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<p>There is increasing evidence that prostate tumours are organized as a hierarchy with rare cancer stem cells (CSCs) implicated in initiating and maintaining the tumour. However, prospective prostate cancer stem cells (PCSCs) have not been thoroughly characterized from primary tissue specimens. Using the DU145 cell line, PCSCs have been propagated as non-adherent spheres <em>in vitro</em>. Approximately 1.25% of monolayer DU145 cells formed primary spheres while 26% of sphere cells formed subsequent spheres; a measure of PCSC self-renewal capacity. Spheres are enriched for cells expressing prostate basal and luminal cytokeratins and CSC markers (CD44, CD24, integrin alpha2beta1). PCSCs initiate xenograft tumours with enhanced capacity compared to monolayer cells. While epidermal growth factor (EGF) promoted PCSC propagation, basic fibroblast growth factor (bFGF) inhibited these events. Activation of EGF receptor (EGFR) signalling, following EGF treatment or expression of constitutively-active EGFR (EGFRvIII), increased sphere formation. Conversely, attenuation of EGFR signalling inhibited PCSC self-renewal. Consistent with the MEK-ERK pathway being a major target of EGFR signalling, the MEK-ERK pathway contributes to EGFR-facilitated PCSC propagation. Inhibition of ERK activation following MEK inhibitor treatment, expression of dominant-negative MEK1(K97M), or knockdown of ERK1 or ERK2 reduced PCSC propagation. Therefore, EGFR signalling promotes PCSC self-renewal by activating the MEK-ERK pathway.</p> <p>SOX2 is an essential transcription factor for stem cells, however, its role in PCSCs remains unclear. SOX2 protein is upregulated in PCSCs propagated as spheres, and its expression is regulated by EGFR signalling. EGFR activation, following EGF treatment or expression of constitutively-active EGFRvIII, increased SOX2 expression and PCSC self-renewal, while being attenuated by EGFR inhibitor treatment. Ectopic SOX2 expression enhanced EGF-induced PCSC self-renewal, while SOX2 knockdown renders PCSCs non-responsive to EGF-induced self-renewal and reduced their anchorage-independent growth. Furthermore, SOX2 expression is associated with the ability of PCSCs to form aggressive xenograft tumours. Collectively, SOX2 regulates EGFR-mediated PCSC self-renewal.</p> / Doctor of Philosophy (PhD)

Das Prostatakarzinom (PCa) ist die häufigste bösartige Tumorerkrankung des Mannes in Deutschland. Im Jahr 2019 wurden über 68.000 Neuerkrankungen in Deutschland verzeichnet. Die Inzidenz des PCas korreliert mit dem Alter der Patienten. Aufgrund dessen wird jedem Mann ab dem 45. Lebensjahr eine Früherkennungsdiagnostik empfohlen. Diese beinhaltet eine digitalrektale Untersuchung (DRU) sowie die Messung des prostataspezifischen Antigens im Serum (sPSA). Zeigt sich eine dieser Untersuchungen auffällig, ist eine Prostatastanzbiopsie indiziert. Immer häufiger wird in diesem Zusammenhang eine multiparametrische Magnetresonanztomographie (mpMRT)-gestützte Biopsie durchgeführt. Dies ermöglicht eine gezielte Biopsie von hochgradig karzinomverdächtigen Läsionen mithilfe der Verwendung des Prostate Imaging Reporting and Data System (PI-RADS)-Scores. Allerdings kommt es aufgrund der geringen Spezifität des sPSAs oft zur Überdiagnostik und darauffolgend zur Übertherapie. Das Ziel ist es daher, eine spezifischere Diagnostik zu finden. Zudem ist es erforderlich, eine bessere Prognosevorhersage eines PCas zum Zeitpunkt der Erstdiagnose geben zu können. Dadurch könnte auch die Problematik der Überdiagnostik, insbesondere die ungenügende Diskriminierung zwischen Niedrigrisiko-PCas mit einem Gleason-Score (GS) < 7 und klinisch signifikanten PCas (GS ≥ 7), verringert werden. Um die Invasivität der Früherkennungsdiagnostik des PCas zu verringern, werden immer mehr Forschungen auf dem Gebiet der Blut- und Urindiagnostik – so genannten Flüssigbiopsien –betrieben. Es gibt bereits sPSA-Derivate, die eine erhöhte Spezifität und Sensitivität verglichen zum sPSA aufweisen. So zeigte bereits die Ratio aus freiem sPSA und totalem sPSA (fPSA/PSARatio) sowie die PSA-Dichte (PSAD) ein höheres diagnostisches Potential. In verschiedenen Studien konnte zudem nachgewiesen werden, dass ausgewählte mRNAs und lncRNAs, welche in diversen biologischen Prozessen involviert sind, in PCas differentiell exprimiert werden und damit ggf. ein diagnostisches Potential besitzen. In dieser Arbeit wurden ausgewählte mRNAs (AMACR, DLX1, ERG, EZH2, Hepsin, HOXC6, Prostein, PSGR, PSMA, TRMP8) und lncRNAs (MALAT1, NEAT1, PCA3, PCAT29, PCGEM1, SChLAP1) in Urinsedimenten von 75 Patienten mit PCa-Verdacht vor Prostatastanzbiopsie (01/2018-02/2019) mittels quantitativer PCR (qPCR) analysiert. Die Auswahl der Gene erfolgte in Anlehnung einer laborinternen Vorstudie zur Validierung derer Daten anhand einer weiteren Patientenkohorte. Nach Einwilligung der Patienten zur Studienteilnahme erfolgte zunächst eine Blutentnahme zur Bestimmung des sPSA-Wertes sowie eine post-DRU-Uringewinnung. Anschließend wurden die Urinzellen und die darin enthaltene RNA isoliert. Im Anschluss an die qPCR-Expressionsanalysen erfolgte die Evaluierung von ausgewählten Referenzgenen (ACPP, KLK2, PPIA, PSA, RPLP0, SPDEF, TBP) und letztendlich die Bestimmung des diagnostischen Potentials der ausgewählten Marker-RNAs mittels ROC-Kurven-Analysen inklusive der Bestimmung der Area under the Curve (AUC), Gesamttrefferquote (ACC), Sensitivität (Sens) und Spezifität (Spez). Die Referenzgene PPIA, RPLP0 und TBP wiesen die höchste Stabilität auf, sodass das geometrische Mittel dieser Gene zur Normalisierung der Markergen-Expression für diese Arbeit verwendet wurde. Da KLK2, PSA und SPDEF sich in den Analysen als Referenzgene ungeeignet zeigten, wurden sie im Verlauf ebenfalls hinsichtlich ihres diagnostischen Potentials evaluiert. Bei der Detektion jeglicher PCas in der Gesamtkohorte zeigten sich alle untersuchten klinischpathologischen Parameter (sPSA, PSAD, fPSA/PSA-Ratio, DRU, maxPI-RADS) bis auf die DRU signifikant mit AUC-Werten von 0,685-0,766 (ACC 39-75 %, Sens 33-87 %, Spez 5-78 % anhand etablierter Cut-Off-Werte). Das sPSA zeigte sich in diesem Zusammenhang zwar einerseits mit der höchsten Sensitivität von 87 %, auf der anderen Seite verzeichnete das sPSA mit Abstand sowohl die geringste Spezifität (5 %) als auch die niedrigste ACC (39 %). Die Transkripte AMACR, PCA3, PSA, PSGR und SPDEF waren in Urinsedimenten von PCa-Patienten signifikant höher exprimiert und konnten als Marker mit einem diagnostischen Potential mit AUC-Werten von 0,640- 0,702 identifiziert werden (ACC 65-70 %, Sens 50-77 %, Spez 59-81 %), wobei AMACR der beste Einzelmarker war. Die Kombination dieser fünf Marker (5-Marker-Kombi) mit und ohne Hinzunahme von sPSA, PSAD bzw. fPSA/PSA-Ratio verzeichnete signifikante AUC-Werte von 0,795-0,850 (ACC 75-76 %, Sens 73-90 %, Spez 63-76 % anhand etablierter Cut-Off-Werte). Das beste diagnostische Potential erzielte die 5-Marker-Kombi + fPSA/PSA-Ratio. Bei der Detektion klinisch signifikanter PCas (GS ≥ 7) in der Gesamtkohorte zeigten sich signifikante AUC-Werte von 0,729-0,768 bei der PSAD, der fPSA/PSA-Ratio und des maxPIRADS (ACC 68-72 %, Sens 67-86 %, Spez 60-74 % anhand etablierter Cut-Off-Werte). Bei der Detektion klinisch signifikanter PCas waren die Transkripte AMACR, PCA3, PSA und SPDEF in Urinsedimenten bei PCa-Patienten signifikant höher exprimiert und konnten als Marker mit einem diagnostischen Potential mit AUC-Werten von 0,650-0,714 identifiziert werden (ACC 68-76 %, Sens 48-71 %, Spez 68-88 %), wobei PSA der beste Einzelmarker war. Die Kombination dieser vier Marker mit und ohne Hinzunahme von sPSA, PSAD bzw. fPSA/PSA-Ratio verzeichnete signifikante AUC-Werte von 0,811-0,864 (ACC 75-76 %, Sens 71-91 %, Spez 68-78 % anhand etablierter Cut-Off-Werte). Bei der Detektion der klinisch signifikanten PCas verzeichnete die 4- Marker-Kombi sowohl allein als auch unter Hinzunahme von sPSA das beste diagnostische Potential. Bei der Detektion jeglicher PCas in der Teilkohorte mit einem sPSA ≤ 10 ng/ml erzielten alle klinisch-pathologischen Parameter bis auf die DRU signifikante AUC-Werte von 0,673-0,803 (ACC 42-76 %, Sens 55-91 %, Spez 7-90 % anhand etablierter Cut-Off-Werte). In der Teilkohorte war nur das Transkript PSGR signifikant höher exprimiert und konnte als einziger Marker mit einem diagnostischen Potential mit einem AUC-Wert von 0,683 identifiziert werden (ACC 72 %, Sens 59 %, Spez 81 %). Für die Transkripte AMACR, PCA3 und PSA konnte in dieser Teilkohorte nur per Trend ein diagnostisches Potential detektiert werden. Da in der Teilkohorte sPSA ≤ 10 ng/ml mit PSGR nur ein signifikantes Transkript nachgewiesen werden konnte, erfolgte keine Marker-Kombination. Mit dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die in Urinsedimenten gemessenen RNAs AMACR, PCA3, PSA, PSGR und SPDEF ein diagnostisches Potential haben. Außerdem konnte gezeigt werden, dass durch die Kombination von Markern zusammen mit klinisch-pathologischen Parametern ein größeres diagnostisches Potential erzielt werden kann. Dies äußerte sich insbesondere durch eine höhere Spezifität verglichen zur alleinigen Verwendung des sPSAWertes. In dieser Arbeit präsentierten sich die klinisch-pathologischen Parameter hinsichtlich des diagnostischen Potentials überdurchschnittlich gut. So zeigten sich im Vergleich zur laborinternen Vorstudie bei der Detektion jeglicher PCas nicht nur die PSAD mit signifikanten AUC-Werten, sondern zusätzlich auch das sPSA, die fPSA/PSA-Ratio und der maxPI-RADS. Zudem konnte ein Teil der Marker der laborinternen Vorstudie mit diagnostischem Potential (AMACR, KLK2, PCA3, PSA, PSGR, SChLAP1, SPDEF) im Rahmen dieser Arbeit validiert werden. Um die Marker als diagnostisches Mittel in den klinischen Alltag zu implementieren, ist jedoch eine Validierung anhand einer größeren prospektiven Patientenkohorte nötig.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 1.1 Das Prostatakarzinom 1 1.1.1 Epidemiologie 1 1.1.2 Ätiologie und Prävention 1 1.1.3 Symptome und Diagnostik 3 1.1.4 Therapie 11 1.2 Wertigkeit verschiedener diagnostischer Methoden 14 1.2.1 sPSA und Derivate 14 1.2.2 DRU 18 1.2.3 TRUS 18 1.2.4 Prostatastanzbiopsie 19 1.3 Weitere Diagnosemöglichkeiten 21 1.3.1 sPSA-basierte Biomarker-Tests 21 1.3.2 Molekulare Biomarker 23 1.4 Laborinterne Vorstudie 31 2 Zielstellung 35 3 Material und Methoden 36 3.1 Material 36 3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien 36 3.1.2 Chemikalien 37 3.1.3 Software 39 3.2 Patientenkohorte 39 3.3 Methoden 40 3.3.1 Urinzellen-Isolation 40 3.3.2 RNA-Präparation 40 3.3.3 Photometrische RNA-Konzentrationsbestimmung mittels NanoDrop 41 3.3.4 RNA-Konzentrationsbestimmung und Qualitätskontrolle mittels Agilent 2100 Bioanalyzer 41 3.3.5 cDNA-Synthese 42 3.3.6 Präamplifikation 43 3.3.7 Quantitative Echtzeit-PCR 43 3.3.8 Statistik 44 4 Ergebnisse 49 4.1 Patientenkohorte 49 4.2 Evaluation der Referenzgene und Auswahl der besten Referenzgenkombination 52 4.3 CP-Werte der Markergene in der Gesamtkohorte 55 4.4 Relative Expression der Markergene 56 4.4.1 Expressionslevel in jeglichen PCas in der Gesamtkohorte 56 4.4.2 Expressionslevel in klinisch signifikanten PCas in der Gesamtkohorte 59 4.4.3 Expressionslevel in jeglichen PCas in der Teilkohorte mit sPSA ≤ 10 ng/ml 62 4.5 Expressionslevel der Markergene in Abhängigkeit von klinisch-pathologischen Parametern 64 4.6 Diagnostisches Potential für die Detektion jeglicher PCas in der Gesamtkohorte 71 4.6.1 Klinisch-pathologische Parameter 71 4.6.2 Markergene 74 4.6.3 Kombinationen von klinisch-pathologischen Parametern und Markergenen 78 4.7 Diagnostisches Potential für die Detektion klinisch signifikanter PCas (GS ≥ 7) in der Gesamtkohorte 82 4.7.1 Klinisch-pathologische Parameter 82 4.7.2 Markergene 85 4.7.3 Kombinationen von klinisch-pathologischen Parametern und Markergenen 89 4.8 Diagnostisches Potential für die Detektion jeglicher PCas in der Teilkohorte mit sPSA ≤ 10 ng/ml 92 4.8.1 Klinisch-pathologische Parameter 92 4.8.2 Markergene 95 5 Diskussion 99 5.1 Patientenkohorte 99 5.2 Evaluation der Referenzgene 100 5.3 Expressionslevel und diagnostisches Potential im Vergleich zur laborinternen Vorstudie 102 5.3.1 Klinisch-pathologische Parameter 102 5.3.2 Markergene 104 5.3.3 Kombination von klinisch-pathologischen Parametern und Markergenen 106 5.4 Expressionslevel und diagnostisches Potential im Vergleich zu anderen Studien 108 5.4.1 Überblick 108 5.4.2 AMACR 110 5.4.3 PCA3 111 5.4.4 PSGR 113 5.4.5 KLK2, PSA und SPDEF 114 5.4.6 DLX1 und HOXC6 116 5.4.7 MALAT1, SChLAP1 und PCAT29 117 5.4.8 Nicht signifikante Markergene 119 5.5 Flüssigbiopsien 121 5.6 Ausblick 122 5.6.1 MiRNAs 122 5.6.2 Urinexosomen 123 6 Zusammenfassung 124 7 Summary 127 8 Literaturverzeichnis 130 9 Abbildungsverzeichnis 151 10 Tabellenverzeichnis 153 11 Danksagung 156 12 Anhang 157 12.1 Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 157 12.2 Bestätigung über Einhaltung der aktuellen gesetzlichen Vorgaben 158

Das Prostatakarzinom (PCa) ist die häufigste Krebsneuerkrankung und die zweithäufigste Krebstodesursache des Mannes in Deutschland. Die etablierten Tumormarker führen aufgrund ihrer unzureichenden diagnostischen Sensitivität und Spezifität zu Überdiagnosen mit folglich unnötigen Prostatabiopsien und den damit verbundenen klinischen Komplikationen. Darüber hinaus kann die derzeitige PSA-basierte Screeningpraxis nicht zuverlässig zwischen indolenter Erkrankung und therapienotwendigem Krebs unterscheiden. Auf DNA-Methylierung basierende Biomarker haben ein erhebliches Potenzial für die klinisch-chemische Labordiagnostik sowohl als tumorspezifische Biomarker für die Früherkennung oder posttherapeutische Überwachung von Krebs als auch als prognostische und prädiktive Biomarker für die therapeutische Stratifizierung. In dieser Arbeit erfolgte die Entwicklung neuer krebsspezifischer Methylierungs-Biomarker unter Anwendung OBBPA-ddPCR-basierter Assays. Diese neue Methode ermöglicht die Identifizierung geringster Mengen methylierter zellfreier-Tumor-DNA vor einem hohen Hintergrund von unmethylierter Wildtyp-DNA in Form einer minimal invasiven Blutprobenentnahme (liquid biopsy). Die Methylierungs-Biomarker beruhen auf Gensequenzen, welche zwischen gesunden Probanden und Patienten mit benigner Prostatahyperplasie (BPH) und PCa signifikante Methylierungsunterschiede aufweisen. Die Methylierungs-Biomarker RASSF1, SOX8, GSTP1, mir129-2, CCDC181, PAI1 und NRIP3, welche eine hohe diagnostische Sensitivität bei hoher diagnostischer Spezifität aufweisen, wurden zu einem Marker-Panel kombiniert. Anschließend wurde die Eignung dieses Panels als diagnostische Tumormarker in einer weiteren Probenserie validiert. Die Proben der Optimierungs- und Validierungsprobenserie beruhten auf Serumproben von 52 gesunden Probanden, sechs BPH-Patienten und 43 PCa-Patienten. Dabei erreichte das Biomarker-Panel eine diagnostische Sensitivität von 81,40 % bei einer diagnostischen Spezifität von 100 %. Die Methylierungsanalyse der cfDNA könnte deshalb als sinnvolles Hilfsmittel, ergänzend zur PSA-Bestimmung im Serum, bei der PCa-Frühdiagnose eingesetzt werden. Außerdem legen die Ergebnisse dieser Arbeit nahe, dass die Anzahl der methyliert vorliegenden epigenetischen Biomarker des Panels als prognostischer Parameter sowie zur Verlaufskontrolle und Risiko-Stratifizierung der Tumorerkrankung dienen könnte. Um diese Daten zu bestätigen und das Potenzial der cfDNA-Methylierungsanalyse weiter einschätzen zu können, bedarf es jedoch weiterer Untersuchungen mit größerer Stichprobenanzahl, verbesserter Präanalytik und größeren Probenvolumen.:Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Prostatakarzinom 1.2 Benigne Prostatahyperplasie 1.3 Tumor-/Biomarker 1.3.1 Flüssigbiopsie „Liquid biopsy“ 1.3.2 Zirkulierende zellfreie (Tumor-)DNA 1.3.3 Methylierung der cfDNA 1.3.4 Etablierte Tumor-Biomarker – Das Prostataspezifisches Antigen 1.4 Verfahren zu DNA-Methylierungsanalyse 1.4.1 Experimentelle Tumor-Biomaker 1.4.2 State-of-the-Art Methylierungsanalyse-Methoden 1.4.3 OBBPA-ddPCR 1.5 Motivation und Hintergrund 2 Material 2.1 Biologisches Material 2.2 Primer und Sonden 2.3 Chemikalien und Reagenzien 2.4 Puffer und Lösungen 2.5 Kitsysteme 2.6 Laborgeräte 2.7 Software 2.8 Verbrauchsmaterial 3 Methoden 3.1 Biomarker-Recherche 3.2 Primer- und Sondendesign 3.3 Whole genome amplification (WGA) des 0%-DNA-Standards (0%-SD) 3.4 Methyltransferase-Behandlung des 100%-SD 3.5 Aufreinigung der Standards 3.6 Quantitative real-time PCR (qPCR) und Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM)-PCR 3.7 Agarose-Gelelektrophorese 3.8 Isolierung zellfreier DNA aus Blutproben 3.9 DNA-Konzentrationsbestimmung 3.10 Bisulfitkonversion 3.11 Optimierte Bias-basierte Prä-Amplifikation mit anschließender ddPCR (OBBPA-ddPCR) 3.11.1 Präamplifikation 3.11.2 Droplet Digital PCR (ddPCR) 3.12 Datenanalyse 3.13 Statistische Analyse 4 Ergebnisse 4.1 Ergebnisse der Biomarker-Recherche 4.2 Ergebnisse der qPCR und MS-HRM-PCR 4.2.1 Ermittlung der qPCR TA, TM und Cq-Werte der neuen Marker 4.2.2 Testung der neuen Marker in der MS-HRM-PCR an Serumproben von gesunden Probanden und PCa-Patienten 4.3 Ergebnisse der Primer- und Sondenbedingungen der OBBPA-ddPCR 45 4.3.1 ddPCR-Bedingungen 4.3.2 Präamplifikationsbedingungen 4.4 Ergebnisse der Datenanalyse und Auswertungsoptimierung 4.4.1 Datenanalyse 4.4.2 OBBPA-ddPCR-Bedingungen des Marker-Panels 4.5 Ergebnisse der Blutuntersuchungen 4.5.1 Vergleich der PCa-, BPH- und GM-Kohorten hinsichtlich ihres DNA-Methylierungsanteils 4.5.2 Vergleich der PCa-Subkohorten unterschiedlicher PSA-Wertbereiche hinsichtlich ihres Methylierungsanteils 4.5.3 Vergleich der Marker hinsichtlich ihrer diagnostischen Sensitivität bei 100 %iger diagnostischer Spezifität 4.5.4 Vergleich der diagnostischen Sensitivität der einzelnen Marker und des Marker-Panels hinsichtlich PCa-Proben unterschiedlicher PSA-Konzentrationsbereiche 4.5.5 Vergleich der Optimierungs- und Validierungsprobenserie hinsichtlich ihrer diagnostischen Sensitivität bei einer diagnostischen Spezifität von 100 % 5 Diskussion 5.1 Limitierungen etablierter PCa-Tumormarker 5.2 Suche und Etablierung eines neuen Biomarker-Panels 5.3 Ergebnisse des neu entwickelten Biomarker-Panels 5.3.1 GSTP1 5.3.2 RASSF1A 5.3.3 SOX8 5.3.4 CCDC181 5.3.5 MIR129-2 5.3.6 PAI-1 5.3.7 NRIP3 5.4 Gesamt-Performance des Biomarker-Panels 5.5 Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Referenzen 9 Anhang Danksagung Anlage 1: Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens Anlage 2: Bestätigung über Einhaltung der aktuellen gesetzlichen Vorgaben / Prostate cancer (PCa) is the most common newly diagnosed cancer and the second leading cause of cancer-related deaths among men in Germany. The insufficient diagnostic sensitivity and specificity of established tumor markers, lead to overdiagnosis, resulting in unnecessary prostate biopsies and associated clinical complications. Furthermore, the current PSA-based screening practice cannot reliably distinguish between indolent disease and clinically significant cancer. DNA methylation-based biomarkers have significant potential for clinical laboratory diagnostics, both as tumor-specific biomarkers for early detection or post-therapeutic monitoring of cancer, and as prognostic and predictive biomarkers for therapeutic stratification. This study aimed to develop novel cancer-specific methylation biomarkers using OBBPA-ddPCR-based assays. This new method enables the identification of minute amounts of methylated cell-free tumor DNA amidst a high background of unmethylated wild-type DNA, using a minimally invasive blood sample collection (liquid biopsy). The methylation biomarkers are based on gene sequences that exhibit significant methylation differences between healthy individuals and patients with benign prostatic hyperplasia (BPH) and PCa. The methylation biomarkers RASSF1, SOX8, GSTP1, mir129-2, CCDC181, PAI1, and NRIP3, which demonstrate high diagnostic sensitivity with high diagnostic specificity, were combined into a marker panel. Subsequently, the suitability of this panel as diagnostic tumor marker was validated in an additional series of samples. The optimization and validation sample series consisted of serum samples from 52 healthy individuals, six BPH patients, and 43 PCa patients. The biomarker panel achieved a diagnostic sensitivity of 81.40% with a diagnostic specificity of 100%. Therefore, the methylation analysis of cfDNA could serve as a valuable addition to serum PSA determination in the early diagnosis of prostate cancer. Additionally, the results of this study suggest that the number of hypermethylated epigenetic biomarkers of the selected panel could serve as a prognostic parameter, as well as for disease monitoring and risk stratification. However, further investigation with larger sample sizes, improved pre-analytical procedures, and larger sample volumes is needed to confirm these findings and assess the potential of cfDNA methylation analysis.:Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Prostatakarzinom 1.2 Benigne Prostatahyperplasie 1.3 Tumor-/Biomarker 1.3.1 Flüssigbiopsie „Liquid biopsy“ 1.3.2 Zirkulierende zellfreie (Tumor-)DNA 1.3.3 Methylierung der cfDNA 1.3.4 Etablierte Tumor-Biomarker – Das Prostataspezifisches Antigen 1.4 Verfahren zu DNA-Methylierungsanalyse 1.4.1 Experimentelle Tumor-Biomaker 1.4.2 State-of-the-Art Methylierungsanalyse-Methoden 1.4.3 OBBPA-ddPCR 1.5 Motivation und Hintergrund 2 Material 2.1 Biologisches Material 2.2 Primer und Sonden 2.3 Chemikalien und Reagenzien 2.4 Puffer und Lösungen 2.5 Kitsysteme 2.6 Laborgeräte 2.7 Software 2.8 Verbrauchsmaterial 3 Methoden 3.1 Biomarker-Recherche 3.2 Primer- und Sondendesign 3.3 Whole genome amplification (WGA) des 0%-DNA-Standards (0%-SD) 3.4 Methyltransferase-Behandlung des 100%-SD 3.5 Aufreinigung der Standards 3.6 Quantitative real-time PCR (qPCR) und Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM)-PCR 3.7 Agarose-Gelelektrophorese 3.8 Isolierung zellfreier DNA aus Blutproben 3.9 DNA-Konzentrationsbestimmung 3.10 Bisulfitkonversion 3.11 Optimierte Bias-basierte Prä-Amplifikation mit anschließender ddPCR (OBBPA-ddPCR) 3.11.1 Präamplifikation 3.11.2 Droplet Digital PCR (ddPCR) 3.12 Datenanalyse 3.13 Statistische Analyse 4 Ergebnisse 4.1 Ergebnisse der Biomarker-Recherche 4.2 Ergebnisse der qPCR und MS-HRM-PCR 4.2.1 Ermittlung der qPCR TA, TM und Cq-Werte der neuen Marker 4.2.2 Testung der neuen Marker in der MS-HRM-PCR an Serumproben von gesunden Probanden und PCa-Patienten 4.3 Ergebnisse der Primer- und Sondenbedingungen der OBBPA-ddPCR 45 4.3.1 ddPCR-Bedingungen 4.3.2 Präamplifikationsbedingungen 4.4 Ergebnisse der Datenanalyse und Auswertungsoptimierung 4.4.1 Datenanalyse 4.4.2 OBBPA-ddPCR-Bedingungen des Marker-Panels 4.5 Ergebnisse der Blutuntersuchungen 4.5.1 Vergleich der PCa-, BPH- und GM-Kohorten hinsichtlich ihres DNA-Methylierungsanteils 4.5.2 Vergleich der PCa-Subkohorten unterschiedlicher PSA-Wertbereiche hinsichtlich ihres Methylierungsanteils 4.5.3 Vergleich der Marker hinsichtlich ihrer diagnostischen Sensitivität bei 100 %iger diagnostischer Spezifität 4.5.4 Vergleich der diagnostischen Sensitivität der einzelnen Marker und des Marker-Panels hinsichtlich PCa-Proben unterschiedlicher PSA-Konzentrationsbereiche 4.5.5 Vergleich der Optimierungs- und Validierungsprobenserie hinsichtlich ihrer diagnostischen Sensitivität bei einer diagnostischen Spezifität von 100 % 5 Diskussion 5.1 Limitierungen etablierter PCa-Tumormarker 5.2 Suche und Etablierung eines neuen Biomarker-Panels 5.3 Ergebnisse des neu entwickelten Biomarker-Panels 5.3.1 GSTP1 5.3.2 RASSF1A 5.3.3 SOX8 5.3.4 CCDC181 5.3.5 MIR129-2 5.3.6 PAI-1 5.3.7 NRIP3 5.4 Gesamt-Performance des Biomarker-Panels 5.5 Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Referenzen 9 Anhang Danksagung Anlage 1: Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens Anlage 2: Bestätigung über Einhaltung der aktuellen gesetzlichen Vorgaben

Le cancer de la prostate est l’un des cancers les plus fréquents chez les hommes. Le rôle de l’obésité dans son étiologie revêt un intérêt grandissant. Les associations observées sont souvent contradictoires selon le type d’obésité (générale ou abdominale), la durée ou le moment de l’exposition et l’agressivité du cancer. L’obésité abdominale figure parmi les pistes de recherche particulièrement prometteuses. L’objectif général de cette thèse était d’examiner la relation entre l’obésité et le cancer de la prostate, tant au niveau individuel que familial. Nous avons utilisé les données de PROtEuS, une étude cas-témoins populationnelle conduite en 2005-2012 à Montréal. Cette étude comprend un large éventail d’informations anthropométriques et liées aux habitudes de vie, recueillies chez 1931 cas et 1994 témoins de la population générale, ainsi que des informations anthropométriques relatives aux membres de leurs familles respectives. Les deux premiers objectifs spécifiques de la thèse visaient à explorer la corrélation entre différents indicateurs d’obésité et à développer une approche alternative à la mesure directe pour décrire l’obésité abdominale au moyen de modèles prédictifs. Les résultats suggèrent que les silhouettes de Stunkard et Sorensen sont étroitement liées à l’indice de masse corporelle (IMC) et au poids rapporté, tant au moment de l’entrevue que dans le passé. Nous avons montré qu’il était possible de prédire l’obésité abdominale relativement bien (R2=0.64), plus particulièrement la circonférence de la taille, à partir de l’IMC, la silhouette et la taille de pantalon. Les objectifs spécifiques 3 et 4 visaient à examiner l’association entre différents indicateurs d’obésité individuelle à plusieurs âges, ainsi que les trajectoires adultes d'obésité générale et abdominale, et le risque de cancer de la prostate. Nos résultats suggèrent un risque réduit de cancer de la prostate chez les personnes en surpoids ou obèses (rapport de cotes (RC) 0,71; intervalle de confiance à 95% (IC 95%) 0,59 - 0,85). À l’opposé, l’obésité abdominale récente, basée sur plusieurs indicateurs, était associée à un risque accru de cancer de haut grade (RC 1,33; IC 95% 1,03 - 1,71 pour une circonférence de la taille ≥ 102 cm). Les objectifs spécifiques 5 et 6 visaient à évaluer le risque de récurrence familiale d’obésité en fonction du nombre de membres de la famille atteints d’un cancer de la prostate et d’évaluer la co-agrégation familiale de l’obésité et du cancer de la prostate, indépendamment des agrégations familiales de l’obésité et du cancer de la prostate elles-mêmes. Le risque de récurrence familiale d’obésité était plus élevé lorsque deux cas ou plus de cancer de la prostate étaient observés dans la famille qu’en l’absence de cancer et ce, peu importe le nombre de cas d’obésité dans la famille. Pour les familles avec 3 parents présentant une obésité, le risque de récurrence d’obésité était de 0,35 (IC 95% 0,32 – 0,37) pour ceux n’ayant aucun cas de cancer dans la famille et de 0,38 (IC 95% 0,33 – 0,43) pour ceux avec au moins 2 cas de cancer dans la famille. La différence entre les risques de récurrence était encore plus marquée lorsque les familles issues du témoin index étaient comparées à celles dont le cas index avaient une tumeur de grade élevé au diagnostic. Pour les familles avec 3 parents présentant une obésité, le risque de récurrence d’obésité était de 0,35 (IC 95% 0,32 – 0,37) pour ceux dont le participant index était un témoin et de 0,41 (IC 95% 0,36 – 0,45) pour ceux dont le cas index avait une tumeur de grade élevé au moment du diagnostic. Nous n’avons pas observé de co-agrégation familiale entre obésité et cancer de la prostate dans son ensemble. Toutefois, cette co-agrégation était présente pour les cancers apparaissant avant l’âge de 55 ans (RC 1,35; IC 95% 1,11 - 1,65). Les résultats de cette thèse renforcent l’hypothèse d’un rôle important de l’obésité dans le développement du cancer de la prostate. Observation fort novatrice, l’obésité semble plus fréquente dans les familles avec plusieurs diagnostics précoces ou tumeurs agressives. La confirmation du rôle de l’obésité, facteur modifiable, dans l’étiologie de ce cancer très répandu aurait des retombées substantielles sur la santé publique. / Prostate cancer is among the most frequently diagnosed solid tumor among men. The role of obesity in its etiology is of mounting interest. The associations observed have been sometimes contradictory, varying according to the type of obesity (general or abdominal), the duration or the moment of exposure, and cancer aggressiveness. Abdominal obesity represents a promising research avenue. The general objective of this thesis was to examine the relationship between obesity and prostate cancer, both at the individual and familial levels. The main data source used was PROtEuS, a population-based case-control study conducted in 2005-2012 in Montreal. It collected a wide range of anthropometric and lifestyle information from 1,931 cases and 1,994 population controls, as well as information on obesity among their respective family members. The first two specific objectives of the thesis aimed to explore the correlation between different obesity indicators, and to develop an alternative approach to direct measurement to describe abdominal obesity using predictive models. Results suggested that Stunkard and Sorensen's silhouettes were closely related to body mass index (BMI) and reported weight, both at the time of the interview and in the past. The comparison of different predictive models showed that it was possible to estimate abdominal obesity relatively well (R2=0.64), more particularly waist circumference, from BMI, silhouette, and trousers size. Specific objectives 3 and 4 of the thesis aimed at examining the association between different indicators of individual obesity at different ages and adult obesity trajectories, and the risk of prostate cancer. Our results suggest a reduced risk of prostate cancer among overweight and obese people (odds ratio (OR) 0.71, 95% confidence interval (CI) 0.59 - 0.85). In contrast, recent abdominal obesity, estimated from various indices, was associated with an increased risk of high-grade prostate cancer (OR 1.33, 95% CI 1.03 – 1.71 for waist circumference ≥ 102 cm). Specific objectives 5 and 6 aimed to assess the familial recurrence risk of obesity according to the number of family members with prostate cancer and to assess the familial coaggregation of obesity and prostate cancer, independently of familial aggregations of obesity and prostate cancer themselves. The familial recurrence risk of obesity was higher when two or more cases of prostate cancer were observed in the family, than in the absence of cancer, regardless of the number of persons with obesity in the family. For families with 3 parents with obesity, the obesity recurrence risk was 0.35 (95% CI 0.32 – 0.37) for those with no cases of cancer in the family and 0.38 (95% CI 0.33 – 0.43) for those with at least 2 cases of cancer in the family. The difference in recurrence risks was even more marked when families whose index participant was a control were compared to those whose index case had a high-grade tumor at diagnosis. For families with 3 parents with obesity, the recurrence risk of obesity was 0.35 (95% CI 0.32 – 0.37) for those whose index participant was a control and 0.41 (95% CI 0.36 – 0.45) for those whose index case had a high-grade tumor at diagnosis. We did not observe familial co-aggregation between obesity and prostate cancer. However, this co-aggregation was present for cancers appearing before the age of 55 (OR 1.35; 95% CI 1.11 - 1.65). Results of this thesis reinforce the hypothesis of an important role of obesity in the development of prostate cancer. A particularly novel observation, obesity seems to be more frequent in families with several early-onset or aggressive tumours. Confirmation of a role of obesity, a modifiable risk factor, in the etiology of this very common cancer, would have substantial implications for public health.

Die vorliegende Habilitationsschrift "Neue Serummarker bei urologischen Malignomen mit dem Schwerpunkt Prostatakarzinom und Anwendung von Proteinase-Inhibitoren in der Therapie des Prostatakarzinoms" faßt Ergebnisse zusammen, die ich in den Jahren von 1996 bis 2000 als Erstautor in wissenschaftlichen Artikeln von peer reviewed Zeitschriften veröffentlicht habe. Zusätzlich werden 14 Arbeiten mit ihren Aussagen eingeschlossen, bei denen ich als Koautor beteiligt war. Gegenstand der Habilitationsschrift sind Untersuchungen zur diagnostischen Optimierung des Tumormarkers Prostataspezifisches Antigen (PSA) und zum Expressionsverhalten von CD44-Proteinen bzw. Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) als potentielle, neue Marker bei urologischen Karzinomen. Die nachgewiesene Bedeutung der MMPs bei der Tumorprogression und -metastasierung hat mich dazu veranlaßt, tierexperimentelle Studien zur Hemmung der MMP-Aktivität mit synthetischen Inhibitoren in meine Arbeit aufzunehmen. Zielstellung war hierbei die Evaluierung neuer Therapieoptionen beim fortgeschrittenen Tumor. Im Mittelpunkt der Untersuchungen steht das Prostatakarzinom (PCa) als häufigster maligner Tumor des Mannes. 1. Das PSA ist ohne Zweifel der beste Tumormarker in der Diagnostik des PCa. Der Optimierung dieses Markers wird große Bedeutung zugemessen. Dabei werden verschiedene Konzepte verfolgt, wobei die Bestimmung der Isoformen des PSA die zur Zeit erfolgreichste Richtung zu sein scheint. Die Ergebnisse meiner u.a. im Rahmen von Multizenterstudien durchgeführten Untersuchungen belegen den diagnostischen Nutzen der zusätzlichen Bestimmung des f-PSA%, um PCa-Patienten früher zu erkennen und besser gegenüber Patienten mit benigner Prostatahyperplasie (BPH) abgrenzen zu können. Ein weiteres Ergebnis der Untersuchungen zur diagnostischen Validität anderer PSA-Isoformen ist die Feststellung, daß die Bestimmung des gebundenen PSA keinen Vorteil gegenüber dem f-PSA% hat. Widersprüchliche Angaben in der Literatur konnten damit ausgeräumt werden. Diese Ergebnisse veranlaßten die Firma Roche als Kooperationspartner, die Weiterentwicklung eines ACT-PSA Prototyp-Testsystems einzustellen. Die Ergebnisse meiner Untersuchungen zu den PSA-Isoformen haben inzwischen Eingang in den klinischen Alltag gefunden und werden in der Urologischen Klinik der Charité genutzt. Es wurden Entscheidungsgrenzen für den f-PSA%-Wert zur Indikationsstellung von Stanzbiopsien der Prostata als Klinikstandard erarbeitet. 2. Bei verschiedenen urologischen Tumoren wurde das Expressionsverhalten von CD44-Proteinen und MMPs bzw. deren Inhibitoren bestimmt, um eine mögliche Bedeutung bei der Tumorprogression zu erfassen. Diese Untersuchungen sind gleichzeitig Voraussetzung für eine mögliche Anwendung der Komponenten in der Diagnostik und Therapiekontrolle bei diesen Tumorentitäten. Im Gegensatz zu anderen menschlichen Tumoren konnten bei den untersuchten urologischen Tumoren keine veränderten Serumkonzentrationen der CD44-Proteine einschließlich der Varianten nachgewiesen werden. Daher habe ich weiterführende Studien zu den CD44-Proteinen nicht durchgeführt. 3. Im Tumorgewebe sowie im Plasma von Patienten mit PCa und Nierenzellkarzinom konnte ich signifikante Veränderungen von MMPs und deren Inhibitoren nachweisen. Die Situation im Gewebe spiegelt sich zum Teil im Blut der Patienten wider. Diese Beobachtungen beweisen die Bedeutung der MMPs bei der Tumorprogression und -metastasierung. Prinzipiell kann die Bestimmung einzelner MMPs bzw. TIMPs in der Diagnostik von urologischen Tumoren genutzt werden. Die niedrige Sensitivität in der individuellen Erfassung des einzelnen Tumorpatienten schränkt jedoch die praktische Anwendung ein. 4. Die veränderte MMP-Expression bzw. die Dysbalance zwischen MMPs und TIMPs hat mich veranlaßt, synthetische Inhibitoren zur Blockierung der MMP-Aktivität in einem Standardtiermodell des menschlichen PCa einzusetzen. In einer ersten Untersuchung am Dunning-Tumor der Ratte wurde nachgewiesen, daß dieser Tumor MMP9 exprimiert und die Serumkonzentration mit der Tumorgröße korreliert. In weiteren tierexperimentellen Untersuchungen wurde der Einfluß von Batimastat, einem Breitspektrum-Inhibitor der MMPs und einem neuentwickelten, selektiveren Inhibitor (Icol) auf das orthotope Tumorwachstum ermittelt. Beide Substanzen führten zu einer Hemmung des lokalen Tumorwachstums. Durch Applikation von Icol wurde eine Reduzierung des Tumorgewichtes um 90% im Vergleich zu den unbehandelten Kontrolltieren erreicht. Diese Beobachtungen haben eine doppelte Bedeutung. Zum einen beweist die Hemmwirkung von synthetischen MMP-Inhibitoren im Tiermodell die Funktion der MMPs bei der lokalen Tumorprogression. Zum anderen werden durch diese erfolgreichen tierexperimentellen Studien mit neuen Substanzen Voraussetzungen für die klinische Anwendung bei Patienten mit hormonrefraktärem PCa geschaffen. / The aim of my "habilitation thesis" was to evaluate the diagnostic validity of prostate-specific antigen (PSA) in serum and tissue, the serum pattern of CD44 proteins and of the matrix metalloproteinases (MMPs) in serum and tissue of urological malignancies. As MMPs seem to play an important role in tumor progression and metastasis, animal studies were additionally initiated in order to investigate the influence of synthetic inhibitors of MMPs on prostate cancer. 1. PSA is the most important and accurate tumor marker in prostate cancer diagnosis. However, PSA is an organ-specific marker, but is not tumor-specific. Elevated PSA concentrations are seen with non-malignant prostatic diseases like benign prostatic hyperplasia (BPH). Moreover, not all patients with prostate cancer have elevated PSA concentrations. In order to optimize the diagnostic validity of PSA, several concepts have been developed. Determination of the PSA isoforms in serum could help discriminate between prostate cancer and BPH. In various own studies, including a multicenter clinical trial, the determination of free PSA and the calculation the ratio of free PSA to total PSA (fPSA/tPSA) has proven to be a promising tool in prostate cancer diagnosis. Regarding the diagnostic validity of the complexed PSA conflicting data exist. Our results, using a newly developed alpha-1-antichymotrypsin-PSA (ACT-PSA) assay by Roche are contradictory to recent published data. Based on data of a multicenter trial, the determination of ACT-PSA as well as the ACT-PSA to tPSA ratio did not improve the differential diagnostic impact in patients undergoing evaluation for prostate cancer compared to the ratio fPSA/tPSA. 2. In various malignant diseases characteristic alterations in the expression of CD44 proteins and their variants have been observed. In contrast to those observations in other carcinomas, the determination of soluble CD44 proteins in serum is not suitable for detecting and staging patients with urological malignant tumors. Therefore, further investigation have not been performed. 3. Matrix-metalloproteinases (MMP) form a group of endogenous proteases with the common ability to degrade various components of the extracellular matrix. It could be demonstrated that increased levels of MMP are associated with the invasive and metastatic potential in human malignant tumors. However, little is known about the role of MMPs in renal cell carcinoma. In own study significant changes of MMP expression have been observed. Although changes in specific MMPs might be characteristic for renal carcinoma tissues and might be partly reflected in the blood, data shown that even MMP-9 as the best plasma marker, had a low sensitivity in detecting renal cell carcinoma. Increased concentrations of MMP-9 in tumor tissue may have important implications for the therapeutic potential of synthetic inhibitors of MMPs. 4. The importance of inhibitors of MMPs in cancer has been demonstrated in various studies. In own investigations, altered levels of MMPs and their specific inhibitors have been elucidated in prostate cancer. Therefore, a study to evaluate the efficacy of synthetic MMP inhibitors (batimastat, Icol) in a standard prostate cancer animal model was performed. Previously, the high expression of MMP-9 in this prostate cancer (Dunning tumor) compared with normal prostatic tissue could be demonstrated. Batimastat and the newly developed inhibitor Icol reduced the orthotopic tumor weights up to 90% in a dose-dependent manner. This results confirmed the importance of MMPs and their inhibitors in tumor progression. It can be concluded that selective inhibition of MMP activity is a novel therapeutic approach, which bears promise for studies in patients with hormone-refractory prostate cancer.