Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Banca: Andréa Regina Baptista Rossit / Banca: Patrick Jack Spencer / Resumo: A tuberculose é uma doença infecciosa que representa um dos principais problemas sociais, econômicos e de saúde pública do mundo. Muitos antígenos potentes demonstraram proteção contra tuberculose nos modelos experimentais e o mais recentemente estudado é a heat shock protein Hsp65 kDa de Mycobacterium leprae. Situações como altas temperaturas, presença de radicais livres e deficiências nutricionais levam ao aumento da produção das Heat Shock Proteins (Hsp's). A principal função das Hsp's é manter a estrutura e função das proteínas e, conseqüentemente, preservar as funções celulares essenciais, agindo como chaperonas moleculares. A Hsp65 de Mycobacterium leprae é altamente imunogênica, acarretando em infecções micobacterianas, reações humorais e celulares por parte do hospedeiro. Além disso, foi evidenciada que a Hsp65 de M. leprae apresenta uma possível atividade de oligopeptidase. Dessa forma, esse projeto teve como alvo principal a expressão e purificação da Hsp65 de M. leprae em grau de pureza e quantidade adequada para realizar estudos estruturais. Devido ao uso de condições desnaturantes para a solubilização da proteína, o espectro de Dicroísmo Circular (CD) foi utilizado para analisar a presença de estrutura secundária. Com o objetivo de investigar a estrutura terciária da Hsp65 (Cpn 60-2), a técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) foi realizada tendo sido observado que a solução apresenta-se monodispersa com um raio hidrodinâmico médio de 10 nm, caracterizando um estado trimérico. A tentativa de cristalização dessa amostra está em andamento e sob intensa observação. Algumas outras condições estão em fase de refinamento na tentativa de se conseguir cristais difratáveis para os estudos estruturais. Além do projeto principal, ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Tuberculosis is an infectious disease that represents one of the most important social, economic and health problems in the world. Many antigens have demonstrated strong protection against tuberculosis in experimental models and the most recent antigen studied for the development of a vaccine againt tuberculosis is the Hsp65 kDa heat shock protein from Mycobacterium leprae.The production of heat shock proteins (Hsp) is greatly enhanced by stress stimuli such as high temperatures, presence of free radicals and nutricional deficiencies. The main function of Hsp's is to preserve the structure and function of proteins and, consequently, the essential cellular functions, acting as molecular chaperones. The M. leprae Hsp65 has been identified as a remarkable immunodominant antigen, since it estimulates humoral immune response and activation of T cells in the host during this bacterial infection. In addition, it was demonstrated that this protein presents a possible enzymatic activity. This project aims at expression, purification and further structural studies of the M. leprae Hsp65. During this project, pure protein was obtained in high amounts. Due to the use of chaotropic agent for resolubilization of the protein present in inclusion bodies far-UV CD studies were accomplished aiming to observe the presence of secondary structures. DLS studies were also carried out to determine the oligomeric state of this Hsp65 (Cpn 60-2), showing that the protein solution was monodisperse with an approximate radius of 10 nm (trimer). Attempts to obtain mono crystals of this sample are currently in progress and under intense observation. Some other refinement conditions are in process in order to obtain crystals suitable for structural studies. The work conducted in parallel with the NUDEL protein (nuclear distribution element-like) was...(Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-04-18Bitstream added on 2014-06-13T19:19:08Z : No. of bitstreams: 1 camargo_fb_me_sjrp.pdf: 735046 bytes, checksum: 0006322f87ae9a50e39b65b0a2d314c9 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A tuberculose é uma doença infecciosa que representa um dos principais problemas sociais, econômicos e de saúde pública do mundo. Muitos antígenos potentes demonstraram proteção contra tuberculose nos modelos experimentais e o mais recentemente estudado é a heat shock protein Hsp65 kDa de Mycobacterium leprae. Situações como altas temperaturas, presença de radicais livres e deficiências nutricionais levam ao aumento da produção das Heat Shock Proteins (Hsp´s). A principal função das Hsp´s é manter a estrutura e função das proteínas e, conseqüentemente, preservar as funções celulares essenciais, agindo como chaperonas moleculares. A Hsp65 de Mycobacterium leprae é altamente imunogênica, acarretando em infecções micobacterianas, reações humorais e celulares por parte do hospedeiro. Além disso, foi evidenciada que a Hsp65 de M. leprae apresenta uma possível atividade de oligopeptidase. Dessa forma, esse projeto teve como alvo principal a expressão e purificação da Hsp65 de M. leprae em grau de pureza e quantidade adequada para realizar estudos estruturais. Devido ao uso de condições desnaturantes para a solubilização da proteína, o espectro de Dicroísmo Circular (CD) foi utilizado para analisar a presença de estrutura secundária. Com o objetivo de investigar a estrutura terciária da Hsp65 (Cpn 60-2), a técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) foi realizada tendo sido observado que a solução apresenta-se monodispersa com um raio hidrodinâmico médio de 10 nm, caracterizando um estado trimérico. A tentativa de cristalização dessa amostra está em andamento e sob intensa observação. Algumas outras condições estão em fase de refinamento na tentativa de se conseguir cristais difratáveis para os estudos estruturais. Além do projeto principal,... / Tuberculosis is an infectious disease that represents one of the most important social, economic and health problems in the world. Many antigens have demonstrated strong protection against tuberculosis in experimental models and the most recent antigen studied for the development of a vaccine againt tuberculosis is the Hsp65 kDa heat shock protein from Mycobacterium leprae.The production of heat shock proteins (Hsp) is greatly enhanced by stress stimuli such as high temperatures, presence of free radicals and nutricional deficiencies. The main function of Hsp's is to preserve the structure and function of proteins and, consequently, the essential cellular functions, acting as molecular chaperones. The M. leprae Hsp65 has been identified as a remarkable immunodominant antigen, since it estimulates humoral immune response and activation of T cells in the host during this bacterial infection. In addition, it was demonstrated that this protein presents a possible enzymatic activity. This project aims at expression, purification and further structural studies of the M. leprae Hsp65. During this project, pure protein was obtained in high amounts. Due to the use of chaotropic agent for resolubilization of the protein present in inclusion bodies far-UV CD studies were accomplished aiming to observe the presence of secondary structures. DLS studies were also carried out to determine the oligomeric state of this Hsp65 (Cpn 60-2), showing that the protein solution was monodisperse with an approximate radius of 10 nm (trimer). Attempts to obtain mono crystals of this sample are currently in progress and under intense observation. Some other refinement conditions are in process in order to obtain crystals suitable for structural studies. The work conducted in parallel with the NUDEL protein (nuclear distribution element-like) was...(Complete abstract click electronic access below)

Orientadores: Elias Basile Tambourgi, Benicio Barros Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-03T15:42:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_LucianaAlvesde_D.pdf: 2730922 bytes, checksum: 043b150df202da459362945b5d5b9777 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Nos últimos anos, os sistemas de duas fases aquosas (SDFAs) têm encontrado aplicações nas diferentes áreas da biotecnologia, especialmente no que se refere à utilização de sistemas alternativos e de baixo custo. Dessa forma é que o sistema constituído de polissacarídeo da goma de cajueiro e polietilenoglicol foi utilizado, no presente trabalho, para o cultivo do fungo Penicillium janthinellum e produção de xilanase. Inicialmente, foram avaliados cinco resíduos agroindustriais (bagaço de cana, casca de mandioca, casca de aveia, sabugo e casca de mi1ho) como indutores para a produção desta enzima. Estes resíduos foram hidrolisados e suas frações líquidas foram utilizadas para o cultivo. A cinética de crescimento do P. janthinellum foi acompanhada para todos os resíduos durante 12 dias. O sabugo de milho e a casca de aveia foram os melhores indutores da xilanase. De posse dos me1hores resíduos, procedeu-se um planejamento, no intuito de determinar as variáveis mais importantes, tanto para fermentação convencional como para a extrativa. O planejamento fracionário em dois níveis procurou avaliar a influência das seguintes variáveis: resíduo agroindustrial, tempo de cultivo, pH inicial, agitação, temperatura e composição do sistema de duas fases aquosas. A maior produção de xilanase no meio convencional foi de 142, 85 U/mL para o hidrolisado de aveia. Isto significou um aumento de 2,58 vezes em relação ao obtido anteriormente sem o estudo das variáveis. A xilanase produzida durante a fermentação extrativa no sistema PEG/polissacarideo da goma do cajueiro concentrou-se na fase superior. O maior valor da produção de xilanase na fase superior e seu rendimento foram 160,7 U/mL e 97%, para o hidrolisado de aveia no sistema PEG 8000/ goma. Assim, o crescimento do P.janthinellum e a produção de xilanase no SDFA foram superiores quando comparados ao sistema convencional. A atividade máxima da enzima no SDFA foi obtida no quinto dia, enquanto que para o meio controle esta foi encontrada no sexto dia / Abstract: In recent years, aqueous two-phase systems (ATPS) have found applications in several biotechnology areas, specially when utilizing altemative low-cost biphasic system. Therefore, in the present work, the aqueous two-phase system based on cashew-nut tree gum and polyethylene glycol was used for Penicillium janthinellum cultivation and xylanase production. lnitially five agricultural wastes (sugar cane bagasse, cassava peel, oat husk corn cob and corn husk) were evaluated for xylanolytic enzymes production by P. janthinellum. These residues were hydrolyzed and their liquid fractions used for cultivation; Growth kinetic was accomplished for all residues during twelve days. Corn cob and oat husk were the best inducers of xylanase. A factorial design was performed using corn cob and oat husk, which intended to determine the most important variables for conventional and extractive fermentation. Two level fractional factorial design evaluated the influence of the following variables: agro-industrial residue, cultivation time, pH initial, agitation, temperature and composition of aqueous two-phase system. The highest xylanase production was 142.85 U/mL in conventional medium of oat husk hydrolyzate. This mean an increase of 2.58 folds when compared to that obtained previously. Xylanase produced during extractive fermentation partitioned into the upper phase. The highest xylanase production in upper phase and its yield were 160.7 U/mL and 97%, respectively, using PEG 8000/gum with oat husk. P. janthinellum growth and enzyme production in ATPS was superior to that conventional system. Maximum xylanase activities were obtained on the 5th day for ATPS and on the 6th day for control medium / Doutorado / Sistemas de Processos Quimicos e Informatica / Doutor em Engenharia Química

Orientador: Francisco Maugeri Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-20T21:29:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kamimura_ElianaSetsuko_M.pdf: 2252737 bytes, checksum: 28619ec44da619f51644f2e94dfd3cd9 (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: Neste trabalho foi proposto um modelo matemático para descrever o comportamento de coluna cromatográfica por afinidade. O processo foi modelado a partir dos balanços de massa de uma coluna de leito fixo e equações cinéticas de adsorção levando consideração também a resistência à transferência de massa externa e a dispersão axial, Obteve-se um sistema de equações diferenciais. A resolução numérica deste sistema foi obtida utilizando-se, simultaneamente, os métodos de Crank-Nicholson e Runge-Kutta de quarta ordem. A validade do modelo foi verificada a partir de dados experimentais obtidos da literatura, sendo que o parâmetro de ajuste do modelo proposto foi a porosidade do leito. Com o intuito de verificar as influências dos parâmetros cinéticos e condições de operação na eficiência de colunas de adsorção, foi realizado um estudo paramétrico. Em ambas escalas estudadas (de laboratório e de produção industrial), foi observado que a porosidade, velocidade superficial e diâmetro da coluna são os parâmetros de maior sensibilidade. No entanto, foi demonstrado que a operação de uma coluna de adsorção por afinidade apresenta considerável estabilidade, haja vista que nenhum parâmetro afeta significativamente a operação da coluna. Por outro lado, parâmetros como Qm (capacidade máxima de adsorção), k1 e k2 (constantes cinéticas de adsorção) devem ser otimizados antecipadamente, através da escolha do adsorvente e condições de adsorção desejáveis. E ainda, com relação aos problemas de limitações do processo de adsorção dentro da coluna, foi observado que o processo é limitado pela taxa de reação, podendo ser negligenciados os problemas de transferência de massa. Para diferentes valores do coeficiente de dispersão, foi possível verificar que a coluna opera aproximadamente como um reator tubular ideal. As conclusões de que se pode desprezar tanto os problemas de transferência de massa como os de dispersão, podem simplificar significativamente a modelagem e simulação de colunas de adsorção por afinidade / Abstract: In this work a mathematical model was proposed to describe the behavior of affinity chromatographic column. The process was modeled from mass balance and affinity adsorption kinetics equations in a fixed-bed column. By considering the extern mass transfer resistance and axial dispersion a set of differential equations was obtained. A combination of the Crank-Nicholson and Runge-Kutta fourth order numerical methods was used in the simulation procedure. The model validity was verified using experimental data from the literature. The adjustment parameter was the void column. This same model was used to predict the behavior of large-scale adsorption columns. A parametric study was performed in order to study the influence of both kinetics and operating conditions in the adsorption column efficiency. The more sensitive parameters were showed to be the porosity, superficial velocity and column diameter for both scales analyzed. It was showed, however, that an affinity adsorption column operation is very stable since no parameters \significantly affects the column operation. On the other hand, parameters like Qm (the maximum adsorption parameter), k1 (the forward kinetic constant) and k2 (the backward kinetic constant) must be optimized previously by choosing the suitable adsorption conditions and adsorbent. Also, looking into the limitation problems of the adsorption process inside the column, it was showed that the process is rate reaction limited, so that mass transfer problems can be neglected. By changing the dispersion coefficient it was also showed that the column operate nearly of an ideal plug flow reactor. Both findings no mass transfer problems and no dispersion problems can simplify the modelling and simulation of affinity adsorption columns / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-03-21Bitstream added on 2014-06-13T20:21:23Z : No. of bitstreams: 1 ullah_a_dr_sjrp.pdf: 8822371 bytes, checksum: 27ee15e9c877124a634e8bf6e77c40bb (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Um certo número de proteínas do veneno foram purificadas, caracterizadas e as suas estruturas foram determinadas para delinear as suas especialidades. (a) A LAAO de Bothrops jararacussu indicou uma maior especialidade para os resíduos hidrófobos, devido a uma substituição de Trp430por lle. O FAD ligado estava em uma conformação diferente do relatado em outros estudos. (b) O domínio rico em cisteína da metaloproteinase (MP III) de Bothrops moojeni pode adotar diferentes orientações relativas. (c) O local de distribuição de carga de serino proteinases é fundamental para determinar a especificidade da enzima. (d) A conformação tetramérica da Lys49 PLA2 de Bothrops brazili indica coexistência de dois estados diméricas. (e) A adição de uma segunda ponte dissulfeto estabiliza o loop catalítico e Trp 230 adota uma conformação diferente na ligação do substrato. Estes resultados contribuem para melhorar a nossa compreensão do modo de ação e função dessas proteínas / A number of venom proteins were purified, characterized and their structures were determined to delineate their specificities. (a) The LAAO from Bothrops jararacussu indicated a higher specifity for hydrophobic residues due to a substitution of Trp430 by lle. The bound FAD was in a diferente conformation to that reported in other studies. (b) The cysteine rich domain of the metalloproteinase (MP III) from Bothrops moojeni can adopt different relative orientations. (c) The local charge distribution of serine proteinases is instrumental in determining enzyme specificity. (d) The tetrameric conformation of the Lys49 PLA2 from Bothrops brazili indicates coexistence of two dimeric states. (e) The addition of a second disulphide bridge stabilizes the catalytic loop and Trp 230 adopts a different conformation on substrate binding. These results contribute to improve our understanding of the mode of action and function of these proteins

Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Banca: Patrick Jack Spencer / Banca: Adélia Cristina Oliveira Cintra / Banca: Jose Ramon Abrego / Banca: Fátima Pereira de Souza / Resumo: Um certo número de proteínas do veneno foram purificadas, caracterizadas e as suas estruturas foram determinadas para delinear as suas especialidades. (a) A LAAO de Bothrops jararacussu indicou uma maior especialidade para os resíduos hidrófobos, devido a uma substituição de Trp430por lle. O FAD ligado estava em uma conformação diferente do relatado em outros estudos. (b) O domínio rico em cisteína da metaloproteinase (MP III) de Bothrops moojeni pode adotar diferentes orientações relativas. (c) O local de distribuição de carga de serino proteinases é fundamental para determinar a especificidade da enzima. (d) A conformação tetramérica da Lys49 PLA2 de Bothrops brazili indica coexistência de dois estados diméricas. (e) A adição de uma segunda ponte dissulfeto estabiliza o loop catalítico e Trp 230 adota uma conformação diferente na ligação do substrato. Estes resultados contribuem para melhorar a nossa compreensão do modo de ação e função dessas proteínas / Abstract: A number of venom proteins were purified, characterized and their structures were determined to delineate their specificities. (a) The LAAO from Bothrops jararacussu indicated a higher specifity for hydrophobic residues due to a substitution of Trp430 by lle. The bound FAD was in a diferente conformation to that reported in other studies. (b) The cysteine rich domain of the metalloproteinase (MP III) from Bothrops moojeni can adopt different relative orientations. (c) The local charge distribution of serine proteinases is instrumental in determining enzyme specificity. (d) The tetrameric conformation of the Lys49 PLA2 from Bothrops brazili indicates coexistence of two dimeric states. (e) The addition of a second disulphide bridge stabilizes the catalytic loop and Trp 230 adopts a different conformation on substrate binding. These results contribute to improve our understanding of the mode of action and function of these proteins / Doutor

Orientador: Everson Alves Miranda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-26T18:53:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Genaro_AnaCarolinaBarrosde_M.pdf: 2652839 bytes, checksum: dc293fdb9bd0dc2dcb6bd2e06ab96441 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: A aprotinina é um inibidor de serino-proteases presente em órgãos bovinos, utilizado como composto farmacêutico em operações cirúrgicas e em cultura de células. Atualmente a aprotinina não é comercialmente produzida no Brasil. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um processo de recuperação de aprotinina a partir de efluente industrial da produção de insulina bovina (SPI), centrado em cromatografia por quimotripsina imobilizada. Foram estudadas três estratégias: a) cromatografia em quimotripsina imobilizada; b) cromatografia em hidroxiapatita seguida de cromatografia em quimotripsina imobilizada e c) cromatografia em quimotripsina imobilizada seguida de cromatografia de afinidade por íon metálico imobilizado (IMAC) utilizando cobre como ligante. A eficiência do processo foi analisada através ensaios de inibição de tripsina e quimotripsina, "dot blot" e eletroforese das frações cromatográficas. A primeira estratégia resultou na recuperação e purificação de aprotinina, da coluna em quimotripsina imobilizada, principalmente nos valores de pH 4,0 e 3,0, quando realizada dessorção em degrau de pH. Na segunda estratégia inicialmente estudou-se o efeito da influência do pH e concentração de NaCI na adsorção de aprotinina de alta pureza na hidroxiapatita. Um planejamento estatístico experimental indicou como condição de alta eficiência tampão fosfato 1 mM, pH 6,5 e 18 mM de NaCI. Dentre 11 soluções estudadas, cloreto de cálcio 3 mM foi a que apresentou melhores índices de dessorção. Entretanto esta segunda estratégia não foi eficiente quando o SPI foi aplicado ao processamento, provavelmente devido a baixa especificidade da hidroxiapatita frente a aprotinina no meio. A terceira estratégia foi a melhor opção estudada para a recuperação e purificação da aprotinina. IMAC foi eficiente como etapa final da purificação depois da recuperação em quimotripsina imobilizada: fatores de purificação global foram tão altos quanto 952 / Abstract: Aprotinin is a pharmaceutical compound used in surgeries and tissue cultures, currently not commercially produced in Brazil. It is a serine-protease inhibitor present in bovine organs. The objective of this work was to develop a process for the recovery of aprotinin from industrial effluent of bovine insulin production (SPI), based on affinity chromatography onto immobilized chymotrypsin. Three approaches were used: a) chromatography onto immobilized chymotrypsin; b) chromatography onto hydroxyapatite followed by chromatography onto immobilized chymotrypsin; and c) chromatography on immobilized chymotrypsin followed by immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) with cupper as the ligant. Efficiency was analysed based on trypsin and chymotrypsin inhibitions, dot blotting, and electrophoresis assays of the chromatographic fractions. The first approach resulted in aprotinin recovery and purification from the chymotrypsin column with pH step elution gradient, mainly at pH 4.0 and 3.0. The second approach was initiated by studying the effects of phosphate buffer solution pH and NaCI concentration on high purity aprotinin adsorption from buffer solutions onto hydroxyapatite. This study was carried out according to a factorial experimental design and indicated 18 mM NaCI and a pH of 6.5 as a high efficiency adsorption condition. Among 11 solutions tested, 3 mM calcium chloride was selected as the best eluent. However, this second approach was not efficient when applied to the processing of SPI probably due to the low specificity of hydroxyapatite towards aprotinin in this medium. The third approach was the best option studied for aprotinin recovery and purification. IMAC was efficient in further purifying aprotinin after its recovery and purification with the chymotrypsin chromatography: overall purification factors were as high as 952 / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Sonia Maria Alves Bueno / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-12T21:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_MariaCristianeMartinsde_M.pdf: 4631873 bytes, checksum: 3ea11569f1a6cd0e7b608b162b33068a (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: As imunoglobulinas (em particular, Imunoglobulina G (IgG)) têm uma aplicação ampla, sendo essenciais em testes de diagnóstico in vitro, em terapia, análises e investigação em diversas áreas. Muitos estudos têm sido realizados visando à purificação de IgG, destacando-se as técnicas de adsorção seletiva, como as cromatografias de troca iônica, negativa e de afinidade. Neste contexto, aplicou-se a cromatografia negativa com diaminas imobilizadas para purificação de IgG a partir do soro e plasma humano em uma única etapa, visando à obtenção de um alto grau de pureza. Os experimentos cromatográficos envolveram cinco etapas: condicionamento, alimentação, lavagem, eluição e regeneração da coluna cromatográfica. Para determinação do melhor ligante para adsorção de impurezas, realizaram-se ensaios com os adsorventes w-aminopropil-agarose, w-aminohexilagarose, w-aminohexil-bisoxirano-agarose, w-aminooctil-agarose, w-aminodecilbisoxirano- agarose, w-aminododecil-bisoxirano-agarose e DEAE-agarose na presença de diferentes sistemas tamponantes. De acordo com eletroforeses SDSPAGE e análises nefelométricas das frações dos picos de proteínas obtidos, a melhor condição utilizada para a purificação de IgG a partir de soro e plasma humano diluído em HEPES 25 mM a pH 6,8 e MOPS pH 7,9, respectivamente, em ?-aminohexil-bisoxirano-agarose, atingindo fator de purificação de 6,8 vezes e pureza superior a 95%. As isotermas de adsorção de albumina, principal impureza do soro e do plasma humano, ajustadas pelo modelo de Langmuir, indicaram alta capacidade de adsorção de albumina dos géis ?-aminohexil-bisoxirano-agarose e ?-aminodecil-bisoxirano-agarose, de 206,6 e 78,6 mg/mL de adsorvente, respectivamente. Os adsorventes ?-aminohexil-bisoxirano-agarose e ?- aminodecil-bisoxirano-agarose mostraram-se mais eficientes para purificação de IgG em termos de rendimento (76,8 e 74,7%, respectivamente) e capacidade dinâmica (4,23 e 4,51 mg de IgG/mL de adsorvente, respectivamente), do que o gel controle DEAE-agarose (51,9% de rendimento e 3,19 mg de IgG/mL de adsorvente). / Abstract: Immunoglobulins, in particular immunoglobulin G (IgG), have a broad application range and are essential to in vitro diagnostic tests, in therapies and researches in several fields. Many studies have been done aiming IgG purification, mainly using techniques of selective adsorption, such as ion exchange chromatography and negative affinity. In this context, the concept of negative chromatography with immobilized diamines was used for IgG purification from human serum and plasma in a single step, aiming to obtain high pure IgG. Chromatographic experiments involved five steps: conditioning, feeding, washing, elution and regeneration of the column. In order to determine the best condition for adsorption of impurities, trial experiments were performed with ?-aminopropylagarose, ?-aminohexyl-agarose, ?-aminooctyl-agarose, ?-aminodecyl-agarose, ?-aminododecyl-agarose and DEAE-agarose using different buffer systems. According to SDS-PAGE and nephelometry analysis, the most selective adsorbent was ?-aminohexyl-bisoxyrane-agarose using HEPES 25 mM pH 6.8 and MOPS pH 7.9 buffers for IgG purification from human serum and plasma, respectively, reaching purification factor of 6.8 times and purity of over 95%. Adsorption isotherms of albumin, main impurity of the human serum and plasma, adjusted by the Langmuir model, showed a high capacity of absorption of albumin by the gels w-aminohexyl-bisoxyrane-agarose and w-aminodecyl-bisoxyrane-agarose, of 206,6 and 78,6 mg/mL of adsorbent, respectively. The absorbents w-aminohexylbisoxyrane- agarose and w-aminodecyl-bisoxyrane-agarose showed more efficient for the purification of IgG regarding the yielding (76,8 and 74,7%, respectively) and dynamic capacity (4,23 and 4,51 mg of IgG/mL of absorbent, respectively), than the control gel DEAE-agarose (51,9% of yield and 3,19 mg of IgG/mL of adsorbent). / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientadores: Rahoma Sadeg Mohamed, Pedro de Alcantara Pessoa Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:06:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Watanabe_ErikaOhta_M.pdf: 2988962 bytes, checksum: bf4098211fb214faf6ddf984cf711041 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: A precipitação induzida pela adição de sais é um processo freqüentemente utilizado na purificação de proteínas em solução aquosa. Após a separação da proteína, o sal presente no precipitado deve ser removido e a solução remanescente necessita de tratamento para que os eletrólitos sejam recuperados e reutilizados no processo, para reduzir o custo e evitar a contaminação do meio ambiente. A precipitação com uso de sais voláteis pode ser uma alternativa a este tipo de processo pois, por elevação de temperatura ou abaixamento de pressão, o eletrólito passa para a forma gasosa e pode ser reutilizado sem purificação adicional. Neste trabalho foi estudada a precipitação de tripsina suina a 4°C utilizando-se o sal volátil carbamato de amônio ('NH IND. 4''NH IND. 2'COO), preparado a partir de carbonato de amônio e hidróxido de amônio de modo que a razão entre as quantidades totais de nitrogênio e carbono (RNlc) fosse. igual a 2,0. A solubilidade da tripsina foi determinada experimentalmente: as concentrações de proteína das fases sobrenadante e precipitado foram obtidas por absorção a 280 nm e confinadas por liofilização. Balanços de massa foram verificados, bem como o tempo necessário para que o equihbrio fosse atingido. Por ser a tripsina uma enzima proteolítica, que apresenta problemas específicos de autólise em seu pH ótimo igual a 8,0, e devido ao caráter básico do sal carbamato de amônio, ensaios de atividade enzimática e avaliação do nível de autólise foram efetuados. Os estudos realizados demonstram que o carbamato de amônio é capaz de induzir a precipitação por "salting-out" da tripsina, e que o acréscimo de amônia ao sistema reduz a efetividade da precipitação. Da análise do balanço de massa observou-se que a concentração inicial de proteína não afeta sua solubilidade, e que o estado de equilibrio é atingido após 1 h. Comparando-se os resultados de atividade total recuperada da tripsina precipitada com o sal volátil e com sulfato de amônio verificou-se a diminuição na atividade da proteína precipitada com carbamato de amônio. Este comportamento é devido provavelmente a um efeito desnaturante do carbamato de amônio, conforme observado por meio de eletroforese SDS-PAGE. Estudos para a remoção do sal volátil da solução de tripsina no processo de precipitação por "salting-out" foram realizados, de modo a demonstrar que a utilização do sal para a precipitação em larga escala é factível / Abstract: Salt-induced precipitation is an extensively used method to purify proteins in aqueous solution. Once precipitation is carried out, additionaI separation steps are necessary both to remove the salt ITomthe precipitate, which is often accomplished by dialysis, and to treat the remaining aqueous phase to recover biomolecules still in solution and to prepare the solution for final disposal or recycling. This post-precipitation treatment can be very costly. The use of volatile electrolytes, which can be removed ITomthe solution by temperature increase or pressure decrease, can be an economically attractive alternative for the precipitation process by conventionaI salts. In this work, the precipitation of suine trypsin at 4°C with the volatile salt ammonium carbamate ('NH IND. 4''NH IND. 2'COO) was investigated. The solubility curve of trypsin was determined by .measuring absorbance at 280 nm of precipitate and supernatant phases, and con:firmed by lyophilization. Mass balance was verified as well as the time necessary to reach the equihDrium.Once trypsin is a proteolitic enzyme presenting autolysis problems at pH equal to 8,0, which is close to the pH of ammonium carbamate solutions, the activity recovery and autolysis leveI in the process were investigated. Experimental results showed that ammonium carbamate is able to induce the trypsin precipitation by salting-out. Mass balance indicated tOOtthe solubility of trypsin is independent of the inicial protein concentration and the equihDriumis reached afier 1 hour. Comparative results of the total activity recovered of the trypsin precipitated with ammonium carbamate and ammonium sulfate showed a decrease of 20% in the activity of the protein precipitated with ammonium carbamate. These results can bé related to denaturing effect of ammonium carbamate as suggested by SDS-PAGE ana1ysis.Volatile salt remova! in the protein solution afier the salting out precipitation was studied to demonstrate the feasibilityofthis precipitation technique / Mestrado / Engenharia de Processos / Mestre em Engenharia Química

Orientador : Cesar Costapinto Santana / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-03T23:59:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_LibiadeSousaConrado_D.pdf: 9163144 bytes, checksum: 7949d3eb39c8f8f9c063bf92849c405f (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Neste trabalho são estudados os efeitos da temperatura, grau de expansão e altura do leito sedimentado sobre: a purificação e recuperação da alfa-lactalbumina, a eficiência da coluna em adsorver todas as proteínas do soro do leite bovino e, o comportamento fluidodinâmico da coluna de leito expandido na presença da solução tampão e do soro de leito bovino. A avaliação da fluidodinâmica foi realizada através da análise quantitativa dos parâmetros Pe, N e j obtidos através da aplicação de um modelo matemático, denominado de PDE. Foi utilizado um planejamento fatorial como ferramenta para verificar o efeito das variáveis estudadas. A alfa-Iactalbumina é uma proteína hidrofóbica e que se liga ao íon cálcio. Essa ligação provoca uma mudança conformacional na sua estrutura tomando-a mais hidrofílica. Essa propriedade é explorada estrategicamente no processo de purificação. Para entender o processo de adsorção foram obtidas isotermas de equilíbrio do soro a 34 °C, da alfa-lactalbumina e da beta-Iactalbumina, separada e conjuntamente, nas temperaturas de 25 e 30 ºC, em tanques agitados. Observou-se que a alta -Iactalbumina adsorve mais fortemente no adsorvente hidrofóbico do que a beta-Iactoglobulina. Através do processo de adsorção realizado na coluna de leito expandido obteve-se a altalactalbumina com grau de pureza de até 100%, detectado por análise realizada em HPLC, para uma altura de leito de 15 cm, temperatura de 32°C e grau de expansão de 2,75. A recuperação dessa proteína foi de aproximadamente 9,5%. Através do ajuste dos dados experimentais, obtidos das curvas de Distribuição dos Tempos de Residência (DTR), ao modelo PDE, encontrou-se valores de Pe, N e j , para a condição em que se obteve o grau de pureza de 100%, iguais a 50, zero e 97%, respectivamente, indicando que ocorreu uma baixa dispersão axial na coluna, que não houve formação de camada estagnada e, como conseqüência, a fluidização do leito não foi comprometida. A análise estatística dos dados do planejamento experimentaI aponta que a temperatura e o grau de expansão têm efeito significativo e positivo sobre a pureza da alfa-Iactalbumina e dos parâmetros Pe e j, que apenas a temperatura possui efeito significativo e negativo sobre a recuperação, e que o grau de expansão e a temperatura têm efeitos negativos sobre o parâmetro N / Abstract: In the present work, the effect of temperature, degree of expansion and sedimented bed high on purification and recovery of alpha-Iactalbumin, on column efficiency in adsorbing all the bovine whey proteins and the fluidodynamic behaviour of expanded column bed in presence of buffer solution and bovine whey, are studied. The fluidodynamic evaluation was performed by quantitative analysis of Pe, N and j parameters which were obtained by using the PDE mathematical model. An experimental factorial design was used as a tool to verify the multivariable affect. Alpha -Iactalbumin is a hydrophobic protein and gets bonded with calcium ion. This bonding results in a conformational change of its structure making it more hydrophilic. This property is strategically explored for the process of purification to understand the adsorption process, the equilibrium isotherm of bovine whey for alpha-Iactalbumin and for beta-Iactoglobulim at 34 ºC , and for apha-Iactalbumin and for beta-lactoglobulim, separately and together, at 25 and 34 ºC, were obtained using well stirred tanks. It was observed that alpha-Iactalbumin adsorbs more strongly on the hydrophobic adsorbent than the beta-lactoglobulim. Alpha-Iactabumin having 100% purity, detected by HPLC analysis, was obtained by the adsorption process, using an expanded bed column of 15 cm bed high, with 2,75 degree of expansion at 30 ºC. The protein recovery was approximately 9,5%. The values of parameters Pe, N and j formed were 50, zero and 97% respectively, which were obtained from the PDE model of the Residence Time Distribution (RTD) curves, thus indicating that in the column, low axial dispersion occurs and there is no formation of a stagnant layer and, consequently, the bed fluidization is not affected. Statistical analysis of the experimental design data points shows that the temperature and degree of expansion have significant and positive effect on the purity of the alpha-Iactalbumin and for the parameters Pe and j, only temperature affects significantly and negatively the protein recovery and that the degree of expansion and temperature have negative effects on the parameter N / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química