nm) und Einfluss von PI 112 8.3.20 Einfluss von DMSO auf die Schädigung durch PI und VIS-Bestrahlung 113 8.3.21 Vergleich Strahlenqualitäten 114 9 Erklärung zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 116 10 Erklärung zur Einhaltung gesetzlicher Vorgaben 117 11 Danksagung 118

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Les cellules endothéliales sinusoïdales (CES) sont très sensibles aux dommages induits par la préservation hypothermique. Elles peuvent alors exprimer, suite à une augmentation de leur Ca2+, des molécules d'adhésion perturbant la microcirculation et engendrant des dysfonctions primaires des greffons. Le présent travail a pour but l'étude des effets des changements de composition/température des solutions de reperfusion sur le Ca2+ dans les CES isolées de rat. Les cellules ont été préservées à froid dans la solution de l'Université du Wisconsin (UW) puis réchauffées et reperfusées dans le tampon physiologique HEPES ou dans le UW à 20 ou 37°C. Les changements de température et de solution ou seulement de solution ont induit, chez les CES préservées ou non, une importante augmentation transitoire du Ca2+. Le changement de la température seulement dans le UW ou l'HEPES n'a pas eu d'effet significatif sur le Ca2+. D'autre part, la préservation froide atténuait beaucoup la fréquence et l'intensité de la réponse des CES à l'agoniste ATP. Par ailleurs, une coloration des CES au Hoechst et à l'iodure de propidium démontrait des taux d'apoptose et de nécrose augmentant proportionnellement au temps de préservation. Les taux d'apoptose étaient plus importants que ceux de nécrose. Ainsi, les changements de composition des solutions de reperfusion ont un plus grand effet sur le Ca2+ des CES que les changements de température. Les temps de préservation hypothermique n'ont pas d'impacts importants sur le Ca2+, mais affectent une réponse à l'agoniste ATP, et induisent des taux d'apoptose et de nécrose augmentant graduellement.

Esta pesquisa comparou a incorporação de iodeto de propídio (IP) com a avaliação simultânea de corantes indicativos de danificação em membrana e atividade enzimática (Live/Dead Cell Assay®) para a estimar a viabilidade de cistos de Giardia muris e oocistos de Cryptosporidium parvum. Além disso, foram testados métodos de recuperação de (oo)cistos em amostras de lodo e água de lavagem de filtros (ALF) geradas em escala de bancada, simulando tratamento de água por ciclo completo com decantação. Dentre os métodos estudados para a detecção de G. muris e C. parvum inoculados em amostras de lodo, destacou-se a floculação com sulfato férrico, seguida de separação imunomagnética (IMS). Realizou-se, portanto, ensaio de qualidade analítica com ColorSeedTM, para este método, tendo atendido ao requerido pelo Método 1623.1 da USEPA (2012) para Giardia spp. (32,25%; CV=9,00%), mas não tendo sido suficiente para Cryptostoridium spp. (11,00%; CV=47,67%). O teste com ColorSeedTM em amostras de ALF reproduziu o procedimento de filtração em membrana (FM) com raspagem utilizando Tween® 80 (45°C, 0,1%) seguido de IMS, tendo atendido ao Método 1623.1 para Giardia spp. (13,00%, CV=19,61%), mas não tendo sido suficiente para Cryptostoridium spp. (2,00%; CV=93,54%). Optou-se por este procedimento na avaliação de qualidade analítica, pois o inóculo prévio de suspensões comerciais seguido de recuperação por FM sem IMS superou 100% para C. parvum, devido à utilização de fator de multiplicação. O desempenho do Live/Dead Cell Assay® sobre suspensões comerciais de (oo)cistos foi subjetivo, sobretudo para visualização de organismos enzimaticamente ativos, de modo que optou-se pela inclusão de IP como parâmetro para estimar o efeito dos métodos de recuperação sobre a viabilidade. Em função da baixa recuperação e fluorescência de G. muris, a incorporação de IP foi avaliada apenas em C. parvum. Os resultados reiteraram a dificuldade na recuperação de protozoários em lodo e ALF e o fato de que as particularidades destes procedimentos analíticos podem prejudicar a interpretação de dados de viabilidade. / This study compared the incorporation of propidium iodide (PI) with the simultaneous evaluation of dyes that indicate both membrane damage and enzymatic activity (Live/Dead Cell Assay®) to assess the viability of Giardia muris cysts and Cryptosporidium parvum oocysts. In addition, methods of recovering protozoan cysts and oocysts from sludge and filter backwash water (FBW) samples generated on bench scale, simulating conventional water treatment with decantation, were tested. Among the studied methods for detection of G. muris and C. parvum spiked into sludge samples, ferric sulphate flocculation followed by immunomagnetic separation (IMS) lead to higher recoveries. An analytical quality assay was therefore carried out with ColorSeedTM having met the USEPA Method 1623.1 (2012) recommendation for Giardia spp. (32.25%, CV=9.00%) but not for Cryptostoridium spp. (11.00%, CV = 47.67%). The quality assay test for FBW samples replicated the membrane filtration (MF) procedure using Tween® 80 (45 °C, 0.1%) followed by IMS, having complied with Method 1623.1 for Giardia spp. (13.00%, CV=19.61%) but again not for Cryptostoridium spp. (2.00%; CV=93.54%). This procedure was chosen for the analytical quality exam, since the previous inoculum of commercial suspensions followed by MF without IMS exceeded 100% recovery for C. parvum, due to the use of a multiplication factor. The Live/Dead Cell Assay® performance on commercial suspensions of cysts and oocysts was subjective, especially for visualizing enzymatically active organisms, thus PI inclusion was chosen as the parameter to estimate the effect of recovery methods on the organisms\' viability. Due to the low recovery and poor fluorescence of G. muris, IP inclusion was evaluated only in C. parvum. The results reiterated the difficulty in the recovery of protozoa from sludge and FBW and the possibility of these analytical procedures hinder the interpretation of cysts and oocysts viability.

Fundamentally altering cellular function at a genetic level is a major area of interest in the biologic sciences and the medical community. By engineering transfectable constructs that can be inserted to dysfunctional cellular systems, scientists can mitigate aberrant genetic behavior to produce proper molecular function. While viral vectors have been a mainstay in the past, there are many limitations, particularly related to safety, that have changed the focus of genome editing to incorporate alternative methods for gene delivery. Lance Array Nanoinjection (LAN), a second-generation microfabricated transfection biotechnology, is one of these alternative technologies. LAN works by utilizing both simultaneous electrostatic interaction with molecular loads and physical lancing of hundreds of thousands of target cell membranes. The purpose of this work is to demonstrate LAN in the context of in vitro transfection of immortalized culture cells and primary cells. As part of that exploration, three distinct areas of investigation are considered, which include: characterizing environmental factors that impact LAN transfection, demonstrating LAN genetic modification of immortalized HeLa 229 culture cells using an indicator marker, and lastly, investigating the effects of LAN on human primary, neonatal fibroblasts.

Density of fecal coliforms (FC) such as Escherichia coli is the most commonly used indicator of fecal pathogen content of biosolids. When biosolids are disposed off or used for soil amendment, they pose public health risks. So far anaerobic digesters have been considered to be an effective treatment option for pathogen and FC reduction in biosolids. However, recent studies revealed that there is a significant re-growth and reactivation of indicator organisms in biosolids upon dewatering by centrifugation. Although the exact mechanism of FC reactivation is yet to be understood, a few extensive recent studies strongly suggest that FC go into a viable but non-culturable (VBNC) state during anaerobic digestion. Therefore, quantitative detection of live cells among the total in biosolids samples, without using culturing-based approaches, is highly critical from a public health risk assessment perspective. Since recent investigations proved the significant re-growth and reactivation of indicator organisms. Persistence of DNA in the environment after cell death in the range of days to weeks limits the application of DNA-based approaches for the detection of live bacteria. Using selective nucleic acid intercalating dyes such as ethidium monoazide (EMA) and propidium monoazide (PMA) is one of the alternative approaches to detect and quantify the viable cells by quantitative PCR. These compounds have the ability to penetrate only into dead cells with compromised membrane integrity. They intercalate in the DNA via photo-inducible azide groups and in turn inhibit DNA amplification during PCR reactions. PMA has been successfully used in different studies and microorganisms but it has not been evaluated sufficiently for the complex environmental samples such as biosolids. In this study Escherichia coli ATCC 25922 and uidA gene were used as model organism and as target sequence respectively in absolute quantification method with real-time PCR. Experiments with the known quantities of live and dead cell mixtures showed that PMA treatment inhibits PCR amplification from dead cells with over 99% efficiency. The results of this study conclusively demonstrated that PMA-modified PCR could be successfully applied to the biosolids when total suspended solid (TSS) concentration is 2000 mg/L or below.

Artificial insemination using cooled, transported semen has become a popular practice in the equine industry. However, equine sperm are assumed to show a decline in their fertilizing ability after 24 to 48 hours of cooled storage. Two measures that are commonly used to estimate the fertility of an ejaculate are sperm motility and sperm membrane integrity (SMI). Recently, it has been suggested that SMI may have a better correlation with fertility of an inseminate than sperm motility. The effect of cooled-storage on sperm quality over an extended time period was evaluated to illustrate changes in sperm characteristics that might be related to an ejaculate’s fertility. Semen was stored at 4°C in INRA 96 extender containing 10% seminal plasma for a period of 10 days. Data were collected daily on sperm motion characteristics, SMI, mitochondrial membrane potential, and DNA quality. To measure daily changes in SMI in stallion sperm, two fluorescent vital-staining protocols used in flow cytometric analysis were compared – a combination of SNARF-1, Yo-Pro-1, and Ethidium Homodimer 1 (SYE) and a combination of lectin from Pisum sativum and propidium iodide (PSA/PI). We hypothesized that the SYE protocol adapted for use with stallion sperm could detect more subtle, and perhaps earlier, damage to the sperm plasma membrane than the PSA/PI protocol. A combination of SYBR 14, propidium iodide, and JC-1 (SYPIJC) was used to measure mitochondrial membrane potential, as well as SMI. A computer-assisted sperm motion analysis (CASA) instrument was used to evaluate sperm motion characteristics; the sperm chromatin structure assay (SCSA) was used to measure the degree of DNA fragmentation. In this study, with the exception of sperm motility, the measures of sperm quality retained values consistent with “viability” after 10 days of cooled-storage. This suggests that the fertility of some stallions may last considerably longer than previously assumed, which could ultimately alter the time-table used for artificial insemination using cooled, transported semen.

Adjacent cells communicate through gap junctions (GJs). These GJs are formed by head to head docking of two hemichannels (HCs) from two adjacent cells. HCs are connexin hexamer proteins. Connexin mutation is the most frequent cause of childhood hearing loss. This hearing impairment affects 2 in every 2000 children. Inhibition of the HCs might be the key factor to treat such disorders. A library of amphiphilic kanamycins was synthesized to be tested as HC inhibitors. These compounds showed excellent inhibition activity in comparison with the parent compound (kanamycin A) with less toxicity. A library of monosaccharide esters with varying carbon chain lengths (acetyl (C2) to hexadecyl (C16)) were synthesized, characterized, and tested for bioactivity. Carbohydrate esters showed low toxicity while remaining active against bacteria and fungi. The compound 6-O-tetradecanoyl-D-mannopyranose (MAN014), a mannose ester with a fourteen-carbon chain, showed the greatest antibacterial and antifungal properties. A mode of action study was tested against Staphylococcus aureus (bacteria) and Fusarium graminearum (fungus) and found the compound perturbed the cell membrum.

In der Pathogenese der Temporallappenepilepsie wird kindlichen hippokampalen Schädigungen eine wesentliche Rolle zugeschrieben. Epileptische Krämpfe und perinatale Asphyxie sind zwei häufige Ursachen dieser Schädigungen. Anhaltende epileptiforme Aktivität im Niedrig-Mg2+-Modell als einer experimentellen Form epileptischer Krämpfe führt in organotypischen hippokampalen Schnittkulturen (OHSK) der Ratte, die als Ersatzsystem des kindlichen Hippokampus verwendet werden, zu Zellschäden. Während dieser Untersuchungen ergab sich der Verdacht auf eine zusätzlich schädigende Wirkung erhöhter Sauerstoffspannungen. In meiner ersten Versuchsreihe konnte ich nachweisen, dass erhöhte Sauerstoffspannungen (60 %, 95 %) verglichen mit 20%-Sauerstoffspannung zu reversiblen und irreversiblen Zellschäden in OHSK führen. Die Zellschäden wurden über Veränderungen reizinduzierter Feldpotentiale, d.h. Abnahme der Amplitude, Zunahme der Latenz und Zunahme des Doppelpulsindex, sowie über die Propidium Jodid (PJ)-Fluoreszenzintensität bestimmt. In der zweiten Versuchsreihe konnte gezeigt werden, dass erhöhte Sauerstoffspannungen auch nach einer Hypoxie im Sinne einer hyperoxischen Reoxygenierung verglichen mit normoxischer Reoxygenierung vermehrt Zellschäden in OHSK zur Folge haben. In der dritten Versuchsreihe konnte ich ausschließen, dass erhöhte Sauerstoffspannungen eine notwendige Bedingung für Zellschäden infolge anhaltender epileptiformer Aktivität sind. Um die zellschädigende Rolle von Spreading Depressions (SDs), die während epileptiformer Aktivität auftreten, zu bestimmen, wurde in der vierten Versuchsreihe eine Methode etabliert, SD-ähnliche Ereignisse isoliert und zuverlässig in normoxischen OHSK auszulösen. Auf diese Weise wiederholt ausgelöste SD-ähnliche Ereignisse führten zu Zellschäden, bestimmt über die Veränderung elektrophysiologischer Eigenschaften von SD-ähnlichen Ereignissen, Abnahme der Feldpotentialamplitude und PJ-Fluoreszenzintensität. / Hippocampal damage during infancy is thought to play an important role in the pathogenesis of temporal lobe epilepsy. Epileptic seizures and perinatal asphyxia are two frequent causes of these damages. Sustained epileptiform activity induced in the low Mg2+-model of epileptic seizures leads to cell damage in organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) of the rat, which are used as a surrogate for the infantile hippocampus. During a previous study utilising this model the suspicion arose that increased oxygen tension could have an additional damaging effect. My first series of experiments proved that increased oxygen tension (60 %, 95 %) lead to reversible and irreversible cell damage in OHSC compared to 20%-oxygen tension. Cell damage was determined by alterations of evoked field potentials, i.e. decrement of amplitude, increment of latency and paired pulse index, as well as by propidium iodide fluorescence. The second series of experiments showed that increased oxygen tension applied after an hypoxic period (hyperoxic reoxygenation) result in augmented cell damage compared to normoxic reoxygenation. With the third series of experiments it could be excluded that increased oxygen tension is an essential condition for the occurrence of cell damage due to sustained epileptiform activity. In order to elucidate the damaging role of spreading depressions (SD), which emerge during epileptiform activity, a method was established in the fourth series of experiments that allowed the reliable induction of SD-like events in normoxic OHSC. Repetitive SD-like events induced by this method led to cell damage, assessed by alterations of electrophysiological characteristics of SD-like events, decrement of evoked field potential amplitude and propidium iodide fluorescence.