La connaissance des mécanismes qui contrôlent la transcription des gènes, comme l’interaction de facteurs protéiques au niveau des promoteurs, est essentielle pour comprendre plusieurs fonctions biologiques et espérer traiter certaines pathologies. Nous nous sommes attardés à mieux comprendre les mécanismes qui régulent trois gènes humains dont les patrons d’expression sont différents et qui sont impliqués dans diverses pathologies en tentant de mettre en parallèle les différences structurales et fonctionnelles entre ceux-ci. Les gènes AβPP et p21 sont exprimés chez l’adulte alors que GPC3 est exprimé uniquement chez l’embryon de façon spécifique aux tissus. L’expression d’AβPP est aussi spécifique aux tissus et sa surexpression fait partie des mécanismes mis en cause chez les patients atteints de la maladie d’Alzheimer et du syndrome de Down. Le gène p21 est quant à lui exprimé dans plusieurs types cellulaires et est fortement induit suite à des dommages à l’ADN. Enfin, nous avons montré que GPC3 est exprimé de manière différentielle dans le neuroblastome (NB) et la tumeur de Wilms (WT), deux tumeurs embryonnaires. p21 : La caractérisation du promoteur proximal de p21 dans les fibroblastes humains normaux en prolifération nous a permis de localiser sept empreintes protéiques dont une au niveau de la séquence consensus pour NFI. Les études de retard sur gel, de transfection transitoire, d’immunoprécipitation de la chromatine et d’anti-ARN ont permis de confirmer la liaison de NFI et de le définir comme répresseur important de la transcription de p21. AβPP : Nous avons montré que USF et Sp1 se lient au promoteur de AβPP et que leur liaison est essentielle pour générer une activité maximale du promoteur. La caractérisation in cellulo du promoteur dans les neurones et les astrocytes normaux a révélé huit sites d’interaction ADN-protéine, entre-autres au niveau des sites de liaison des facteurs de transcription CTCF, USF et Sp1. GPC3 : La caractérisation du promoteur de GPC3 nous a permis de montrer 1) une struture chromatinienne particulière tout le long du promoteur et 2) plusieurs empreintes protéiniques putatives dont certaines spécifiques à la lignée SJNB-7 qui exprime GPC3. Parmi ces dernières, nous avons mis en évidence la liaison possible d’un facteur de transcription de type NF-Y. / Gene transcription is the first step to the production of any given protein. Understanding of the molecular mechanisms regulating gene expression, such as the binding of transcription factors to genes promoters, is essential to the understanding of biological functions and to develop new powerful therapies against many clinically documented pathologies. We investigated the transcriptional regulatory mechanisms of three human genes very differently expressed and involved in diverse pathologies in an attempt to reveal structurals and functionals differencies between these mechanisms. AβPP and p21 genes are both expressed in adult while GPC3 is only transcribed in a tissus specific manner before birth. The expression of the AβPP gene is also specific to tissue and its over-expression may be involved in Alzheimer disease and Down syndrome. P21 gene is expressed in many types of cells and is strongly induced by DNA damage. Finally, we demonstrated that GPC3 is differently expressed in neuroblastoma and Wilms' tumor. P21 : The characterization of the proximal promoter from the p21 gene in normal human proliferating fibroblasts revealed seven DNA-protein footprints of which one bears a perfect consensus sequence for the NFI family of transcription factors. EMSA, CHIP, anti-RNA and transient transfection of recombinant constructs analyses clearly demonstrated that NFI interact with the most proximal LMPCR footprint on the p21 promoter and functions as a repressor. Upon serum starvation, a change in the electrophoretic mobility of the NFI DNA-protein complex was observed that may contribute to the activation mechanistic of the p21 gene throughout cell senescence and differentiation. AβPP : We demonstrated that Sp1, like USF, recognizes an element in the human AβPP gene that is necessary for full promoter activity. In cellulo footprinting analysis revealed at least eight DNA-protein interactions including CTCF, USF and many Sp1 target sites. These results were further supported by EMSA and transient transfection analysis. GPC3 : The characterisation of the entire GPC3 gene promoter revealed 1) a particular DNA structure in the promoter and 2) eight large protected regions. The use of competitor oligos in EMSA experiments and super-shift assays showed that an NFY-type transcription factor (TF) may explain the GPC3 aberrant expression in SJNB-7.

L'anémie de Fanconi est une maladie génétique récessive rare, caractérisée par une défaillance de la moelle osseuse, des anomalies du développement et une forte incidence de cancer, essentiellement des leucémies myéloïdes aiguës. L'anémie de Fanconi peut être causée par la mutation de 13 gènes différents, et neuf des protéines Fane sont responsables de la monoubiquitination de FANCD2, qui est donc centrale dans la 'voie Fanconi'. Le complexe MRN joue plusieurs rôles essentiels dans la réparation des cassures double-brin dans l'ADN par recombinaison homologue : dans la signalisation du dommage et dans les points de contrôle du cycle cellulaire, dans la préparation des extrémités de la cassure pour les étapes suivantes de la réparation ainsi qu'un rôle structural afin de faciliter la réparation. Il a été montré précédemment que la protéine FANCD2 colocalise avec NBS1. Cependant, la relation fonctionnelle entre FANCD2 et MRE11 est mal comprise. Mes travaux de doctorat montrent que l'inhibition de MRE11, NBS1 ou RAD50 conduit à la déstabilisation de FANCD2. FANCD2 s'accumule de la phase S à la phase G2 aux sites contenant de l'ADN simple brin ou aux sites de dommages à l'ADN. La protéine FANCD2 purifiée lie préférentiellement d'ADN simple brin en comparaison à différents substrats d'ADN. L'inhibition de l'activité nuclease de MRE11 par le MIRIN diminue le nombre de foyers de FANCD2 formés in vivo. Nous proposons donc que FANCD2 lie l'ADN simple brin provenant de la résection de la cassure double brin par MRE11. Nos données établissent que MRN est un régulateur essentiel de la stabilité et de la fonction de FANCD2 au cours de la réponse aux dommages à l'ADN.

Suite à un traumatisme cérébral, l'activation des astrocytes est impliquée dans la réponse cellulaire inflammatoire. Le passage de la forme quiescente à la forme activée des astrocytes est associé à l'augmentation marquée du filament intermédiaire de type GFAP (glial fibrillary acidic protein). Des études utilisent la protéine GFAP comme marqueur indirect des dommages neuronaux sans toutefois connaître l'implication réelle des astrocytes dans le processus inflammatoire suite à une ischémie cérébrale. C'est pourquoi ce projet a pour but de clarifier la dynamique et le rôle de l'activation des astrocytes suite à une ischémie cérébrale. Pour ce faire, nous avons mis au point un modèle murin pour étudier de façon longitudinale la réponse inflammatoire in-vivo. / Cerebral ischemia is associated with strong inflammatory and glial responses that may contribute to neuronal damage and/or provide trophic support to injured neurons. Reactive astrogliosis is one of the key components of the cellular responses to CNS injuries and the passage from the quiescent to reactive astrocytes is associated with an upregulation of the intermediate filament, glial fibrillary acidic protein (GFAP). Although upregulation of the GFAP has been widely used as an alternative marker of neuronal damage, the functional significance and the dynamics of the astrocytic response surrounding focal cerebral infarcts is still unclear. Therefore, to further clarify the role of astrocytes in cerebral ischemia we developed a model system for in vivo, non-invasive analysis of astrocytes activation in the brain.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2005-2006 / Le HAART a véritablement révolutionné le traitement anti-VIH en diminuant la morbidité et la mortalité dues au SIDA. Toutefois, les succès demeurent partiels, car avec le temps l’apparition de souches résistantes diminue l’efficacité du traitement. L’un des défis du deuxième millénaire consiste à développer de nouvelles classes d’inhibiteurs efficaces à long terme, spécifiques et non toxiques. La compréhension des événements moléculaires et cellulaires intervenant lors de l’adsorption et de l’entrée du virus dans les cellules cibles représente actuellement une des voies abondamment étudiées. Mon projet de doctorat a ciblé deux facteurs cellulaires participant au processus infectieux du VIH-1. L’objectif premier consistait à déterminer l’influence de la molécule d’adhésion ICAM 1, ancrée dans l’enveloppe du VIH-1, et de son récepteur principal, l’intégrine LFA 1, lors des événements précoces du cycle viral. Les résultats obtenus confirment l’intervention active de l’ICAM-1 et du LFA-1 lors de l’attachement et de l’entrée du VIH 1 dans les lymphocytes T CD4+, un processus lié directement à l’état d’activation de l’intégrine sur les lymphocytes T. La liaison du virus aux intégrines induit des événements de signalisation qui sont favorables à la génération du pore de fusion. Ce phénomène augmente par conséquent l’accès du virus dans le cytoplasme des lymphocytes T CD4+ par la fusion des membranes virale et cellulaire. L’interaction entre les deux molécules d’adhérences permet aux virus de s’orienter vers des cellules hautement permissives à l’infection virale, lesquelles expriment des quantités élevées de LFA-1 dans un état d’affinité intermédiaire. Ces données indiquent que le LFA-1 est un cofacteur cellulaire non négligeable dans la pathogenèse virale, particulièrement lors des événements initiaux de l’infection. / Since the first isolation of HIV in 1983, huge progress has been made in understanding the biology of the virus and the pathogenesis related to viral infection. HAART has truly revolutionized anti-HIV treatment and reduces AIDS-associated mortality and morbidity. However, the emergence of drug-resistant viruses has decreased the efficiency of HAART. Hence, development of more potent and less toxic drugs than those currently in use represents the next challenges. Recent insights into molecular events involved in viral attachment and entry processes have permitted creation of fusion inhibitors, a new class of anti-HIV drugs. Unfortunately, a number of recent studies revealed that HIV can develop resistance against these new inhibitors. Thus, the understanding of cellular factors collaborating in the early steps of HIV life cycle should be helpful in development of anti HIV drugs that might be less sensitive to viral mutations. The principal goal of this project was to investigate whether HIV-1-anchored host ICAM-1 participates in the initial steps of HIV 1 life cycle by its interaction with the integrin LFA-1 on target cells. Results confirm the determinant role of this cellular interaction during attachment and entry of viral particles into CD4+ T lymphocytes, a phenomenon linked to the activation status of LFA 1. Altogether, these data provide additional clues of the active role played by HIV-1-anchored ICAM-1 and host LFA-1 in the viral life cycle. Such information could be useful in the development of complementary drugs working in combination with fusion inhibitors.

La plasticité synaptique, qui permet l'apprentissage et la mémoire, s'exprime par des changements dans la force de transmission de signal passant par les neurotransmetteurs. La modulation de la quantité de récepteurs au glutamate de type « AMPA » disponibles dans le compartiment post-synaptique est un des moyens que possède le neurone pyramidal de modifier sa réponse à un stimulus. Les mécanismes régissant ce mécanisme de plasticité ne sont pas très bien compris, mais nous savons toutefois que l'enzyme CaMKII joue un rôle important à plusieurs niveaux dans le processus. Par exemple, la CaMKII joue un rôle dans l'immobilisation des récepteurs AMPA dans les synapses de neurones de l'hippocampe en culture, suite à un protocole (appelé « cLTP) qui mène à la Potentialisation à Long Terme de ces synapses et à l'augmentation de leur contenu en récepteurs AMPA. J'ai testé l'hypothèse que la CaMKII contribue également à augmenter le niveau d'expression membranaire des récepteurs AMPA dans les neurones. Pour ce faire, j'ai procédé à des mesures d'imagerie optique de la livraison des récepteurs AMPA à la membrane plasmique par un processus d'exocytose des réserves intracellulaires du récepteur. Cette mesure exploite la microscopie vidéo à fluorescence ainsi que le transfert de gène d'une protéine fluorescente couplée au récepteur, dont la fluorescence n'apparait que lorsque les récepteurs arrivent à la surface. En bloquant l'activité de la CaMKII avec des outils pharmacologiques ou génétiques, j'ai observé une diminution importante dans la fréquence d'exocytose des récepteurs AMPA, ce qui confirme l'hypothèse qu'elle joue un rôle important dans ce processus. Toutefois, lors d'une stimulation de type cLTP, je n'ai pas observé d'augmentation dans la fréquence d'apparition des événements d'exocytose des récepteurs. Ces résultats indiquent que malgré le rôle de la CaMKII dans l'augmentation de l'exocytose des récepteurs AMPA, ces derniers ne sont pas davantage livrés à la membrane durant un protocole de cLTP, suggérant que seule l'immobilisation des récepteurs joue un rôle prépondérant dans l'augmentation des récepteurs AMPA à la synapse durant la LTP. Il sera cependant important d'étudier davantage pourquoi la CaMKII promeut l'exocytose des récepteurs AMPA, sans que ce processus soit augmenté durant la LTP.

La maladie d'Alzheimer est une maladie dégénérative du système nerveux central. Une des caractéristiques pathologiques de la maladie est la présence de plaques amyloïdes causées par l'agrégation du peptide P-amyloïde (A|342) dans le cerveau. Ce peptide est produit à la suite de deux clivages protéolytiques de la protéine précurseur de l'amyloïde (APP), par BACE (P-APP cleaving enzyme) et par le complexe y-sécrétase. Le complexe y-sécrétase est composé de 4 sous-unités connues : Préséniline-1 (PSI) ou 2 (PS2), Anterior pharynx defective 1 (APH-1), Presenilin enhancer 2 homolog (PEN-2) et Nicastrine (NCT). L'utilisation du complexe comme cible thérapeutique de la maladie d'Alzheimer est problématique car il est important dans de nombreux processus physiologiques. De plus, les mécanismes de régulation de l'activité du complexe y-sécrétase ainsi que son affinité pour ses différents substrats sont peu connus. Le haut poids moléculaire du complexe suggère aussi la présence de protéines encore non identifiées. L'objectif de ce projet est d'identifier de nouveaux partenaires du complexe, transitoires ou permanents, ayant un rôle dans la régulation de ce dernier ou modulant son affinité pour ses substrats. Le système double hybride en levure a été utilisé pour identifier des partenaires protéiques des protéines appâts NCT, PEN-2 et APP, lors de criblages de banques d'ADNc de cerveau humain. Les protéines Ferritin L (polypeptide codant la chaîne légère de la Ferritin) et ISLR (immunoglobulin superfamily leucine rich repeat) ainsi que 4 protéines inconnues, ont été péchés avec la protéine-appât PEN-2, une sous-unité du complexe y-sécrétase. SNW1 (SNW domain containing 1) et WBP5 (WW domain binding protein 5) ont quant à eux été péchés à l'aide d'APP. Des analyses en double hybride et en co-immunoprécipitation ont montré que l'interaction entre Ferritin et PEN-2 est négative, alors que ISLR interagit avec trois des sous-unités du complexe y-sécrétase ce qui suggère sa présence probable dans le complexe. L'interaction entre APP et SNW1 suggère que APP par l'intermédiaire de sa partie C-terminale (AICD) pourrait être un facteur de transcription dont l'activité serait régulée par le corégulateur transcriptionnel SNW/SKIP. WBP5 pourrait quant à elle servir de lien entre APP et les partenaires du complexe. D'autres analyses sont nécessaires pour confirmer ces résultats préliminaires et définir le rôle des partenaires identifiés.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdorales, 2014-2015 / La maladie d’Alzheimer (MA) est la plus fréquente cause de démence mondialement et son incidence augmente en parallèle au vieillissement de la population. La pathogenèse de cette maladie neurodégénérative, actuellement sans traitement curatif, est associée à l’accumulation de bêta-amyloïde (Aβ) dans le parenchyme et la vasculature du cerveau en réponse à l’élimination déficiente de ce peptide neurotoxique. Des évidences épidémiologiques et expérimentales soulignent le rôle crucial du système immunitaire inné dans la MA. Plus précisément, plusieurs études suggèrent que les phagocytes mononucléaires (microglies, monocytes et macrophages cérébraux) constituent des cellules pivots pour combattre l’accumulation d’Aβ. Les études incluses dans cette thèse de doctorat avaient comme objectif d’accroitre les connaissances concernant le rôle des phagocytes mononucléaires dans la pathologie du modèle murin APP/PS1 de la MA. Un nombre croissant d’études indique que les Toll-like receptors (TLRs) seraient critiques pour la clairance d’Aβ par les phagocytes mononucléaires. Nous avons donc étudié le rôle de la protéine adaptatrice myeloid differentiation factor 88 (MyD88), qui permet la transduction du signal intracellulaire de la plupart des TLRs. Nous avons observé une augmentation des niveaux d’Aβ solubles et une aggravation des déficits cognitifs dans les souris APP/PS1 avec une signalisation MyD88 défectueuse, vraisemblablement suite à une réduction de la phagocytose des phagocytes mononucléaires et une coordination défaillante de la réponse immunitaire innée. La stimulation des TLRs pourrait ainsi avoir un grand potentiel thérapeutique pour la MA. Nous avons démontré que des injections systémiques répétées du ligand TLR4 monophosphoryl lipid A (MPL) dans les souris APP/PS1 ont mené à une réduction significative des niveaux d’Aβ et une amélioration des fonctions cognitives. Le MPL induit une forte réponse phagocytique des phagocytes mononucléaires tout en générant une réaction inflammatoire modérée. Finalement, en utilisant la microscopie intravitale biphotonique, nous avons dévoilé que les monocytes patrouilleurs en état basal sont attirés et rampent sur la face luminale de veines contenant de l’Aβ, capturent l’Aβ et ont la capacité de regagner à nouveau la circulation sanguine. L’ablation sélective des monocytes patrouilleurs dans les souris APP/PS1 a induit une augmentation significative des niveaux d’Aβ dans le cortex et l’hippocampe. Ensemble, ces données démontrent que les phagocytes mononucléaires sains et fonctionnels peuvent promouvoir l’élimination d’Aβ et constituent une cible thérapeutique prometteuse pour la MA. / Alzheimer’s disease (AD) is the most common cause of dementia worldwide and its incidence is rising in parallel with the aging population. The pathogenesis of this neurodegenerative disease, currently without curative treatment, is associated with the accumulation of amyloid-β (Aβ) in the brain parenchyma and cerebral vasculature in response to the impaired clearance of this neurotoxic peptide. Epidemiological and experimental evidence underline the crucial role of the innate immune system in AD. More precisely, several studies suggest that mononuclear phagocytes (microglia, monocytes and cerebral macrophages) constitute pivotal cells to fight the accumulation of Aβ. The studies enclosed in this doctoral thesis intended to better understand the role of mononuclear phagocytes on the pathology of the APP/PS1 mouse model of AD. Accumulating evidence indicates a critical role of Toll-like receptors (TLRs) in the clearance of Aβ by mononuclear phagocytes. We thus investigated the role of the myeloid differentiation factor 88 (MyD88), which is the adaptor protein for most of these innate immune receptors, transducing the intracellular signal from TLRs to the nucleus. We observed increased soluble levels of A oligomers and enhanced cognitive deficits in APP/PS1 mice with impaired MyD88 signalling, likely through reduced phagocytosis of mononuclear phagocytes and an impaired coordination of the innate immune response. Compounds that stimulate TLRs to clear Aβ may therefore have great therapeutic potential in AD patients. We demonstrated that repeated systemic injections of the TLR4 ligand monophosphoryl lipid A (MPL) in APP/PS1 mice led to a significant reduction in Aβ load and improved cognitive function. MPL induced a potent phagocytic response by mononuclear phagocytes while triggering a moderate inflammatory reaction. Finally, using live intravital two-photon microscopy, we discovered that patrolling monocytes in steady state are attracted and crawl onto the luminal walls of Aβ-positive veins, uptake Aβ and are able to circulate back into the bloodstream. Selective removal of patrolling monocytes in APP/PS1 mice induced a significant increase of Aβ load in the cortex and hippocampus. Overall, these studies demonstrate that healthy and functional mononuclear phagocytes can promote the elimination of Aβ and constitute a promising therapeutic target for AD.

La protéine E4orf4 de l'adénovirus de type 2 induit un mécanisme de mort cellulaire alternatif indépendant des caspases et qui résiste à l'oncogène Bcl-2. E4orf4 constitue donc un outil moléculaire puissant pour étudier de nouveaux effecteurs impliqués dans la mort cellulaire. À mon arrivée dans le laboratoire, il avait été démontré qu'E4orf4 usurpait l'activité des tyrosine kinases de la famille Src afin de réorganiser le cytosquelette d'actine et que ce processus était corrélé avec son activité cytotoxique. Par contre, la nature des modifications de la dynamique de l'actine ainsi que le mécanisme moléculaire impliqué étaient inconnus. L'hypothèse à la base de mes travaux est qu'E4orf4 désorganise le réseau d'actine en manipulant l'activité des Rho GTPases et que le débalancement de la dynamique de l'actine qui en résulte engage la cellule dans un programme de mort cellulaire alternatif. Mes travaux indiquent qu'E4orf4 active le sentier Src-RhoA-ROCK, ce qui stimule la contractilité cellulaire en activant la myosine II. L'activité de cette dernière est essentielle, car son inhibition bloque le programme de mort cellulaire induit par E4orf4. Par conséquent, mes travaux ont contribué à établir un lien fonctionnel entre la dynamique de l'actine et la mort cellulaire. De plus, mes résultats indiquent que la stimulation du sentier Src-RhoA -ROCK par E4orf4 contribue à activer la MAP kinase JNK qui est nécessaire pour phosphoryler la sérine 178 de paxilline. Mes résultats montrent que la phosphorylation de cette sérine de paxilline diminue sa mobilité, contribuant ainsi à stabiliser les plaques d'adhérence en aval d'E4orf4. En outre, la phosphorylation de la sérine 178 de paxilline est essentielle à l'activité cytotoxique d'E4orf4, car son iphibition interfère avec la réorganisaton du cytosquelette d'actine et la condensation nucléaire induites par E4orf4. Ainsi, mes travaux suggèrent que JNK coopère avec la myosine II pour perturber la dynamique de l'adhérence et de l'actine en aval d'E4orf4. En conséquence, je propose qu'E4orf4 induit l'axe de signalisation Src-RhoA-ROCK pour générer un stress mécanique via la coordination des dynamiques de l'adhérence et de l'actine qui culmine par la mort programmée de la cellule.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2006-2007 / L’anémie de Fanconi (FA) est une maladie génétique caractérisée par une insuffisance médullaire, un risque augmenté de cancers et plusieurs types de malformations. FANCC constitue la seule des 15 protéines FA qui se localise principalement au cytoplasme. De ce fait, en plus de son rôle dans la réparation de l’ADN, FANCC pourrait intervenir dans d’autres mécanismes régulant la croissance des cellules hématopoïétiques. Pour mieux comprendre ses fonctions, nous avons cherché de nouveaux partenaires de FANCC. Le corépresseur de la transcription CtBP1 a été retenu pour analyse. L’étude des interactions a confirmé le lien physique FANCC CtBP1 et révélé que CtBP1 est un membre du complexe FA. Afin d’éclaircir la fonction des interactions, nous avons analysé le profil d’expression génique de cellules réprimées pour les gènes FA ou CtBP1. Les résultats ont montré une expression augmentée de l’antagoniste de la voie Wnt Dickkopf 1 (DKK1). Ainsi, les essais de gènes rapporteurs ont établi que CtBP1 et FANCC agissent comme répresseur transcriptionnel du promoteur DKK1. Nous avons aussi observé que FANCD2 réprime indirectement DKK1 en favorisant l’expression de l’oncogène c Myc. Le mécanisme pourrait dépendre d’interactions entre les protéines FA, incluant FANCC, et les protéines de l’appareil transcriptionnel Wnt, CtBP1 et b caténine. Par ailleurs, nous avons montré que FANCC s’accumule au noyau en réponse à la signalisation Wnt et qu’elle participe avec d’autres protéines FA à l’activation de la b caténine. Ainsi, nous avons trouvé des niveaux élevés de DKK1 dans le surnageant des cellules appauvries en protéines FA et CtBP1, de même que dans les sérums de souris knockout FancA et FancC. Notre étude a permis de montrer que FANCC et les protéines FA, de concert avec CtBP1, agissent dans la régulation transcriptionnelle de l’antagoniste DKK1. Ces résultats suggèrent que FANCC est une protéine clé impliquée dans la signalisation Wnt. Puisque DKK1 est impliqué dans des processus connus pour être perturbés dans la FA, la régulation de DKK1 par FANCC et CtBP1 représente un mécanisme pouvant expliquer la perte progressive des cellules souches hématopoïétiques et représente une étape cruciale pour la découverte de stratégies visant à prévenir l’insuffisance médullaire chez les patients FA. / Fanconi anemia (FA) is a genetic disease characterized by bone marrow failure, excess cancer risk, as well as a broad array of malformations. FANCC is one of fifteen genes linked to the FA disease and encodes a protein that, unlike other FA proteins, is localized primarily to the cell cytoplasm. Because of this, in addition to its role in DNA crosslink repair, FANCC is proposed to function in other mechanisms that can regulate hematopoietic progenitor cell fate. To better understand its functions, we investigated for new partners of the FANCC protein. One candidate, the transcriptional corepressor CtBP1, was selected for further analyses. Interatomic studies confirmed the physical link between FANCC and CtBP1 and revealed that CtBP1 is a member of the FA core complex. To investigate biological function of these interactions, we used a microarray strategy and found that the Wnt antagonist Dickkopf 1 (DKK1) is upregulated in FA and CtBP1 depleted cells. Accordingly, CtBP1 and FANCC were found to act as transcriptional repressor on DKK1 promoter in reporter gene assays. We also observed that FANCD2 indirectly represses DKK1 in promoting the expression of c Myc. Functional mechanism of these repressions may be explained on the observation that FANCC and FA core complex proteins interact with the Wnt transcriptional machinery proteins including CtBP1 and b catenin. Furthermore, we showed that FANCC accumulates into the nucleus in response to Wnt signalisation and participates with other FA proteins in b catenin activation. Therefore, we found increased levels of DKK1 in FA and CtBP1 depleted cells supernatant as well as in sera from FancA and FancC knockout mice. Functional interaction studies showed that FANCC and FA proteins with CtBP1 act in transcriptional regulation of the Wnt antagonist DKK1. These findings suggest that FANCC is a key protein involved in the Wnt signalling response. Because DKK1 is implicated in biological processes similar to those involved in FA pathogenesis, linking FANCC with CtBP1 to the regulation of DKK1 suggests a possible mechanism explaining the progressive loss of bone marrow cells and represents a crucial step for the development of novel strategies aimed at preventing bone marrow failure in FA patients.

L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie rare caractérisée par une obstruction progressive et un remodelage vasculaire des artères pulmonaires distales, conduisant à une pression artérielle pulmonaire moyenne supérieure à 20mmHg. L'augmentation de la pression aboutit à une dysfonction du ventricule droit et la mort. À l'heure actuelle, il n'existe pas de traitement curatif pour l'HTAP. Il est donc primordial d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Comme dans le cancer, les cellules musculaires lisses de l'artère pulmonaire des patients atteints d'HTAP présentent un phénotype hyper-prolifératif et résistant à l'apoptose, entraînant un remodelage vasculaire pulmonaire. Ainsi, plusieurs stratégies thérapeutiques anti cancéreuses pourraient être utiles pour le traitement de l'HTAP. Compte tenu de l'expression altérée des récepteurs tyrosines kinases dans l'HTAP ainsi que dans le cancer, les inhibiteurs de tyrosine-kinases (ITK) ont été mise sur le marché pour le traitement de différents types de cancers et ont été envisagées dans le cadre de l'HTAP. Ainsi, l'ITK, Imatinib, a été capable de régresser l'HTAP induite dans des modèles expérimentaux, tandis que l'administration d'un autre inhibiteur, le Dasatinib, était associée au développement de l'HTAP. Récemment, plusieurs études observationnelles ont démontré le développement de l'HTAP chez des patients atteints d'un cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) présentant des réarrangements de la kinase lymphocytaire anaplasique (ALK) et qui ont reçu des ITK ALK/cMET, notamment Xalkori (R-Crizotinib), Ceritinib, Brigatinib et Lorlatinib. Étant donné que l'hypertension pulmonaire peut être associée à plusieurs maladies, y compris le cancer du poumon, la question demeure de savoir si le développement de l'HTAP chez les patients atteints d'un cancer du poumon recevant l'ITK ALK/c-MET représente un événement indésirable du médicament ou un résultat de la propagation de la maladie. Ainsi, l'objectif principal de chapitre 1 est de déterminer si le R-Crizotinib (connu sous le nom de Xalkori et qui est une première ligne de traitement des patients ayant un CPNPC-ALK positif) exacerbe l'HTAP et/ou prédispose à l'HTAP dans des modèles animaux. In vivo, le traitement par R-Crizotinib a entraîné une élévation marquée de la pression systolique du ventricule droit et de la pression artérielle pulmonaire moyenne associée à une augmentation de l'épaisseur de la paroi médiale des artères pulmonaires distales. De plus, R-Crizotinib, administré avant l'exposition à une faible dose de monocrotaline (MCT), induit une réponse hypertensive pulmonaire exagérée, comme en témoigne une augmentation de la pression systolique du ventricule droit et de la pression artérielle pulmonaire moyenne, de l'épaisseur de la paroi médiale et une diminution du débit cardiaque. In vitro, nous avons démontré que le traitement avec R-Crizotinib réduit la prolifération des cellules endothéliales contrôles de l'artère pulmonaire, effet associé à la formation de cellules multinucléées, ce qui est généralement observée dans les cellules qui meurent d'une une catastrophe mitotique. En conclusion, nous avons démontré que l'agent anticancéreux R-Crizotinib favorise le dysfonctionnement des cellules endothéliales, conduisant à la prédisposition et à l'exacerbation de l'HTAP dans des modèles animaux. Les dernières années de recherche ont approuvé l'importance des marques épigénétiques dans le développement de l'HTAP. En effet, nous nous sommes intéressés, dans le deuxième volet de la thèse, au facteur épigénétique « G9a », qui s'est révélé surexprimé dans différents types de cancers, favorisant la survie et la prolifération des cellules. Compte tenu de l'analogie cancer/HTAP, G9a fut un candidat idéal pour l'étude de son potentiel rôle dans le développement de l'HTAP. Ainsi, l'objectif principal du chapitre 2 est de déterminer si G9a est impliqué dans la progression et la pathogenèse de l'HTAP et de déterminer si son inhibition est bénéfique dans les modèles animaux. Nous avons démontré que G9a est surexprimé dans les artères pulmonaires de patients HTAP et dans les modèles expérimentaux. In vitro, l'inhibition pharmacologique de G9a à l'aide de BIX01294 diminue drastiquement la capacité d'hyper prolifération et la résistance à l'apoptose des cellules musculaires lisses HTAP. Grâce au séquençage d'ARN, nous avons démontré que l'inhibition de G9a s'accompagnait d'une altération du flux d'autophagie et d'une accumulation de lipides. Enfin, le traitement thérapeutique avec BIX01294 a réduit le remodelage vasculaire pulmonaire et la pression artérielle pulmonaire moyenne dans un modèle expérimentale de rat et a également amélioré l'hémodynamique pulmonaire et la fonction ventriculaire droite dans un autre modèle de souris. Ces résultats suggèrent que l'inhibition de G9a pourrait représenter une nouvelle approche thérapeutique dans l'HTAP. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare and fatal disease characterized by "a progressive loss and obstructive remodeling of pulmonary arteries (PAs) leading to a mean pulmonary arterial pressure (mPAP) greater than 20mmHg. The persistent elevation of pulmonary pressures leads to right ventricular dysfunction and death. Currently, there is no cure for patients with PAH, which increases the need to develop new and effective therapeutic strategies. Pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) from PAH patients exhibit a "cancer-like" hyperproliferative and apoptosis-resistant phenotype leading to pulmonary vascular remodeling. Therefore, several anti-cancer therapies could be useful for the treatment of PAH. Given the altered expression of receptor tyrosine kinases and their ligands in PAH as well as in cancer, tyrosine kinase inhibitors (TKIs) have been marketed for the treatment of different types of cancers and have been in the spotlight for anti-PAH drug research. Indeed, the tyrosine kinase inhibitor, Imatinib, was able to regress established PAH in experimental models, while the administration of another inhibitor, Dasatinib, was associated with the development of PAH. Recently, several observational studies have highlighted the development of PAH in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) with anaplastic lymphocyte kinase (ALK) rearrangements who received ALK/cMET TKIs, including Xalkori (R-crizotinib), Ceritinib, Brigatinib, and Lorlatinib. Since pulmonary hypertension can be associated with several diseases, including lung cancer, the question remains whether the development of PAH in lung cancer patients receiving cMET/ALK TKIs represents an adverse drug event or a result of disease spread. Thus, the main objective of Chapter 1 is to determine whether R-Crizotinib (known as Xalkori and which is the first-line treatment for patients with advanced ALK-positive NSCLC) exacerbates PAH and/or predisposes to PAH in experimental animal models. In vivo, R-Crizotinib treatment resulted in a marked elevation of the right ventricular systolic pressure (RVSP) and mPAP which was associated with an increased medial wall thickness of the distal PAs. Additionally, we found that pretreatment of rats with R-Crizotinib, induced an exaggerated pulmonary hypertensive response, as evidenced by the increased RVSP, mPAP, medial wall thickness, and decreased cardiac output. In vitro, we have demonstrated that treatment with R-Crizotinib reduces the proliferation of control pulmonary artery endothelial cells, which was accompanied by the appearance of multinucleated cells, a feature commonly seen in cells dying from mitotic catastrophe. In conclusion, we have demonstrated for the first time that the anticancer agent R-Crizotinib promotes endothelial cell dysfunction, leading to susceptibility and exacerbation of PAH in animal models. Previous studies have demonstrated the importance of epigenetic marks in the development and progression of PAH. Indeed, we were interested in the second part of the thesis, in the epigenetic factor "G9a", which was found to be overexpressed in different types of cancers, promoting cell survival and proliferation. Given the similarities between PAH and cancer, G9a was the ideal candidate to study in PAH. Thus, the main objective of Chapter 2 is to determine if G9a is involved in the progression and pathogenesis of PAH and to determine if its inhibition is beneficial in PAH animal models. We demonstrated that G9a is overexpressed in PAs of PAH patients and in experimental models. In vitro, we found that pharmacological inhibition of G9a using BIX01294 drastically reduces the PAH-PASMC proliferation and survival. Through RNA sequencing analysis, we demonstrated that G9a inhibition is accompanied by an impaired autophagy flux and lipid accumulation. Finally, therapeutic treatment with BIX01294 reduced pulmonary vascular remodeling as well as mPAP in an experimental rat model and also improved pulmonary hemodynamics and right ventricular function in another PAH mouse model. These results suggest that G9a inhibition could represent a new therapeutic approach in PAH.