La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie génétique qui résulte de diverses mutations dans le gène DMD, codant pour la protéine dystrophine. 70% des patients ont une délétion d'exons ou de parties d'exons provoquant un changement dans le cadre de lecture, résultant en l'apparition d'un codon stop et en l'absence de la protéine dystrophine. Plusieurs traitements potentiels ont été explorés dans les dernières années pour cette maladie, dont le système CRISPR-Cas9, un outil génétique permettant d'éliminer un segment d'ADN à l'aide de la protéine nucléase Cas9 et de deux guides d'ARN ciblant des séquences précises d'ADN. Le plus grand défi avec l'utilisation de cette technologie est sa livraison in vivo. Les vésicules extracellulaires sont des particules membranaires lipidiques qui jouent un rôle dans la communication intercellulaire et sont retrouvées dans tous les biofluides chez les mammifères. Elles pourraient donc être une alternative intéressante pour la livraison du système CRISPR-Cas9. J'ai participé à des travaux de purification de vésicules extracellulaires de sérum par chromatographie par exclusion de taille. Ces vésicules extracellulaires ont été chargées avec la protéine Cas9 et des guides ARN, puis, des injections intramusculaires ont été effectuées dans le Tibialis anterior de trois lignées de souris (Ai9, RAG-mdx et mdx/hDMD) pour établir l'efficacité du traitement. Les résultats ont montré que les vésicules extracellulaires chargées avec la Cas9 et des guides d'ARN provoquent une édition de l'ADN efficace dans le Tibialis anterior des trois lignées de souris utilisées et la restauration de l'expression de la protéine dystrophine dans les fibres musculaires du Tibialis anterior des souris RAG-mdx, modèle pour la dystrophie musculaire de Duchenne. Le traitement a ensuite été modifié pour permettre le ciblage des vésicules extracellulaires aux organes affectés par la dystrophie musculaire de Duchenne, soit le cœur et les muscles squelettiques. Des peptides de ciblage ont été sélectionnés dans la littérature et insérés dans la membrane des vésicules extracellulaires marquées de façon fluorescente à l'aide d'un segment lipidique stéaryl. Les résultats de l'expérience effectuée avec les vésicules extracellulaires ciblées n'ont pas été concluants en raison d'un marquage mal adapté des vésicules injectées, mais de futures expériences permettront d'élucider leur efficacité. L'ajustement du traitement pour permettre une injection systémique rejoignant le cœur et les muscles squelettiques est indispensable à l'application de celui-ci à la clinique. / Duchenne muscular dystrophy is a genetic disease that affects one in 3500 boys and results from mutations in the DMD gene, which codes for dystrophin protein. 70% of patients have an exon deletion, which results in a shift in the reading frame, the apparition of a stop codon, and the absence of the dystrophin protein. Many different potential treatments have been explored for Duchenne muscular dystrophy, including the CRISPRCas9 system. This technology allows for the modification of genomic DNA through a Cas9 nuclease and two guide RNAs designed to target a specific DNA sequence. The biggest challenge with using the CRISPR system is delivery. The classic vectors for CRISPR, such as AAV, can cause many adverse effects like immunological responses. Extracellular vesicles are membranous particles that play a role in intercellular communication and are found in all mammalian biofluids. They are thus an interesting alternative for the delivery of the Cas9 protein and its guide RNAs. I have participated in a research project aiming to purify serum extracellular vesicles by size-exclusion chromatography and to load them with Cas9 and two guide RNAs. These extracellular vesicles were then injected intramuscularly into the Tibialis anterior muscles of three mouse strains (Ai9, RAG-mdx and mdx/hDMD) to assess treatment efficiency. The injection of Cas9 and guide RNA-loaded extracellular vesicles produced efficient gene editing as well as dystrophin expression restauration. To modify the treatment for systemic injection, targeting peptides were added to EV membrane through a lipid stearyl segment. This was done to target the extracellular vesicles to Duchenne muscular dystrophy-affected organs: heart and skeletal muscles. Results of the targeted-extracellular vesicle experiment were inconclusive, however, with more experiments, the efficacy of the targeting peptides should be determinable. It is essential to adjust this treatment to allow for targeted systemic delivery for it to be applicable to the clinic.

À ce jour, malgré les traitements antirétroviraux efficaces permettant de contrôler la charge virale chez les personnes vivant avec le VIH-1, aucun vaccin ni traitement curatif n'est disponible. La recherche fondamentale est donc toujours de mise afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires permettant la persistance du virus. Les macrophages, l'une des cellules cibles du VIH-1, jouent un rôle important dans l'établissement de l'infection et la propagation du virus. Étant présentes dans les muqueuses, ces cellules sont parmi les premières à être exposées au VIH-1 lors de l'infection. En combinaison avec leur longue durée de vie et leur résistance à l'effet cytopathique du virus, les macrophages doivent être pris en considération dans le développement d'une stratégie de guérison. De plus, ces cellules font partie des réservoirs viraux, c'est-à-dire des cellules qui persistent chez la personne infectée malgré les thérapies antirétrovirales, et participent au rebond de la charge virale lors de l'arrêt des traitements. Les macrophages sont caractérisés par un faible taux d'infection in vitro. Afin d'identifier les facteurs de l'hôte associés à une susceptibilité ou une résistance à l'infection, nous avons fait une étude comparant le transcriptome de cellules infectées par le VIH-1 avec la population exposée ayant résisté à l'infection (population spectatrice), suivie d'un criblage d'ARN interférents envers une sélection de gènes modulés par le virus. Cette étude a permis de mettre en évidence plusieurs facteurs de régulation du VIH-1, dont la protéine MDM2. MDM2 est une ubiquitine ligase impliquée dans la réponse aux dommages à l'ADN et régulant le niveau de plusieurs protéines, sa cible principale étant le facteur de transcription p53. Les deux études présentées dans cette thèse de doctorat cherchent à mieux comprendre le rôle des protéines MDM2 et p53 dans l'infection des macrophages humains par le VIH-1. Nous démontrons d'abord que l'ubiquitine ligase MDM2 favorise l'infection productive des macrophages via le contrôle de p53. En effet, la stabilisation du facteur de transcription p53 induit l'expression de la protéine p21, qui à son tour empêche la phosphorylation de la protéine SAMHD1. SAMHD1 est un facteur de restriction efficace chez le macrophage, interférant avec l'étape de transcription inverse du virus, et est inactivé suivant sa phosphorylation. Un niveau plus élevé de p53 dans la cellule entraîne donc en une plus forte restriction de l'infection par le VIH-1. Cette première étude a mis en lumière un rôle antiviral de p53 et l'importance de son contrôle par MDM2 pour le VIH-1. Notre seconde étude découle directement des résultats obtenus lors de la première. Le gène TP53 exprime plusieurs isoformes de p53, chacune connue pour moduler l'activité de p53 pleine longueur. Nous démontrons que ces isoformes peuvent aussi moduler le cycle viral de manière distincte. Par exemple, l'interférence par ARN de l'isoforme p53β cause un effet similaire à l'ARN interférent ciblant toutes les isoformes, mais cette hausse de l'infection est seulement observée au niveau de la production de virions et n'affecte pas le taux d'infection. Cet effet serait aussi indépendant de l'action de SAMHD1. L'inhibition de l'expression des isoformes Δ133p53, quant à elle, diminue la susceptibilité des macrophages au VIH-1 et dépend du sentier p53/SAMHD1. Dans cette étude, nous montrons aussi que la protéine virale Nef protège le virus de l'action de p53. Enfin, nous avons observé une modulation de l'expression des isoformes de p53 suivant l'infection par le VIH-1, certaines isoformes étant modulées spécifiquement chez les macrophages productivement infectés. Ensemble, ces études mettent en lumière un rôle dans l'immunité innée antivirale pour le facteur de transcription p53, plutôt connu pour ses propriétés antitumorales. La mise en évidence d'un nouveau facteur de régulation du VIH-1 spécifique au macrophage et impliqué dans les étapes menant à l'intégration du VIH-1 dans ces cellules permet une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires menant à la formation et à la persistance de réservoirs viraux. Ces études permettront d'envisager de nouvelles voies thérapeutiques pour prévenir leur formation et mener à l'éradication du virus. Nos résultats permettent aussi de mieux comprendre l'implication de p53 dans l'immunité ainsi que l'importance de son contrôle par MDM2 et pourront aussi être transposées dans d'autres sphères de la virologie. Inversement, les connaissances actuelles en oncologie sur le facteur de transcription p53 pourront être transposées pour développer de nouvelles thérapies et, éventuellement, une guérison de l'infection par le VIH-1. / To date, despite effective antiretroviral therapies for viral load control in people living with HIV-1, no vaccine or cure against the virus is available. Basic science research is then still necessary to better understand the molecular mechanisms allowing the viral persistence. Macrophages, one of the cells targeted by HIV-1, play an important role in the establishment and propagation of HIV-1 infection. Being present in the mucous membranes, macrophages are among the first cells exposed to the virus upon infection. In combination with their long lifespan and their resistance to HIV-1-mediated cytopathogenic effects, macrophages must be considered for the development of a functional cure. In addition, these cells are part of the viral reservoirs, which are cells that persist in the infected person despite antiretroviral therapy and are responsible for the return of the viremia when treatments are stopped. Macrophages are characterized by their low infection rate in vitro. To identify host factors associated with the susceptibility or resistance to infection, we did a transcriptomic study comparing the infected cells with the bystander population (i.e., cells exposed to HIV-1 but uninfected), followed by a siRNAs screening of genes modulated by HIV-1 infection. This study revealed several positive and negative HIV-1 regulatory factors. One of these regulators was MDM2. MDM2 is a ubiquitin ligase involved in the DNA damage response and regulating the turnover of various proteins, including p53. The main goal of the two studies presented in this Ph.D. thesis is to better understand the role of MDM2 and p53 in the infection of macrophages by HIV-1. We demonstrate that the MDM2 ubiquitin ligase favors HIV-1 replication through the control of p53. Indeed, p53 stabilization induces the expression of p21, which in turn inhibits the phosphorylation of SAMHD1. SAMHD1 is an important restriction factor in macrophages, interfering with HIV-1 reverse transcription, and is inactivated by phosphorylation. A higher level of p53 thus results in a stronger restriction against HIV-1 mediated by SAMHD1. This first study highlights an antiviral role of p53 and the importance of its control by MDM2 for HIV-1infection. Our second study stems from the results obtained in our first one. The TP53 gene expresses multiple isoforms of p53, each known to modulate the full-length p53 activity. We demonstrate that these isoforms can also modulate the HIV-1 replication cycle in a distinct manner. For example, RNA interference of the p53β isoform cause a similar effect than the siRNA targeting all the isoforms, but the increase is only seen on the viral production and not on the infection rate. This effect also seems to be SAMHD1-independent. Knockdown of Δ133p53 isoforms, on the other hand, decreases the susceptibility of macrophages towards HIV-1 in a p53/SAMHD1-dependant manner. In this study, we also show that the viral protein Nef protects the virus from the antiviral activity of p53. Finally, we observe a change in the p53 isoforms expression pattern upon exposure to HIV-1, certain isoforms being modulated specifically in the productively infected macrophages. Together, these studies highlight an antiviral role for the transcription factor p53, better known for its antitumor functions. The demonstration of a new regulatory factor of HIV-1infection specific to the macrophages and involved in the replication steps leading to the viral genome integration allows a better understanding of the molecular mechanisms leading to the formation and persistence of HIV-1 reservoirs. These studies will open the way to new therapeutic routes to prevent their formation and lead to the eradication of the virus. Our results also provide a better understanding of the involvement of p53 in immunity and the importance of its control by MDM2 and may also be transposed into other areas of virology. Conversely, current knowledge in oncology on the p53 transcription factor could be used in the development of new therapies and, possibly, a cure against HIV-1.

Le microbiote intestinal joue un rôle important dans la santé de son hôte. Les bactéries qui le composent vont agir à différents niveaux, comme celui de la digestion, du métabolisme, de l'immunité ou du cerveau. Ces bactéries vont former un réseau équilibré qui est nécessaire pour le maintien de notre santé. Cependant, des facteurs externes tels que la diète, la prise de médicaments, l'environnement et le stress peuvent grandement influencer cet équilibre et altérer la composition du microbiote intestinal. De plus, ces perturbations peuvent engendrer un stress oxydatif et provoquer encore plus de dommages, notamment à notre cerveau. Afin d'étudier ces variations, deux outils génétiques ont été développés pour le modèle du poisson-zèbre. Le premier outil consiste en un système CRISPR-dCas9 photoactivable à la lumière bleue ayant pour but de contrôler les populations microbiennes de l'intestin d'une larve (transparente) de poisson-zèbre à l'aide de la lumière. La preuve de concept a été réalisée avec Escherichia coli. Le deuxième outil consiste en un senseur de peroxyde d'hydrogène ciblé aux mitochondries des cellules épithéliales de l'intestin. Cet outil vise à mesurer les niveaux de peroxyde d'hydrogène, un dérivé réactif de l'oxygène menant à la production de stress oxydatif. Ultérieurement, cet outil sera exploité afin de générer une lignée transgénique de poisson-zèbre exprimant ce senseur. Il sera également possible d'utiliser en parallèle le système CRISPR-dCas9 photoactivable afin de faire des liens entre les perturbations du microbiote intestinal et le stress oxydatif produit par le peroxyde d'hydrogène dans l'intestin de la larve de poisson-zèbre. Finalement, des liens entre ces effets et le développement du cerveau pourront être établis. / The intestinal microbiota plays an important role in the health of its host. The bacteria that compose it will act at different levels, such as digestion, metabolism, immunity, or the brain. These bacteria will form a balanced network that is key for the maintenance of our health. However, external factors such as diet, drugs, environment, and stress can greatly influence this balance and alter the composition of the intestinal microbiota. Moreover, these disturbances can lead to oxidative stress and cause further damage, especially to our brain. To study these variations, two genetic tools were developed to use in the zebrafish larva model. The first tool is a blue-light photoactivatable CRISPR-dCas9 system to control the gut microbiota using light. The proof of concept has been realized with Escherichia coli. The second tool consists of a hydrogen peroxide sensor targeted to the mitochondria of intestinal epithelial cells. This tool aims to measure the levels of hydrogen peroxide, a reactive oxygen derivative leading to the production of oxidative stress. Later, this tool will be used to generate a transgenic line of zebrafish expressing this sensor. It will also be possible to use in parallel the photoactivatable CRISPR-dCas9 system to make links between the disturbances of the intestinal microbiota and the oxidative stress produced by hydrogen peroxide in the larval zebrafish gut. Finally, links between these effects and the brain development will be further studied.

L'origine et la fonction des cellules immunitaires du système nerveux central (SNC), connues sous le nom de microglies, sont controversées. Les objectifs de cette thèse étaient de déterminer si les cellules souches de la moelle osseuse peuvent infiltrer le SNC et se différencier en cellules microgliales, et d'élaborer plus précisément si les microglies sont bénéfiques ou dommageables aux neurones lors des maladies neurodégénératives. Premièrement, nous établissons que les cellules de la moelle osseuse peuvent en effet infiltrer différentes régions du SNC, et qu'elles se différencient en microglies périvasculaires et parenchymateuses. De plus, les microglies originaires de la moelle osseuse expriment fortement la protéine CD1 le, suggérant qu'elles sont de meilleures cellules présentatrices d'antigène que les microglies parenchymateuses déjà présentes dans le SNC. Il est alors possible que les microglies infiltrantes jouent un rôle important dans le maintien du bon fonctionnement du SNC, surtout durant les infections cérébrales et les maladies neurodégénératives. Nous démontrons ensuite que la réponse immunitaire microgliale protège les neurones contre l'excitotoxicité aiguë par un mécanisme qui dépend de la voie de signalisation MyD88/NF-icB. De plus, les cellules de la moelle osseuse sont fortement attirées vers les régions affectées par la mort neuronale, mais que ces cellules ne sont pas critiques à la protection neuronale dans les stages initiaux de l'excitotoxicité. Au contraire, dans ce model neurodégénératif aiguë, ce sont les microglies résidentes du cerveau qui sont bénéfiques. Nous avons ensuite étudié le rôle des microglies infiltrantes dans un modèle animal de la maladie neurodégénérative chronique d'Alzheimer. Ces cellules microgliales sont attirées en grand nombre par la P-amyloïde, se dirigent vers les plaques séniles et les infiltrent. Nous confirmons aussi qu'une réponse immunitaire spécifique est engendrée par la Pamyloïde. Finalement, nous démontrons que les microglies provenant de la moelle osseuse restreignent la formation des plaques séniles en phagocytant la p-amyloïde. En conclusion, les résultats de cette thèse démontrent qu'il y a en effet deux populations de microglies et que le rôle de ces cellules varie en fonction du processus neurodégénératif aigu ou chronique. Il serait possible d'utiliser les cellules souches hématopoiétiques comme véhicule thérapeutique, surtout pour contrôler la cascade amyloïde et le déficit cognitif.

Le syndrome métabolique est un regroupement de facteurs de nsque de maladie cardiovasculaire (MCV) étroitement liés à l'obésité. L 'hypertriglycéridémie, la présence en circulation de lipoprotéines de faible densité (LDL) de diamètre réduit et une condition proinflammatoire représentent trois de ces facteurs. L' apoliprotéine (apo) C-III, présente sous 3 isoformes en circulation, inhibe la lipase lipoprotéique. et serait impliquée dans le développement de l 'hypertriglycéridémie. Les LDL petites et denses seraient métabolisées moins rapidement et seraient ' ainsi plus susceptibles de participer au processus athérosclérotique. Les concentrations plasmatiques élevées de protéine C-réactive (CRP) sont utilisées en clinique dans l'évaluation de la condition inflammatoire et dans l'estimation du profil de risque de MCV. La compréhension du métabolisme intravasculair-e de l'apoC-III, des différentes classes de LDL et de la CRP en rapport avec le syndrome métabolique est incomplète. Utilisant des techniques de traçage in vivo, les mécanismes physiologiques (taux de production et de catabolisme) responsables des variations de concentrations plasmatiques des différents isoformes de l'apoC-III, de la CRP et des LDL petites et denses furent étudiés. Les études sur le métabolisme intravasculaire de l' apoC-III ont démontré que le taux de production de l'ensemble des isoformes de l' apoC-III était positivement associé aux concentrations plasmatiques de triglycérides et que le taux de production de l'isoforme doublement sialylée était fortement associé à la proportion de petites LDL en circulation. L'étude de la cinétique intravasculaire de différentes sousclasses de LDL a révélé que les LDL de moindres densités, malgré ' leur métabolisme intravasculaire rapide, sont les principaux précurseurs des LDL de plus hautes densités. Finalement, l'étude de la CRP révéla que les concentrations plasmatiques de ce marqueur inflammatoire sont déterminées principalement par son taux de production, et que ce dernier serait positivement associé au tour de taille et aux concentrations plasmatiques d'apoB-lOOet de triglycérides, et négativement associé aux concentrations plasmatiques de lipoprotéines de haute densité et d'adiponectine. Dans l'ensemble, ces études in vivo auront permis de mieux situer le rôle métabolique des isoformes de l'apoC-III, des LDL et de la CRP dans le développement du syndrome métabolique et appellent à la réalisation d'études dans divers contextes métaboliques afin de valider les conclusions ici présentées.

Les canaux potassiques sensibles à l'ATP (KATP) jouent un rôle primordial dans plusieurs processus cellulaires. La modulation de ces canaux par des molécules activatrices constituerait des applications pharmacologiques et médicinales très intéressantes. À cet effet nous avons conçu et synthétisé de nouvelles molécules hybrides cromakalim-diazoxide et diazoxide-amine/aminoacide. Nous avons également, évalué l'activité myorelaxante de ces composés sur l'aorte de rates. Les résultats obtenus ne montrent pas un effet myorelaxant significatif. Des études sur d'autres tissus, notamment les cellules β pancréatiques et le muscle utérin, sont envisagées afin d'explorer une éventuelle sélectivité tissulaire. Par ailleurs, les interactions protéine-protéine jouent un rôle fondamental dans presque tous les processus cellulaires. Elles sont fortement impliquées dans la formation de la structure dimérique de la protéase du VIH-1 et l'agrégation du peptide β amyloïde impliquée dans la maladie d'Alzheimer. L'inhibition de ces interactions serait donc d'un avantage thérapeutique pour le traitement du SIDA et de la maladie d'Alzheimer. Nous avons conçu et synthétisé d'une part, des pinces moléculaires à base de motifs carbonylhydrazides et oligohydrazides (Azatide), et d'autre part, des molécules pentapeptidiques avec un peudoaminoacide central alcoolfluoré. Enfin, nous avons testé la capacité des pinces moléculaires à perturber le feuillet β terminal de la PR du VIH-1 afin d'inhiber sa dimérisation et donc son activité. Nous avons réalisé de même une étude de relation structure-activité et d'après l'ensemble des résultats obtenus, il semblerait que la flexibilité est délétère pour l'activité inhibitrice. Nous avons également évalué la capacité des nouvelles molécules peptidomimétiques alcool fluorées à accélérer ou inhiber l'agrégation du peptide Aβ1-42 dans le but de diminuer la présence de petits oligomères neurotoxiques. Les résultats obtenus sont très prometteurs, nous avons réussi à développer d'une part un pentapeptide capable d'inhiber totalement l'agrégation de Aβ1-42, et d'autre part des pseudopentapeptides capables d'accélérer son agrégation. Nous avons aussi démontré l'influence de l'atome de fluor sur la structuration d'un pentapeptide. Des études par RMN et DC sont en cours.

La réparation de l’ADN par excision des nucléotides (NER) est un mécanisme capable de retirer une large variété de lésions causant une distorsion de la double hélice, comme celles causées par les rayons ultraviolets (UV). Comme toutes les voies de réparation de l’ADN, la NER contribue à la prévention de la carcinogénèse en prévenant la mutation de l’ADN. Lors de ce processus, il y a d’abord reconnaissance de la lésion par la protéine XPC/Rad4 (humain/levure) qui recrute ensuite TFIIH. Ce complexe déroule l’ADN par son activité hélicase et recrute l’endonucléase XPG/Rad2 ainsi que d’autres protéines nécessaires à l’excision de l’ADN. Lors de son arrivée au site de lésion, XPG/Rad2 déplace XPC/Rad4. TFIIH agit également lors de la transcription de l’ADN, entre autres par son activité hélicase. Outre cette similarité de la présence de TFIIH lors de la transcription et la réparation, il est possible de se demander en quoi les deux voies sont similaires. Nous nous sommes donc intéressés aux interactions impliquant TFIIH et la machinerie de réparation de l’ADN. Nous avons donc entrepris une caractérisation structurale et fonctionnelle de ces interactions. Nous avons découvert que Rad2 et Rad4 possèdent un motif d’interaction en nous basant sur d’autres interactions de la sous-unité Tfb1 de TFIIH. Par calorimétrie à titrage isotherme, nous avons observé que les segments de ces deux protéines contenant ce motif interagissent avec une grande affinité au domaine PH de Tfb1. Le site de liaison de ces segments sur Tfb1PH est très semblable au site de liaison du domaine de transactivation de p53 et au domaine carboxy-terminal de TFIIEα avec Tfb1PH, tel que démontré par résonance magnétique nucléaire (RMN). De plus, tous ces segments peuvent faire compétition les uns aux autres pour la liaison à Tfb1PH. Nous avons aussi démontré in vivo chez la levure qu’une délétion de Tfb1PH crée une sensibilité aux radiations UV. De plus, la délétion de multiples segments de Rad2 et Rad4, dont les segments d’interaction à Tfb1PH, est nécessaire pour voir une sensibilité aux rayons UV. Ainsi, de multiples interactions sont impliquées dans la liaison de Rad2 et Rad4 à TFIIH. Finalement, les structures des complexes Rad2-Tfb1PH et Rad4-Tfb1PH ont été résolues par RMN. Ces structures sont identiques entre elles et impliquent des résidus hydrophobes interagissant avec des cavités peu profondes de Tfb1PH. Ces structures sont très semblables à la structure de TFIIEα-p62PH. Ces découvertes fournissent ainsi un lien important entre la transcription et la réparation de l’ADN. De plus, elles permettent d’émettre un modèle du mécanisme de déplacement de XPC/Rad4 par XPG/Rad2 au site de dommage à l’ADN. Ces connaissances aident à mieux comprendre les mécanismes de maintient de la stabilité génomique et peuvent ainsi mener à développer de nouvelles thérapies contre le cancer. / The nucleotide excision repair pathway (NER) is a mechanism capable of removing a wide variety of helix-distorting lesions, such as those caused by ultraviolet irradiation (UV). As all DNA repair pathways, NER contributes to the prevention of carcinogenesis by preventing DNA mutation. During this process, the lesion is first recognized by the protein XPC/Rad4 (human/yeast), which then recruits TFIIH. This complex unwinds the DNA with its helicase activity and then recruits the endonuclease XPG/Rad2 and other proteins necessary for DNA excision. Upon arrival at the lesion site, XPG/Rad2 displaces XPC/Rad4. TFIIH also acts in DNA transcription, using its helicase activity. In addition to the similarity of the presence of TFIIH in transcription and DNA repair, it is possible to ask ourselves how the two pathways are similar. We were interested in the interactions involving TFIIH and the DNA repair machinery. We have therefore undertaken a structural and functional characterization of these interactions. We have found that Rad2 and Rad4 have a motif of interaction based on other interactions of the Tfb1 subunit of TFIIH. Using isothermal titration calorimetry, we found that segments of these two proteins containing this motif interact with high affinity to the PH domain of Tfb1. The binding site of these segments is very similar to Tfb1PH binding site of transactivation domain of p53 and the carboxyl-terminal domain of TFIIEα with Tfb1PH, as demonstrated by nuclear magnetic resonance (NMR). In addition, these segments can compete with each other for binding to Tfb1PH. We also demonstrated in vivo that deletion of Tfb1PH in yeast creates a sensitivity to UV irradiation. In addition, the deletion of multiple segments of Rad2 and Rad4, including segments of interaction Tfb1PH, is required to observe a sensitivity to UV. Thus, multiple interactions are involved in the binding of TFIIH to Rad2 and Rad4. Finally, the structures of the Rad2-Tfb1PH and Rad4-Tfb1PH complexes were solved by NMR. These structures are identical to each other and involve hydrophobic residues interacting with shallow grooves on Tfb1PH. These structures are very similar to the structure of TFIIEα-p62PH. These findings provide an important mechanistic link between transcription and DNA repair. In addition, they provide a model of the mechanism of the displacement of XPC/Rad4 by XPG/Rad2 at the damaged site. This knowledge helps to better understand the mechanisms of genomic stability and can lead to novel cancer therapies.

Les interactions protéine-protéine jouent un rôle primordial dans de nombreux processus biologiques. L’importance de ces interactions a suscité le développement de nouvelles approches thérapeutiques qui ciblent ces complexes protéiques. Nous nous proposons d’inhiber ces interactions en élaborant une stratégie de reconnaissance de surfaces de protéines par des molécules synthétiques de taille intermédiaire, les foldamères d’oligoquinoline. Ces composés se replient en des structures hélicoïdales stables dont chaque élément constitutif peut être fonctionnalisé pour permettre des propriétés de reconnaissance de surface de protéine.Afin de valider ce concept, l’interaction entre l’anhydrase carbonique humaine de type II (HCAII) et son inhibiteur N-benzyl-4-sulphamoylbenzamide (SBB) a été sélectionnée comme système modèle. Plusieurs étapes de synthèse ont permis de concevoir de nouveaux foldamères capables de former un complexe avec l’enzyme par l’intermédiaire de l’inhibiteur SBB et d’un espaceur approprié. Chaque complexe protéine-foldamère a été co-cristallisé et l’affinité des interactions a été caractérisée par dichroïsme circulaire induit et par résonance plasmonique de surface. Ce concept a ensuite été appliqué à une interaction protéine-protéine d’intérêt thérapeutique, le complexe IL-4/IL-4R, dans le cadre du programme européenFOLDAPPI (FP7-PEOPLE-IAPP-2008). / Protein-protein interactions play key roles in many biological processes as well as in many diseases. The importance of these interactions has led to the development of new therapeutic approaches that target protein interfaces. We have developed a protein surface recognition strategy to inhibit protein-protein interactions by using intermediate size organicmolecules called oligoquino line foldamers, that result in very stable and well defined helical structures. These helical backbones are used as templates within each building block can be modulated to allow protein surface recognition.In order to validate this concept, the well-characterized interaction between the enzyme human carbonic anhydrase II (HCAII) and its N-benzyl-4-sulphamoylbenzamide (SBB) inhibitor was selected as a model system. Multi-steps synthesis allowed functionalization of new foldamers able to bind to the enzyme through the SBB inhibitor attached by a spacer.Each foldamer–protein complex was cocrystallized and the affinity of the interactions was assayed using both induced circular dichroïsm and surface plasmon resonance. The concept of using a foldamer against protein-protein interaction was then applied to a protein complex of therapeutic interest, IL-4/IL-4R, within the European FOLDAPPI program (FP7-PEOPLEIAPP- 2008).

De part son profil équilibré en acides aminés essentiels (AAE), la farine de poisson (FP) est la source protéique principale utilisée dans l’alimentation des crevettes d’élevage. Cependant, compte tenu des enjeux du développement durable de la production aquacole, son utilisation doit être réduite, et remplacée par d’autres sources protéiques comme les protéines végétales (PV), qui sont souvent carencées en lysine et méthionine mais riches en cystine. Les conséquences d’un tel changement alimentaire sont peu connues chez la crevette tigrée Penaeus monodon. Pour les évaluer, nous avons utilisédes aliments semi-purifiés reflétant les carences/excès en AA des PV pour estimer les besoins en protéine, lysine et méthionine pour l’entretien et la croissance. Tout en confirmant les données antérieures sur les besoins pour la croissance des stades postlarves, nous avons pu préciser la contribution de l’apport en ces deux acides aminés pour l’entretien. Au niveau métabolique, la variation de l’apport protéique (10, 30, 50% protéine brute) et la carence en méthionine (-30% par rapport au besoin) entraînent une modification de l’activité des enzymes du catabolisme des AA, mais pas celle des voies de reméthylation et transsulfuration. En revanche, et pour la première fois chez la crevette, nos résultats démontrent une épargne de la méthionine par la cystine (et la choline), soulignant l’importance de l’apport en AA soufrés totaux (methionine + cystine). Nos résultats illustrent aussi l’importance qu’il convient d’accorder à la disponibilité des AAE dans les études de remplacement de la FP par un mélange de PV pour améliorer l’utilisation azotée chez la crevette P. monodon. / Due to its well balanced essential amino acid (EAA) profile, fishmeal (FM) is the major protein source used in the formulation of aquafeed for cultured shrimp. To sustain farming systems, its incorporation, however, must be reduced and substituted by other protein sources less well nutritionally balanced, such as plant protein ( PP) which are often low in lysine and methionine but rich in cystine. The metabolic consequences of such a shift in dietary profile are not well known for the black tiger shrimp, Penaeus monodon. To describe these consequences, we used semi-purified diets limiting in lysine and methionine (to reflect PP profile) to determine juvenile requirements of protein, lysine and methionine for both maintenance and growth, applying a factorial approach. Our results confirm the previous data on growth requirement for post-larvalstages of P. monodon while also providing new data on maintenance requirements. At the metabolic level, a variation in the dietary protein level (10, 30, 50 % crude protein) and methionine (adequate or 30% lower) resulted in a significant change in the activity of transdeaminating enzyme, but not those of remethylation and transsulfuration. Nevertheless, we found for the first time that methionine utilisation for body protein accretion can be spared by cystine and choline (up to 50%) in this species, illustrating the importance to consider total sulphur AA supply. Our data also show that full consideration should be given to AA availability in order to develop practical diets with low FM levels for P. monodon.

Mon projet de recherche avait pour but de caractériser le rôle de deux protéines, ArgR et PepA, qui agissent en tant que facteurs accessoires de la recombinaison au niveau de deux sites cer du plasmide ColE1 présent dans la bactérie Escherichia coli. Ces deux protéines, couplées aux deux recombinases à tyrosine XerC et XerD, permettent la catalyse de la recombinaison site spécifique au niveau de la séquence cer, convertissant les multimères instables de ColE1 en monomères stables. Cette étude a principalement porté sur la région C-terminale de la protéine ArgR. Cette région de la protéine ArgR possède une séquence en acides-aminés et une structure similaire à celle de la protéine AhrC de Bacillus subtilis. De plus, AhrC, le répresseur de l’arginine de cette bactérie, est capable de complémenter des Escherichia coli mutantes déficientes en ArgR. Les régions C-terminales de ces protéines, montrent une forte similarité. De précédents travaux dans notre laboratoire ont démontré que des mutants d’ArgR comprenant des mutations dans cette région, en particulier les mutants ArgR149, une version tronquée d’ArgR de 149 acides-aminés, et ArgR5aa, une version comprenant une insertion de cinq acides-aminés dans la partie C-terminale, perdaient la capacité de permettre la recombinaison au niveau de deux sites cer présents dans le plasmide pCS210. Malgré cette incapacité à promouvoir la réaction de recombinaison en cer, ces deux mutants étaient toujours capables de se lier spécifiquement à l’ADN et de réprimer une fusion argA :: lacZ. Dans ce travail, les versions mutantes et sauvages d’ArgR furent surexprimées en tant que protéines de fusion 6-histidine. Des analyses crosslinking ont montré que la version sauvage et ArgR5aa pouvaient former des hexamères in-vitro de manière efficace, alors qu’ArgR149 formait des multimères de plus faible poids moléculaire. Des formes tronquées d’ArgR qui comportaient 150 acides-aminés ou plus, étaient encore capables de permettre la recombinaison en cer. Les mutants par substitution ArgRL149A et ArgRL151A ont tous montré que les substitutions d’un seul acide-aminé au sein de cette région avaient peu d’effets sur la recombinaison en cer. Les expériences de crosslinking protéine-à-protéine ont montré que le type sauvage et les formes mutantes d’ArgR étaient capables d’interagir avec la protéine accessoire PepA, également impliquée dans la recombinaison en cer. Les expériences de recombinaison in-vitro utilisant la forme sauvage et les formes mutantes d’ArgR combinées avec les protéines PepA, XerC et XerD purifiées, ont montré que le mutant ArgR149 ne soutenait pas la recombinaison, mais que le mutant ArgR5aa permettait la formation d’une jonction d’Holliday. Des expériences de topologie ont montré que PepA était capable de protéger l’ADN de la topoisomérase 1, et d’empêcher ArgRWt de se lier à l’ADN. Les deux mutants ArgR149 et ArgR5aa protègent aussi l’ADN avec plus de surenroulements. Quand on ajoute PepA, les profils de migration montrent un problème de liaison des deux mutants avec PepA. D’autres expériences impliquant le triplet LEL (leucine-acide glutamique-leucine) et les acides-aminés alentour devraient être réalisés dans le but de connaitre l’existence d’un site de liaison potentiel pour PepA. / My research project involved the role of two proteins, ArgR and PepA, which act as accessory factors in the ColE1 cer recombination system from the gram negative bacteria Escherichia coli. These two proteins, in addition to the tyrosine recombinases XerC and XerD, catalyze a site-specific recombination event at the cer sequence which converts unstable multimeric forms of ColE1 into more stable monomers. Our study mainly focused on the C-terminal end of the ArgR. This region of the ArgR protein possesses a structural and amino acid sequence similarity with the AhrC protein from Bacillus subtilis. Moreover, AhrC, the Arginine repressor of this bacterium, is able to complement Escherichia coli mutants deficient in ArgR. The C-terminal regions of these proteins, display a very high region of similarity. Previous work from our laboratory has shown that ArgR mutants with mutations in this region, especially the mutants ArgR149, a truncated 149 amino acids form of ArgR, and ArgR5aa, a form containing a five amino acid insertion in the C-terminal part, lost the ability to perform a recombination reaction at two cer sites in the plasmid pCS210. Despite this defect in promoting cer recombination, the mutants were still able to bind specifically to DNA, and to repress an argA :: lacZ genetic fusion. In this work, both wild type and mutant ArgR proteins were overexpressed as 6-histidine fusion proteins. Crosslinking analysis showed that both wild type and ArgR5aa efficiently formed hexamers in vitro, while ArgR149 formed lower molecular weight multimers. Truncated forms of ArgR that were 150 amino acids or longer, were able to support cer recombination. The substitution mutants between positions 149 to 151 all showed that single amino acid substitutions at this region had little effect on cer recombination. Protein-protein crosslinking experiments showed that wild type and mutant forms of ArgR, were able to interact with and the other accessory protein involved in cer recombination, PepA. In vitro recombination experiments using wild type and mutant forms of ArgR, combined with purified PepA, XerC and XerD showed that the ArgR149 mutant did not support recombination, but the ArgR5aa mutant did promote Holliday junction formation, raising the possibility that these two mutants interact differently with the Xer recombination machinery. Topology experiments showed that after adding topoisomerase 1, PepA is able to protect DNA from topoisomerase 1, and prevent ArgRWt binding to DNA. The two mutants ArgR149 and ArgR5aa are protecting DNA with more supercoiling. When PepA is added, migration profiles with the two mutants showed a binding problem with PepA. Other experiments involving the LEL triplet (leucine-glutamic acid-leucine) and amino-acids around it should be done in order to know the existence of a possible binding site for PepA.