La protéine PARL (Presenilins-Associated Rhomboid-Like protein) est une nouvelle protéine présentant des similarités significatives avec la famille de régulateurs développementaux de Drosophila melanogaster Rhomboid, assurant la protéolyse intramembranaire régulée (RIP). La RIP est un processus par lequel certaines protéines transmembranaires sont clivées à l'intérieur de la membrane pour libérer un domaine cytoplasmique actif. Pour valider l'homologie fonctionnelle entre PARL et Rhomboid-1, nous avons conduit une analyse phylogénétique complète portant sur l'ensemble des membres de la super-famille Rhomboid. Cette étude révèle que cette famille est présente à tous les niveaux évolutifs et que tous ses membres, y compris PARL, sont des sérine-protéases catalysant la RIP. Nos études immunohistochimiques démontrent que le profil d'expression de PARL est régulé dynamiquement au cours du développement postnatal du cerveau de souris. D'autre part, PARL est sélectivement exprimée dans les cellules mitotiques et les neurones indifférenciés, mais pas dans les cellules gliales. De plus, chez l'adulte, l'expression de PARL est restreinte aux zones de neurogenèse active tout au long de la vie de l'animal. L'ensemble de ces résultats indique que l'expression de PARL commence durant la phase proliférative des précurseurs neuronaux, continue dans les étapes précoces de la différenciation neuronale et qu'elle est ensuite régulée négativement au cours de la différenciation. Nous proposons donc que l'activité de RIP-protéase de la protéine PARL joue un rôle essentiel dans l'engagement de la cellule vers la destinée neuronale et dans la neurogenèse.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / La maladie de Huntington (MH) est un désordre neurodégénératif très complexe, caractérisé par un éventail de troubles moteurs, cognitifs et psychiatriques. La maladie origine d'une mutation du gène de la *huntingtine* (*HTT*), laquelle mène à la production de la protéine HTT mutée (mHTT) qui s'agrège et interfère avec les fonctions cellulaires. Bien que la mHTT soit au cœur de la pathologie, de plus en plus d'évidences suggèrent que des formes anormales de la protéine Tau se retrouvent dans les structures cérébrales touchées par la MH. Cependant, ses mécanismes de toxicité sont peu connus. Mon projet de thèse avait donc pour but d'élucider la fonction de Tau dans le contexte de la MH. Nous avons choisi d'étudier l'administration de formes fibrillaires de Tau à des modèles murin et cellulaire de la maladie. L'injection intracérébrale de fibrilles a eu pour effet de précipiter et d'exacerber les déficits cognitifs ainsi que les comportements de type anxieux des souris traitées, lesquels étaient accompagnés par une augmentation des niveaux de protéines insolubles et du nombre d'agrégats de mHTT dans les régions du cerveau ciblées par la maladie. Les observations post-mortem ont de surcroit indiqué que les formes fibrillaires de Tau affectent d'autres éléments clés de la MH, tels que la neuroinflammation microgliale et l'atrophie cérébrale. L'exposition de formes pathologiques de Tau à une lignée striatale immortalisée modélisant la MH a également démasqué une altération de la fonctionnalité de la cellule, dépeinte par une augmentation des niveaux de calcium cytosolique. De là, nous avons émis l'hypothèse que l'accumulation d'inclusions de mHTT, suite à l'administration *in vivo* et *in vitro* de Tau, serait causée, entre autres, par un dysfonctionnement des voies de clairance protéique. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux chaperonnes moléculaires, Hsp70 et Hsp90, impliquées dans la protéostase. Nous avons observé que les niveaux solubles de ces protéines étaient effectivement altérés suite à l'exposition aux fibrilles et qu'ils étaient séquestrés à même les agrégats de mHTT. Ces résultats suggèrent une altération du fonctionnement de ces chaperonnes, conduisant à des problèmes de dégradation de protéines pathologiques, et donc une augmentation du nombre d'agrégats mHTT. Nos résultats mettent en lumière les conséquences de Tau sur plusieurs aspects associés à la MH ainsi que sur l'agrégation de la mHTT via un dysfonctionnement de voies de protéostase. Ceci ouvre la voie sur de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter la MH, soit en ciblant Tau ou encore en corrigeant/améliorant la dégradation de protéines pathologiques. / Huntington's disease (HD) is a very complex neurodegenerative disorder, characterized by a range of motor, cognitive and psychiatric impairments. The disease originates from a mutation in the *huntingtin* gene (HTT), which leads to the production of the mutated HTT protein (mHTT) that can in turn aggregate and interfere with cellular functions. Although mHTT is a core feature of the pathology, accumulating evidence suggests that abnormal forms of the Tau protein are also found in brain structures affected by HD but little is known about its mechanisms of toxicity. The aim of my thesis was to elucidate the function of Tau in the pathophysiology of HD. We therefore administered fibrillar forms of Tau to mouse and cell models of the disease. Intracerebral injection of fibrils precipitated and exacerbated cognitive deficits and anxiety-like behaviors in treated mice, which was accompanied by increased levels of insoluble proteins and mHTT aggregates in disease-targeted brain regions. Post-mortem observations further revealed that fibrillar forms of Tau affect other key elements of HD, such as microglial neuroinflammation and brain atrophy. Exposure of pathological forms of Tau to an immortalized striatal cell line also unmasked altered cell functionality, depicted by increased cytosolic calcium levels. From this, we hypothesized that the accumulation of mHTT aggregates, following *in vivo* and *in vitro* Tau exposure, would be caused, among other things, by interference of protein clearance pathways. We were particularly interested in the molecular chaperones Hsp70 and Hsp90 involved in proteostasis. We observed that soluble levels of these proteins were indeed altered following exposure to fibrils, and that they were sequestered within mHTT aggregates. These results suggest an alteration in the function of these chaperones, leading to problems with the degradation of pathological proteins, and hence an increase in the number of mHTT aggregates. Our results highlight the consequences of Tau on several aspects associated with HD, as well as on mHTT aggregation via dysfunctional proteostasis pathways. Our findings pave the way for the identification of new therapeutic approaches to treat HD, either by targeting Tau or by correcting/enhancing the degradation of pathological proteins.

La voie endogène des microARN (miARN) est un processus de régulation cellulaire responsable principalement de réguler la traduction des ARN messagers (ARNm). Les miARN sont de petits ARN d'environ 21 à 23 nucleotides qui se lient spécifiquement à des sites de liaison retrouvés dans la région 3' non-codante des ARNm. Bien que le processus régule une panoplie d'ARNm différents, seulement quelques composantes protéiques sont impliquées afin de réaliser la biogenèse des miARN et de médier leur action régulatrice sur l'expression des gènes. La ribonucléase III Dicer est responsable de la génération des miARN, alors que la protéine Argonaute 2 (Ago2) est au centre du complexe effecteur de nature microribonucléoprotéique (miRNP). Afin d'étudier le fonctionnement de la voie des miARN chez l'humain, nous avons élaboré différents protocoles afin de pouvoir monitorer l'activité catalytique des protéines Dicer et Ago2 in vitro. Dicer a précédemment été localisée au reticulum endoplasmique (RE), mais ne possède pas de signal connu de localisation au RE. L'objectif général de mon projet de doctorat était donc d'identifier si des partenaires protéiques peuvent expliquer la présence de Dicer au RE. Dans ce travail, nous avons identifié et caractérisé la «cytoskeleton-linking endoplasmic reticulum membrane protein of 63 kDa» (CLIMP-63) comme nouveau partenaire protéique de Dicer. Impliquant une portion luminale de la CLIMP-63, l'interaction semble se produire à l'intérieur du RE. Dans les cellules humaines, on retrouve un complexe DicerCLIMP-63 de très haut poids moléculaire, une caractéristique possiblement conférée par la formation d'oligomères de la CLIMP-63. Le marquage métabolique des protéines cellulaires a permis d'observer que la CLIMP-63 interagit avec la forme nouvellement synthétisée de Dicer. La CLIMP-63 semble stabiliser la protéine Dicer, car sa surexpression augmente l'expression de la protéine endogène et surexprimée. La diminution de l'expression de la CLIMP-63, quant à elle, influence négativement l'expression de Dicer de même que celle d'un gène rapporteur contenant des sites de liaison à un miARN. L'ensemble de ces résultats suggèrent que la CLIMP-63 est importante pour le bon fonctionnement de la voie endogène des miARN en interagissant et en stabilisant les formes nouvellement synthétisées de la protéine Dicer.

Bien que les protéines S100A8/A9 et S100A12 exprimées par les neutrophiles ne possèdent pas de peptide signal, elles sont retrouvées dans le sérum de patients souffrant de diverses maladies inflammatoires. Les mécanismes de sécrétion de ces protéines demeurent peu connus ainsi que les agonistes qui favorisent leur sécrétion. Nous avons donc émis l´hypothèse que plusieurs voies de sécrétion alternative ainsi que plusieurs agonistes des neutrophiles pourraient participer à la libération de ces protéines. Dans un premier temps, nous avons étudié les stimuli capables de provoquer la sécrétion de la calprotectine et/ou de la S100A12. Dans une deuxième partie, nous nous sommes intéressés aux signaux et mécanismes alternatifs de sécrétion impliqués dans le relargage de ces protéines. L’ensemble de ces travaux montre la complexité des voies de sécrétion alternatives impliquées dans la sécrétion des protéines S100 et comment ces voies sont influencées par l’activation des neutrophiles par différents agonistes. / Although S100A8/A9 (calprotectin) and S100A12 proteins expressed by neutrophils lack a signal peptide, they are found in the serum of patients with various inflammatory diseases. However, the mechanisms of secretion and the agonists that promote their secretion are still unknown. We hypothesized that several alternative secretory pathways and several agonists of neutrophils may participate in the release of S100A8/A9 and S100A12 protein. Initially, we studied the stimuli inducing the secretion of calprotectin and / or S100A12. In a second part, we were interested in signals and alternative mechanisms of secretion involved in the release of the calprotectin and S100A12. In conclusion, this study shows the complexity of alternative secretion pathways involved in S100 secretion and that these pathways are influenced by the activation of neutrophils by various agonists.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Cette étude est consacrée à l'analyse des propriétés électrostatiques et structurales des protéines diffractant à haute résolution. Les travaux se déclinent en deux aspects principaux qui sont, d'une part, l'analyse d'un point de vue fondamental des propriétés dérivées de leur distribution de charge des structures des protéines, et, d'autre part, l'application pratique des méthodes de la cristallographie haute résolution des macromolécules à deux enzymes.Grâce à une analyse structurale et électrostatique de la protéine PfluDING, le mode de fixation du phosphate a été mis en évidence à deux pH différents. En particulier, cette étude a permis de démontrer la présence d'une liaison hydrogène diffuse assurant un mode de fixation identique quelque soit le pH. La seconde enzyme étudiée est la protéine DFPase, capable de dégrader les organophosphorés. La structure de la DFPase obtenue par diffraction X haute résolution et la structure affinée contre des données neutroniques ont été comparées. L'analyse pointe les différences d'interprétation des deux modèles, et permet de proposer un nouveau mécanisme d'action.Les aspects plus fondamentaux de cette étude portent sur les éléments de structure secondaire des protéines : leurs propriétés électrostatiques en termes de moments électriques (moments dipolaires et quadripolaires des hélices et des feuillets), et le réseau des interactions (dont les liaisons H) assurant la cohésion des hélices ont été analysés. Il a été démontré comment certaines interactions entre liaisons peptidiques au sein d'hélices, classiquement représentées comme des liaisons hydrogène, devaient être considérés comme des contacts purement électrostatiques / This study is about the electrostatic and structural properties of proteins diffracting at high X-ray resolution. Two different aspects are tackled which are 1) the analysis of properties derived from their charge distribution, parting from a fundamental point of view and 2) the application of methods used in high resolution macromolecular crystallography to two enzymes of major interest.After the analysis of the structure and electrostatic properties of PfluDING protein, the binding mode of a phosphate ion, located in the active site, was elucidated at two different pH values. Particularly, this study demonstrates that a diffuse hydrogen bond assures the protonation state of the phosphate ion, which is thus identical at each pH value. The second enzyme studied is the proteine DFPase which is capable of hydrolysing nerve agents. A high resolution X-ray structure and a medium resolution neutron structure where compared. The analysis points out the differences between the two models and a new catalytic mechanism could be proposed.The more fundamental aspects of this study are about the secondary structural elements of proteins: their electrostatic properties in terms of electrostatic moments (dipole and quadrupole moments of helices and sheets) as well as the hydrogen bond network assuring the cohesion of helices have been analyzed. It has been shown that certain interactions between peptide units within helices, represented usually as hydrogen bonds, should actually be considered as pure electrostatic contacts

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Au sein de l'ensemble des protéines Argonautes codées par les génomes des organismes métazoaires, certains membres de cette famille de protéines ont conservé des acides aminés importants pour l'activité endonucléasique. La signification fonctionnelle de ces résidus (composés des résidus DDH), pour les Argonautes spécifiques des miARN chez les animaux, est encore inconnue puisque le ciblage des ARNm par les miARN ne provoque pas de clivage site spécifique comme c'est le cas pour les siARN. In vitro, nous avons mis en évidence, chez le nematode C. elegans, que les protéines Argonautes spécifiques aux miARN, ALG-1 et ALG-2, conservant ce motif, possèdent une activité de clivage similaire à celle impliquée dans la voie des si ARN. Nous démontrons également que les protéines Argonautes ALG-1 et ALG-2 ont la capacité de lier et d'utiliser comme substrats différents duplexes de courts ARN, similaires aux duplexes de miARN produits par l'enzyme DCR-1. Les Argonautes ALG-1 et ALG-2 sont capables de coupure endonucléolytique sur ces duplexes, lorsque le degré de complémentarité entre les deux brins le permet, et de séparer les deux brins d'un duplex de courts ARN contenant des mésappariements. In vivo, l'activité endonucléasique de ALG-1 ou ALG-2 est essentielle pour la voie des miARN, et la perte de cette activité conduit à une accumulation des précurseurs de miARN tronqués et une altération de la formation de miRISC fonctionnel. Prises dans leur ensemble, nos données indiquent que l'activité endonucléasique des protéines Argonaute ALG-1 ou ALG-2 contribue à la maturation des miARN chez le nematode C. elegans.

Chez la levure Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), la voie de l'interférence à l'ARN (iARN) est un mécanisme endogène de régulation génique transcriptionnelle et posttranscriptionnellc médié par de petits acides ribonucleiques (ARN) non-codants générés par la ribonucléase III Dicer (Dcrl). Le rôle et la fonction de Dcrl, cependant, demeure méconnus. Une étude réalisée au laboratoire a précédemment permis l'identification, par une analyse en spectrométrie de masse, de la protéine Byr3 dans des immunoprécipitats de Dcrl. Cette observation suggère la possibilité que Byr3 interagisse avec Dcrl et qu'elle soit impliquée dans la voie de l'iARN. L'homologue de Byr3 chez l'humain est la protéine CNBP, « ccllular nuclcic acid binding protein ». L'interaction entre CNBP et Dicer est donc également envisageable. L'objectif principal de mon travail est de déterminer si la protéine Byr3 et son homologue humain peuvent interagir avec la ribonucléase Dicer, et ainsi être impliquées dans la voie de l'iARN. Chez S. pombe, la création de lignées mutées et d'outils moléculaires a permis d'étudier la protéine Byr3. Chez l'humain, des approches de microscopic par immunofluorescenec et de co-immunoprécipitation (co-IP) ont permis de définir une interaction entre la CNBP et Dicer. Notre travail pave la voie à une caractérisation plus approfondie de l'importance et de la signification de l'interaction entre Byr3 et Dcrl dans la voie de l'iARN / In the fission yeast Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), the RNA interference (RNAi) pathway is an endogenous mechanism of transcriptional and posttranscriptional gene regulation by non-coding small ribonuclcic acids (RNAs) generated by the ribonuclease III Dicer (Dcr1). The role and function of Dcr1 though remains unclear. A previous study in our laboratory allowed the identification, by mass spectroscopy, of the Byr3 protein in Dcr1 immunoprecipitates. This observation suggests the possibility that Byr3 interacts with Dcr1 and is involved in the RNAi pathway. The main objective of my project was to define whether Byr3 and its human homolog, the cellular nucleic acid binding protein, (CNBP), can interact with the ribonuclease Dicer and be implicated in the RNAi pathway. In S. pombe, the creation of mutated strains and molecular tools allowed the study of the protein Byr3. In the human cellular model, methods of immunofluorescence microscopy and co-immunoprecipitation allowed the delineation of an interaction between CNBP and Dicer. Our study paves the way to an in-depth characterization of the importance and significance of the interaction between Byr3 and Dcr1 in the RNAi pathway.