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Sobrevivencia, ocorrencia de muda e fenotipos mucleares apos choque de temperatura em Panstrongylus megistus Burmeister

Garcia, Simone Lopes 22 July 2018 (has links)
Orientador: Maria Luiza Silveira Mello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T19:22:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Garcia_SimoneLopes_M.pdf: 3905156 bytes, checksum: a41eb69b400c0c1984d156c63e481ef6 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Ninfas de 30., 40. e 50. estádios e adultos de ambos os sexos de Panstrongylus megistus de hábito domiciliar e silvestre, bem e pouco alimentados, foram submetidos a choques de temperatura de O°C e 40° C por 1h e 12 h. Após o choque, os insetos retomavam a temperatura e umidade controle (28°C e 80% UR), e foram acompanhados diariamente durante um período de 30 a 35 dias para se determinar os níveis de sobrevivência. Para a análise de fenótipos nucleares foram utilizadas ninfas de 50. estádio de hábito domiciliar e pouco alimentadas as quais foram submetidas a choques de 40°C por 1h e 12h e a O°C por 1h. A dissecação dos insetos para a retirada dos túbulos de Malpighi foi efetuada imediatamente após o choque, 10 e 30 dias após. O objetivo foi determinar alterações decorrentes do choque de temperatura, visando promover manutenção mais adequada em insetário e interpretar alterações em insetos provenientes do meio ambiente em esquemas experimentais. Os resultados indicaram variabilidade de resposta aos choques térmicos com relação aos parâmetros estudados. A variabilidade foi dependente da temperatura a que os insetos foram mantidos, duração do tratamento, fase do desenvolvimento e sexo. Choques hipertérmicos de curta duração pouco afetaram a sobrevivência dos insetos, principalmente das ninfas, enquanto os de longa duração foram letais na maioria dos casos. Quanto à ocorrência de mudas, pouca alteração se verificou após choques hipertérmicos, ao contrário do verificado após choques hipotérmicos, os quais se mostraram mais eficazes em promover uma diminuição nessa frequência Choques hipotérmicos, especialmente os de longa duração, promoveram uma queda drástica na taxa de sobrevivência dos espécimes. Os fenótipos nucleares mais frequentes tanto nos insetos do grupo controle quanto nos submetidos a choques, foram os núcleos considerados normais, ou seja, com um pequeno e conspícuo corpo heterocromático (cromossomo Y). Os fenótipos alterados, presentes inclusive nos grupos controle, foram núcleos em degeneração, apoptóticos, com suspeita de apoptose, com heterocromatina aparentemente descompactada, gigantes, gigantes em degeneração, com suspeita de apoptose e gigantes com a heterocromatina aparentemente descompactada. Dentre os fenótipos alterados em maior frequência foram encontrados núcleos suspeitos de apoptose seguidos por núcleos em degeneração e núcleos com a heterocromatina aparentemente descompactada. Um aumento estatisticamente significante nos núcleos em degeneração foi constatado com o decorrer dos dias para dissecação dos espécimes. Núcleos apoptóticos foram observados principalmente após choques hipertérmicos, independente da duração do choque e do tempo pós-choque, enquanto núcleos suspeitos de apoptose foram mais frequentes em insetos dissecados 30 dias após o choque. A maior frequência de núcleos com aparente descompactação da heterocromatina ocorreu em insetos submetidos a choques hipertérmicos, independente da duração do tratamento. Houve uma elevação na frequência de núcleos gigantes após choques hipertérmicos, embora esta não tenha se intensificado com o aumento da duração do tratamento. Os poucos insetos sobreviventes aos choques de 40°C por 12 h, apresentaram uma diminuição significante, quando dissecados 30 dias após o choque, constatando-se também uma interação entre os fatores dias pós-choque e temperatura de choque. Núcleos gigantes em degeneração foram observados com maior frequência após choques hipertérmicos, enquanto um aumento na frequência de núcleos gigantes com suspeita de apoptose foi observado após aumento na duração do tratamento. Com a elevação da temperatura, verificou-se um aumento na frequência de núcleos apoptóticos, gigantes com suspeita de apoptose e núcleos com aparente descompactação da heterocromatina. Os dados levantados para Panstrongylus megistus mostraram-se diferentes dos previamente relatados para Triatoma infestans, salientando a importância de estudos para diferentes espécies, dado o seu comportamento particular / Abstract: Domestic and silvatic third, fourth and fifth instar nymphs and male and female adults of Panstrongylus megistus Burmeister with different feeding conditions were submitted to thermal shocks at ooe and 40oe for 1 and 12 hours. After the shock the insects were retumed to normal temperature and humidity conditions and followed for 30 to 35 days in order to determine survival rates, molting and nuclear phenotypes ofMalpighian tubules. Since feeding and living conditions were not significant factors in the survival rates of specimens submitted to the thermal shock, fasting domestic fifth instars mal e nymphs were used in order to investigate nuclear phenotypes. The insects were submitted to thermal shocks at ooe (1 hour) and 40oe (1 hour and 12 hours) being retumed to control conditions (28°e). The insects were dissected right after shock, 10 and 3 O days after shock for cytological analysis of their Malpighian tubule. The objective was to investigate the changes promoted by the shocks with views to provi de adequate laboratory conditions and to understand changes caused by experimental schemes. The results indicate that the response varies according to temperature, duration of treatment, development stage and sexo Short hyper thermic shocks had little effect, mainly for the nymphs, while long shocks were lethal in the majority of studied cases. About molting, few alterations were observed after hyper thermic shocks in contrast to hypothermic shocks which promoted a falI in the observed frequency. Hypothermic shocks, specially long ones, promoted a drastic fall in the survival rate of the specimens. The most frequent phenotype observed was the one considered normal, not only for the control group but also for the insect submitted to the shocks. Altered phenotypes, found also in nuclear group, included degenerated, apoptotic, suspected of apoptosis, heterocromatin partially or completely unraveled, giant nuclei, this last phenotype being classified also as usual, degenerated, suspected of apoptosis and with heterocromatin partially unraveled. Among the altered phenotypes the predominant one was the suspected of apoptosis nuclei, followed by degenerated and heterocromatin partially unraveled nuclei. There were a rising statistically significant in the frequency of degenerated nuclei when analyzed 30 days after shock. Apoptotic nuclei were observed specially after hyper thermic shocks independently of duration of shock and time after shock. However, suspect of apoptosis nuclei were more frequently observed 30 days after shock. The most frequency of apparently unraveled heterocromatin nuclei occurred after hyper thermic shocks no matter the duration of the shock. A rising in the frequency of giant nuclei was observed after hyper thermic shocks although it did not increase for insects submitted to long duration shocks. The few remain from long hyper thermic shocks presented a significant fall when analyzed 30 days after shock. An interaction between the factors days and temperature was verified for this experimental condition. Degenerated giant nuclei were observed mostly after hyper thermic shocks, while it was observed a rising in the fTequency of suspected of apoptosis giant nuclei after long shocks. The rising in the temperature of the shock caused a rising in the frequency of apoptotic, suspects of apoptosis giant and apparently unraveled heterocromatin nuclei. The data collected for Panstrongylus megistus behaved differently from the data collected previously for Triatoma infestans. Therefore, it shows the importance of studies conceming different species taking into account their peculiar behavior / Mestrado / Parasitologia / Mestre em Ciências Biológicas
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Dupla localização da proteína de choque térmico Mdj1 em Paracoccidioides brasiliensis, identificação de elementos de transcrição na região 5' intergênica compartilhada pelos genes MDJ1/LON e avaliação da sua expressão gênica / Dual localization of the heat shock protein Mdj1 in Paracoccidioides brasiliensis, identificaton of transcriptional elements in the 5'region shared by the genes MDJ1/LON and expression evaluation

Batista, Wagner Luiz [UNIFESP] January 2006 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2015-12-06T23:07:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Paracoccidioides brasiliensis é o fungo dimórfico responsável pela paracoccidioidomicose (PCM). A diferenciação celular do P. brasiliensis de micélio para levedura nos pulmões é essencial para a ocorrência da PCM e é dependente de temperatura. Parte das alterações sofridas pelo fungo está provavelmente relacionada com a expressão de proteínas de estresse (Hsp), pouco conhecidas no P. brasiliensis. Em nosso laboratório foram clonados os genes de P. brasiliensis homólogos aos de duas proteínas mitocondriais de choque térmico: o PbLON, da proteinase Lon, e a porção 5’ do PbMDJ1, da chaperone Hsp40/Mdj1. Estes genes estão ligados por uma região 5’ intergênica comum (ML), o que pode ser relevante em relação à regulação transcricional não apenas porque ambos respondem ao estresse, mas também pela relação funcional. Mdj1p é o membro da família DnaJ localizado na matriz mitocondrial, o qual é essencial na digestão de proteínas desnaturadas pela Lon. Neste trabalho o gene PbMDJ1 de P. brasiliensis foi totalmente caracterizado. Sua sequência apresenta uma ORF de 1659pb, organizada em três exons interrompidos por dois introns. PbMdj1 apresenta 551 aminoácidos com alta similaridade com as homólogas de Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum e Coccidioides immitis. O alinhamento destas sequências permitiu mapear todos os domínios que caracterizam a família da DnaJ, a saber, um domínio J, um domínio rico em G/F e um domínio ligante de zinco organizado em quatro repetições de CXXCXGXG. Para a expressão de PbMdj1 recombinante em bactéria, um fragmento de cDNA de 757pb da região 5´ foi subclonado no vetor pHIS3. A proteína PbMdj1r foi purificada e utilizada na obtenção de anticorpos policlonais de coelho. Em microscopia eletrônica e confocal, os anticorpos anti-PbMdj1r localizaram a molécula na mitocôndria de leveduras de P. brasiliensis Pb18, mas também abundantemente na parede celular e região de brotamento. Em ensaios de “imunoblotting”, os anticorpos revelaram uma proteína nativa de 55 kDa tanto em extratos mitocondriais, com significativo aumento da expressão em condições de estresse térmico, como em uma fração de parede. Sua localização extramitocondrial foi confirmada ainda por citometria de fluxo (FACS). Alguns soros de pacientes com PCM reagiram com a PbMdj1r em “immunoblotting”, sugerindo que os pacientes reconhecem essa proteína durante a infecção. Obervamos que locus cromossômico dos genes MDJ1/LON é comum entre fungos dimórficos e Aspergillus. Na região intergênica 5’ compartilhada pelos genes MDJ1/LON de P. brasiliensis Pb18 e Pb3 foram mapeados e validados 4 elementos de transcrição usando o ensaio de proteção contra DNase I “footprinting” e em experimentos de retardo da mobilidade eletroforética (EMSA). Essas regiões abrigam um elemento de choque térmico convencional, dois não-convencionais e outro ligante de AP-1 (ARE), associado ao estresse oxidativo. Foram encontrados motivos similares nos locus correspondente de B. dermatitidis e H. capsulatum. O Pb3, que pertence a uma espécie críptica filogeneticamente distinta, apresentou polimorfismo na região ML. As análises comparativas entre Pb18 e Pb3 mostraram diferenças no número de elementos de transcrição no padrão da regulação transcripcional de PbLON e PbMDJ1 durante a transição de fase. Em Pb18, PbMDJ1 parece ser preferencialmente expresso na fase leveduriforme. Ambos os genes apresentaram aumento nos níveis de transcrição após choque térmico a 42 ºC, porém em Pb3 esse efeito foi mais lento. Este é o primeiro trabalho que detecta elementos de trancrição em P. brasiliensis e pode contribuir significativamente para entendimento da regulação de genes de estresse em fungos dimórficos. As diferenças detectadas em Pb18 e Pb3 quanto à regulação transcricional dos genes aqui estudados e eventualmente outros poderá explicar a distinta relação parasitahospedeiro que os isolados apresentam em camundongos B10.A. / Paracoccidioides brasiliensis is the dimorphic fungus responsible for paracoccidioidomycosis in man, who is infected by inhalation of conidia. The cellular differentiation of P. brasiliensis from mycelium (M) to yeast (Y) in the lungs is essential for infection to occur. J-domain (DnaJ) proteins, of the Hsp40 family, are essential cofactors of their cognate Hsp70 chaperones, besides acting as independent chaperones. In the present study, we have cloned and sequenced the heat shock gene PbMDJ1, which encodes an Mdj1 homologue that is a mitocondrial DnaJ in yeasts. The gene sequence consists of an ORF of 1719bp interrupted by three introns and translates 551 amino acid residues. PbMdj1 is organized in modules consisting of a J domain, followed by a glycine/phenylalanine-rich segment and four CXXCXGXG (zinc finger) domains. The C-terminal is not conserved. We expressed a His-tagged N-terminal region of PbMdj1 and used the recombinant protein to immunize rabbits to obtain anti-PbMdj1r serum. Immune-localization was performed using confocal and electron microscopy, and also flow cytometry. We demonstrated the presence of PbMdj1 not only in the mitochondria, where it is apparently sorted, but also in the cell wall of P. brasiliensis. Labeling was abundant throughout the cell wall and especially in the budding regions; however, anti-PbMdj1r did not affect fungal growth in the concentrations tested in vitro, possibly due to the poor access of the antibodies to their target in growing cells. Labeled mitochondria stood preferentially close to the plasma membrane and gold particles were detected in the thin space between them, towards the cell surface. The anti-rPbMdj1 antibodies used in the reactions specifically recognized a single 55 kDa mitochondrial and cell wall (alkaline β-mercaptoethanol extract) component, compatible with the predicted size of the protein devoid of its matrix peptidetargeting signal. This is the first time a DnaJ member has been observed on the cell surface, where its function is speculative. In the present work we show that Mdj1 and the mitochondrial proteinase Lon homologues are heat shock proteins in the P. brasiliensis and that their gene organization is conserved among thermodimorphic fungi and Aspergillus, where the genes are adjacent and have a common 5´region. We mapped and validaded transcription elements in the 5´-shared intergenic (ML) region of MDJ1/LON from P. brasiliensis using both DNAse I protection footprinting and mobility shift assays. Three of them were similar to canonical and nonconventional heat shock elements and one is a putative AP-1 binding domain (ARE), related to oxidative stress. Similar motifs were detected in the correspondent locus of B. dermatitidis and H. capsulatum. Our studies compared P. brasiliensis Pb18 with genetically distinct Pb3, where the ML region is polymorphic outside mapped motifs. In these isolates, different numbers of elements were detected and the pattern of mRNA accumulation of the genes was distinct during phase transition. In Pb18, PbMDJ1 was preferentially expressed in the yeast phase. This is the first study of transcription elements in P. brasiliensis that might help to understand regulation of stress-related genes involved in fungal adaptation to the host. / BV UNIFESP: Teses e dissertações
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Indução da síntese de proteínas de choque térmico (HSP) mediada pelo óxido nítrico em resposta ao exercício de resistência

Oliveira Junior, Lino Pinto de January 2005 (has links)
A indução de proteínas de choque térmico (HSP) é fundamental nos processos de reparo que seguem diferentes tipos de dano celular. O exercício físico é capaz de induzir a síntese de HSP, o que parece estar relacionado com a prevenção de desnaturação protéica por radicais livres, provável causa dos efeitos duradouros da fadiga de baixa freqüência. Por sua vez, a formação de óxido nítrico (NO) também aumenta nas células musculares em contração, podendo determinar estresse oxidativo, ativação do fator nuclear κB (NF-κB) e injúria tecidual. No entanto, o NO também induz a síntese de HSP, o que deve causar citoproteção pela inibição da ativação do NF-κB. Portanto, a geração de NO durante o exercício pode desempenhar um duplo papel, a saber: induzir injúria tecidual ligada à ativação do NF-κB e; proteger contra a mesma pela indução de HSP que bloqueiam a ativação do primeiro. Neste trabalho investigamos o papel do NO na indução de HSP70 em resposta ao exercício agudo. Com base nos nossos resultados e nas informações disponíveis a partir de outros estudos, podemos concluir que o exercício de natação com uma sobrecarga de 5 % do peso corporal preso ao animal é capaz de aumentar o conteúdo de HSP70 (em até 33%, p < 0,05) no músculo esquelético e que este aumento está associado a estresse oxidativo (aumento de 2,4 vezes no índice de estado redox), depleção de reservas energéticas (redução de 47% no conteúdo de glicogênio, p <0,05) e maior produção de NO pelos músculos (em até 1,7 vezes, p<0,05). A administração de L-NAME foi capaz de impedir o aumento no conteúdo de HSP70 induzido pelo exercício, sugerindo que o NO seja um importante mecanismo de indução destas proteínas em resposta ao exercício. No entanto, estudos adicionais são necessários para validar a hipótese de que o NO seja responsável pela indução da síntese de HSP70 em resposta ao exercício de resistência.
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Indução da síntese de proteínas de choque térmico (HSP) mediada pelo óxido nítrico em resposta ao exercício de resistência

Oliveira Junior, Lino Pinto de January 2005 (has links)
A indução de proteínas de choque térmico (HSP) é fundamental nos processos de reparo que seguem diferentes tipos de dano celular. O exercício físico é capaz de induzir a síntese de HSP, o que parece estar relacionado com a prevenção de desnaturação protéica por radicais livres, provável causa dos efeitos duradouros da fadiga de baixa freqüência. Por sua vez, a formação de óxido nítrico (NO) também aumenta nas células musculares em contração, podendo determinar estresse oxidativo, ativação do fator nuclear κB (NF-κB) e injúria tecidual. No entanto, o NO também induz a síntese de HSP, o que deve causar citoproteção pela inibição da ativação do NF-κB. Portanto, a geração de NO durante o exercício pode desempenhar um duplo papel, a saber: induzir injúria tecidual ligada à ativação do NF-κB e; proteger contra a mesma pela indução de HSP que bloqueiam a ativação do primeiro. Neste trabalho investigamos o papel do NO na indução de HSP70 em resposta ao exercício agudo. Com base nos nossos resultados e nas informações disponíveis a partir de outros estudos, podemos concluir que o exercício de natação com uma sobrecarga de 5 % do peso corporal preso ao animal é capaz de aumentar o conteúdo de HSP70 (em até 33%, p < 0,05) no músculo esquelético e que este aumento está associado a estresse oxidativo (aumento de 2,4 vezes no índice de estado redox), depleção de reservas energéticas (redução de 47% no conteúdo de glicogênio, p <0,05) e maior produção de NO pelos músculos (em até 1,7 vezes, p<0,05). A administração de L-NAME foi capaz de impedir o aumento no conteúdo de HSP70 induzido pelo exercício, sugerindo que o NO seja um importante mecanismo de indução destas proteínas em resposta ao exercício. No entanto, estudos adicionais são necessários para validar a hipótese de que o NO seja responsável pela indução da síntese de HSP70 em resposta ao exercício de resistência.
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Indução da síntese de proteínas de choque térmico (HSP) mediada pelo óxido nítrico em resposta ao exercício de resistência

Oliveira Junior, Lino Pinto de January 2005 (has links)
A indução de proteínas de choque térmico (HSP) é fundamental nos processos de reparo que seguem diferentes tipos de dano celular. O exercício físico é capaz de induzir a síntese de HSP, o que parece estar relacionado com a prevenção de desnaturação protéica por radicais livres, provável causa dos efeitos duradouros da fadiga de baixa freqüência. Por sua vez, a formação de óxido nítrico (NO) também aumenta nas células musculares em contração, podendo determinar estresse oxidativo, ativação do fator nuclear κB (NF-κB) e injúria tecidual. No entanto, o NO também induz a síntese de HSP, o que deve causar citoproteção pela inibição da ativação do NF-κB. Portanto, a geração de NO durante o exercício pode desempenhar um duplo papel, a saber: induzir injúria tecidual ligada à ativação do NF-κB e; proteger contra a mesma pela indução de HSP que bloqueiam a ativação do primeiro. Neste trabalho investigamos o papel do NO na indução de HSP70 em resposta ao exercício agudo. Com base nos nossos resultados e nas informações disponíveis a partir de outros estudos, podemos concluir que o exercício de natação com uma sobrecarga de 5 % do peso corporal preso ao animal é capaz de aumentar o conteúdo de HSP70 (em até 33%, p < 0,05) no músculo esquelético e que este aumento está associado a estresse oxidativo (aumento de 2,4 vezes no índice de estado redox), depleção de reservas energéticas (redução de 47% no conteúdo de glicogênio, p <0,05) e maior produção de NO pelos músculos (em até 1,7 vezes, p<0,05). A administração de L-NAME foi capaz de impedir o aumento no conteúdo de HSP70 induzido pelo exercício, sugerindo que o NO seja um importante mecanismo de indução destas proteínas em resposta ao exercício. No entanto, estudos adicionais são necessários para validar a hipótese de que o NO seja responsável pela indução da síntese de HSP70 em resposta ao exercício de resistência.
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Proteínas de choque térmico de 70 kDa (HSP70) ligam-se à insulina na circulação sanguínea modulando a disponibilidade de glicose circulante / Extracellular 70 kDa heat shock protein binds insulin in the circulation and regulates plasma glucose availability

Ludwig, Mirna Stela January 2013 (has links)
Situações de estresse metabólico e térmico deflagram a expressão celular e liberação para o plasma, de proteínas de choque térmico da família de 70 kDa (HSP70) para desempenhar função de defesa-chave em um processo conhecido como resposta ao choque térmico ou ao estresse, que as caracterizam como proteína citoprotetora. Estudos indicam a ocorrência de HSP70 extracelular (eHSP70) na circulação por até 24 h após desafios como o exercício físico, cuja liberação dá-se por tecidos do território hepatoesplâncnico, em uma resposta mediada por receptores α-adrenérgicos. Esta liberação de HSP70 para o plasma é atenuada pela ingestão de glicose. Estas evidências levaram-nos a supor que a liberação de eHSP70 em resposta ao estresse possa ter um papel fisiológico na regulação da glicemia, a qual é afetada por estímulo simpático. Neste trabalho, os resultados dos experimentos in silico indicaram a possibilidade de ancoragem e interação estável entre a HSP70 e a molécula de insulina. Ensaios de imunoprecipitação de insulina com amostras de plasma de animais submetidos ao tratamento de insulina Regular e Detemir revelaram HSP70 coimunoprecipitada especialmente em situação de jejum severo. Parte destas amostras foi submetida à quantificação de glicemia, insulinemia e HSP72 circulante, cujos resultados evidenciam elevada concentração desta proteína de choque térmico por ocasião de hipoglicemia induzida por insulina. Parte dos estudos in vivo deste trabalho foram desenvolvidos com ratos submetidos ao choque térmico agudo (uma sessão de 15 minutos) com hipertermia induzida (41,5 °C) ou com injeção de HSP70 (HSPA1A) exógena, com grupos experimentais organizados em grupos Controle (C) e Choque Térmico (HS) e, em tempos experimentais: imediatamente (tempo zero), 6, 12 e 24 h pós-choque. Foi observada a ocorrência das formas constitutiva e induzível de eHSP70 no plasma de animais submetidos ao choque térmico com valor maior nos períodos de 12 e 24 h pós-choque. Nossos estudos mostram que, in vivo, a eHSP70 plasmática produz alteração na tolerância à glicose, com maior hiperglicemia, quando o teste é realizado 12 h após o choque térmico. Este efeito foi bloqueado pela administração (i.p.) de anticorpo anti-HSP70 e se mostrou independente da síntese de novo de HSP70. Ainda, a presença de eHSP70 plasmática (induzida por choque térmico ou administrada via endovenosa) causa menor captação de glicose pelo músculo esquelético. Ensaios com músculo isolado indicam que o efeito inibidor da eHSP70 sobre a captação de glicose é dependente de insulina. Apesar das evidências de que a ligação HSP70-insulina no plasma tenha implicação sobre a oferta de glicose, não se pode descartar também a possibilidade de que as ações da eHSP70 estejam ocorrendo pela sua ligação a receptores específicos, e/ou de que sejam parte de uma resposta ao estresse na qual estejam implicados os hormônios contrarregulatórios. Em suma, os resultados indicam que a eHSP70 plasmática é capaz de se ligar- à insulina, provocar tolerância alterada à glicose e diminuir a captação de glicose pelo músculo esquelético, aumentando a disponibilidade de glicose circulante. / Metabolically stressful situations trigger the expression and release of the 70 kDa (HSP70) as an essential protective response, in a process known as heat shock (HS) response or stress response. HSP70 is characterized as cytoprotector entities. Previous studies indicate the occurrence of extracellular HSP70 (eHSP70) in the circulation up to 24 h after stressful challenges, such as physical exercise, and that such eHSP70 liberation comes from hepatosplancnic tissues, in an 1-adrenergic dependent response, which is attenuated by glucose ingestion. The above findings led us to suppose that stress-elicited eHSP70 release could play a physiological role on glycemic control, which are affected by sympathetic stimuli. In this work, in silico experiments indicated the possibility of docking and stable interaction between HSP70 and the insulin molecule. Immunoprecipitation of plasma samples revealed that HSP70 co-immunoprecipitates with insulin, especially under severe fast. Part of these samples was subjected to quantification of glucose, insulin and circulating HSP72, whose results show high concentration of heat shock protein during severe hypoglycemia induced by insulin. Part of the in vivo studies from this work were also carried out in healthy rats submitted to an acute (15 min) HS (41.5 °C) session or in HSP70 (HSPA1A)-injected rats, assigned into control (C) and HS groups which were observed immediately and after 6, 12 and 24 h post-shock. Both the constitutive (predominantly) and the inducible forms of eHSP70 were observed in the plasma of heat shocked animals, being the times 12 and 24 h those in which the highest concentrations were noted. Our studies suggest that in vivo produces eHSP70 change in plasma glucose tolerance, greater hyperglycemia when glucose tolerance test is performed 12 h after heat shock, and this effect was abrogated by anti-HSP70 antibody administration (i.p.) and independent of de novo synthesis of HSP70. Moreover, the presence of eHSP70 (HS-induced or injected) in the plasma or in soleus muscle incubations elicits lower glucose uptake from the skeletal muscle. Isolated muscle studies indicate that eHSP70 inhibiting effect over glucose uptake is insulin-dependent. However, although evidence suggests a role for HSP70 binding to insulin over glucose offering, it cannot be discarded the possibility that eHSP70 actions are due to their binding to specific HSP70 membrane receptors within the muscle cell, and/or that are part of a stress response in which the counter-regulatory hormone are involved. In short, the results indicate that eHSP70 plasma is able to bind to insulin, causing impaired glucose tolerance and decrease glucose uptake by skeletal muscle, increasing blood glucose availability.
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A interação diferencial da proteína de choque térmico de 70kDa com o receptor dos produtos finais de glicação avançada e toll-like 4: uma relação com suas diferentes conformações e com o estado redox

Grunwald, Marcelo Sartori January 2017 (has links)
A expressão da HSP70 intracelular está associada a efeitos citoprotetores contra uma variada gama de estímulos estressores e situações onde é comum que proteínas sofram ação de agentes oxidantes. A HSP70 foi recentemente detectada no meio extracelular, e sua presença tem sido associada a situações patológicas, nas quais ela exerce efeitos modulatórios sobre células do sistema imunológico. Para investigar a possível associação entre HSP70 oxidada e efeitos citoprotetores ou morte celular, macrófagos da linhagem RAW 264.7 foram incubados com HSP70 e HSP70 oxidada. Observamos que a oxidação da HSP70 alterou a estrutura da proteína; e que os macrófagos tratados com HSP70 oxidada apresentaram menor proliferação, maior produção de espécies reativas de oxigênio, menor atividade fagocítica e menor liberação de TNF-α. Estes resultados indicam que a oxidação da HSP70 extracelular modifica suas propriedades sinalizadoras, causando alterações na modulação das funções e da viabilidade dos macrófagos. Uma vez que estes resultados não concordam com as vias de sinalização ativadas classicamente por HSP70, via receptor TLR4, observamos uma nova interação com o receptor dos produtos finais de glicação avançada em um modelo de cultura de células A549 através de sondas fluorescentes. A quantificação do experimento mostrou um maior número de interações quando as células são tratadas com HSP70 na sua conformação ligada à ATP em comparação com o tratamento com HSP70 na sua conformação ligada à ADP; e, através de sucessivos experimentos de docking molecular propusemos um modelo putativo para a interação. Além disso, mostramos que na conformação ligada à ADP, a HSP70 interage preferencialmente com TLR4, de forma similar ao peptídeo MD-2, necessário para o reconhecimento de LPS, sugerindo que a chaperona atue como uma molécula acessória ou como citocina, dependendo do receptor e da situação patológica ou fisiológica. / Expression of intracellular HSP70 is associated to cytoprotective effects against a wide range extent of stressful stimuli and conditions where is common to proteins to suffer the action of oxidative agents. HSP70 was recently detected in the extracellular medium and its presence in serum is commonly associated with pathological situations, where it exerts modulatory effects on cells of the immune system. To investigate the possible association between oxidized HSP70 and cytoprotection or cell death, we incubated RAW 264.7 macrophages with oxidized HSP70. We observed that the Oxidation of HSP70 altered its protein structure; and that macrophages treated with oxidized HSP70 presented lower proliferation, higher reactive oxygen species production, lower phagocytic activity and TNF-α release. These results indicate that oxidation of extracellular HSP70 modify its signaling properties, causing alterations on its modulatory effects on macrophage function and viability. As these results do not concur with the signaling pathways classically activated by HSP70, via TLR4, we observed a new interaction with the receptor for advanced glycation end products through fluorescent probes in a A549 cell culture model. Quantification of the experiment showed a higher number of interactions when cells are treated with HSP70 bound to ATP when compared to the treatment with HSP70 in the conformation ADP-bound; and, by successive molecular docking experiments, we proposed a putative model for such interaction. Moreover, we showed that on its ADP-bound conformation, HSP70 binds preferentially to TLR4, in a similar way as the peptide MD-2, necessary for the recognizing of LPS, suggesting that the chaperone could act as an accessory molecule or as a cytokine, depending on the receptor and physiological or pathological situation.
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Anticorpos antifosfolípides e antiproteínas de choque térmico na doença obstrutiva severa de artérias carótidas

Lopes, Mateus Recuero January 2006 (has links)
Made available in DSpace on 2013-08-07T19:04:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000383317-Texto+Completo-0.pdf: 533302 bytes, checksum: d1c54ea34e0bdbcdd31f54bbce98b274 (MD5) Previous issue date: 2006 / Theoretical basis – Severe obstructive carotid artery disease is related to atherosclerosis (ATC). Mechanisms of inflammation and self-immunity may have influence on the occurrence of ATC. This includes antiphospholipid antibodies (AAP), antiphospholipid syndrome markers (APS) and antibodies against heat shock proteins (anti-Hsp). A beta 2-glycoprotein I (beta2-gpI) and the 60 and 65 kilodaltons (kDa) Hsp are molecules present in atherosclerotic plaques. This is the first report including research on IgA anticardiolipin (aCL), IgG/IgM/IgA anti-beta2- glycoprotein I and anti-HSP in severe obstructive carotid artery disease cases. Objective – To determine the association, if any, between the presence of AAP/anti-Hsp and the occurrence of severe obstructive carotid artery disease. Patients and Methods – In our control case study the cases consisted of patients with either symptomatic or asymptomatic severe obstructive carotid artery disease. The presence of the disease was determined by anamnesis, physical examination, MR angiography (MRA) and carotid endarterectomy. The control group consisted of patients admitted to orthopedic wards. Both groups were assessed for risk factors: age, sex, race, hypertension, smoking, diabetes mellitus (DM) and hypercholesterolemy. IgG/IgM/IgA aCL, IgG/IgM/IgA anti-beta2-gpI, IgG anti-Hsp 60 kDa recombinant human and IgG anti-Hsp 65 kDa of Mycobacterium bovis antibodies were detected by enzymatic test. In order to assess the degree of association between antibodies with severe obstructive carotid artery disease, (odds ratios, OR) were calculated with their respective confidence intervals (IC 95%).Logistic regression was used to adjust the confusion factors. Results – 57 case patients and 93 control patients were studied and the average age was 66 + 8. 7 years for case patients and 47. 5 + 18. 8 years for control patients (P<0. 001). There was a predominance of black race individuals in the control group. Most case patients were male individuals (61. 4%), but there were less male individuals (49. 5%) among control patients. The presence of hypertension (OR=21. 0; IC 95% 8. 0 to 57. 1; P<0. 001) and hypercholesterolemy (OR=25. 5; IC 95% 9. 5 to 70. 9; P<0,001) determined the strongest associations between the risk factors already known and severe obstructive carotid artery disease. IgA antibeta2-gpI antibodies were detected in 33. 3% of the case patients and in 9. 7% of the control patients (OR adjusted 4. 7; IC 95% 1. 0 to 23. 7; P=0. 06). The frequency of other non-tested antibodies was not significantly different in cases and controls. Conclusion – No association was found between the presence of aCL, IgG/IgM antibeta2-gpI, anti-Hsp and the occurrence of severe obstructive carotid artery disease. The presence of IgA antibeta2-gpI antibodies was found to be an independent risk factor for severe obstructive carotid artery disease (OR adjusted 4. 7), although with borderline significance (P=0,06). The association of IgA antibeta2-gpI with severe obstructive carotid artery disease may be one of the links between auto-immunity and carotid. / Base teórica - A doença obstrutiva severa de artérias carótidas (DOSAC) está relacionada à aterosclerose (ATC). Mecanismos de inflamação e auto-imunidade podem influenciar o deflagramento da ATC. Neste contexto, incluem-se anticorpos antifosfolípides (AAF), marcadores da síndrome antifosfolipídica (SAF) e anticorpos contra proteínas de choque térmico (anti-Hsp). A beta2-glicoproteína I (beta2-gpI) e as Hsp de 60 e 65 kilodaltons (kDa) são moléculas encontradas em ateromas. O relato é o primeiro a incluir a pesquisa de IgA anticardiolipina (aCL), IgG/IgM/IgA antibeta2-gpI e anti-HSP em casuísticas de DOSAC. Objetivo - Avaliar a associação, se alguma, entre ocorrência de AAF/anti-Hsp e DOSAC. Pacientes e Métodos - Neste estudo de caso-controle, os casos consistiram de uma população de pacientes com DOSAC (sintomática ou assintomática). A presença de DOSAC foi definida pela anamnese, exame físico, angiografia por ressonância nuclear magnética (ARM) e endarterectomia de carótida. Os controles foram selecionados de enfermarias de ortopedia. Ambos os grupos foram avaliados quanto aos fatores de risco: idade, sexo, raça, hipertensão arterial sistêmica (HAS), tabagismo, diabete mellitus (DM) e hipercolesterolemia. Anticorpos IgG/IgM/IgA aCL, IgG/IgM/IgA antibeta2-gpI, IgG anti-Hsp 60 kDa humana recombinante e IgG anti-Hsp 65 kDa de Mycobacterium bovis foram detectados através de ensaio enzimático. Para estimar o grau de associação dos anticorpos com DOSAC, razão de chances (odds ratios, OR) foram calculadas com seus respectivos IC 95%.Regressão logística foi utilizada para ajuste de fatores de confusão. Resultados - Entre os 57 casos e 93 controles estudados, a média de idade foi de 66 + 8,7 anos nos casos e de 47,5 + 18,8 anos nos controles (P<0,001). A raça negra predominou no grupo controle. O sexo masculino foi mais freqüente nos casos (61,4%), situação que se inverteu nos controles (49,5%). As presenças de HAS (OR=21,0; IC95% 8,0 a 57,1; P<0,001) e de hipercolesterolemia (OR=25,5; IC95% 9,5 a 70,9; P<0,001) determinaram, entre os fatores de risco conhecidos, as mais fortes associações com DOSAC. Anticorpos IgA antibeta2-gpI foram detectados em 33,3% dos casos e em 9,7% dos controles (OR ajustado 4,7; IC95% 1,0 a 23,7; P=0,06). A freqüência dos outros anticorpos testados não diferiu significantemente em casos e controles. Conclusão - Não houve associação entre ocorrência de aCL, IgG/IgM antibeta2- gpI, anti-Hsp e desfecho DOSAC. A presença de anticorpos IgA antibeta2-gpI se configurou como fator de risco independente para DOSAC (OR ajustado 4,7), embora com significância limítrofe (P=0,06). A associação de IgA antibeta2-gpI com DOSAC pode representar um dos elos na relação auto-imunidade e aterosclerose carotídea.
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Proteínas de choque térmico de 70 kDa (HSP70) ligam-se à insulina na circulação sanguínea modulando a disponibilidade de glicose circulante / Extracellular 70 kDa heat shock protein binds insulin in the circulation and regulates plasma glucose availability

Ludwig, Mirna Stela January 2013 (has links)
Situações de estresse metabólico e térmico deflagram a expressão celular e liberação para o plasma, de proteínas de choque térmico da família de 70 kDa (HSP70) para desempenhar função de defesa-chave em um processo conhecido como resposta ao choque térmico ou ao estresse, que as caracterizam como proteína citoprotetora. Estudos indicam a ocorrência de HSP70 extracelular (eHSP70) na circulação por até 24 h após desafios como o exercício físico, cuja liberação dá-se por tecidos do território hepatoesplâncnico, em uma resposta mediada por receptores α-adrenérgicos. Esta liberação de HSP70 para o plasma é atenuada pela ingestão de glicose. Estas evidências levaram-nos a supor que a liberação de eHSP70 em resposta ao estresse possa ter um papel fisiológico na regulação da glicemia, a qual é afetada por estímulo simpático. Neste trabalho, os resultados dos experimentos in silico indicaram a possibilidade de ancoragem e interação estável entre a HSP70 e a molécula de insulina. Ensaios de imunoprecipitação de insulina com amostras de plasma de animais submetidos ao tratamento de insulina Regular e Detemir revelaram HSP70 coimunoprecipitada especialmente em situação de jejum severo. Parte destas amostras foi submetida à quantificação de glicemia, insulinemia e HSP72 circulante, cujos resultados evidenciam elevada concentração desta proteína de choque térmico por ocasião de hipoglicemia induzida por insulina. Parte dos estudos in vivo deste trabalho foram desenvolvidos com ratos submetidos ao choque térmico agudo (uma sessão de 15 minutos) com hipertermia induzida (41,5 °C) ou com injeção de HSP70 (HSPA1A) exógena, com grupos experimentais organizados em grupos Controle (C) e Choque Térmico (HS) e, em tempos experimentais: imediatamente (tempo zero), 6, 12 e 24 h pós-choque. Foi observada a ocorrência das formas constitutiva e induzível de eHSP70 no plasma de animais submetidos ao choque térmico com valor maior nos períodos de 12 e 24 h pós-choque. Nossos estudos mostram que, in vivo, a eHSP70 plasmática produz alteração na tolerância à glicose, com maior hiperglicemia, quando o teste é realizado 12 h após o choque térmico. Este efeito foi bloqueado pela administração (i.p.) de anticorpo anti-HSP70 e se mostrou independente da síntese de novo de HSP70. Ainda, a presença de eHSP70 plasmática (induzida por choque térmico ou administrada via endovenosa) causa menor captação de glicose pelo músculo esquelético. Ensaios com músculo isolado indicam que o efeito inibidor da eHSP70 sobre a captação de glicose é dependente de insulina. Apesar das evidências de que a ligação HSP70-insulina no plasma tenha implicação sobre a oferta de glicose, não se pode descartar também a possibilidade de que as ações da eHSP70 estejam ocorrendo pela sua ligação a receptores específicos, e/ou de que sejam parte de uma resposta ao estresse na qual estejam implicados os hormônios contrarregulatórios. Em suma, os resultados indicam que a eHSP70 plasmática é capaz de se ligar- à insulina, provocar tolerância alterada à glicose e diminuir a captação de glicose pelo músculo esquelético, aumentando a disponibilidade de glicose circulante. / Metabolically stressful situations trigger the expression and release of the 70 kDa (HSP70) as an essential protective response, in a process known as heat shock (HS) response or stress response. HSP70 is characterized as cytoprotector entities. Previous studies indicate the occurrence of extracellular HSP70 (eHSP70) in the circulation up to 24 h after stressful challenges, such as physical exercise, and that such eHSP70 liberation comes from hepatosplancnic tissues, in an 1-adrenergic dependent response, which is attenuated by glucose ingestion. The above findings led us to suppose that stress-elicited eHSP70 release could play a physiological role on glycemic control, which are affected by sympathetic stimuli. In this work, in silico experiments indicated the possibility of docking and stable interaction between HSP70 and the insulin molecule. Immunoprecipitation of plasma samples revealed that HSP70 co-immunoprecipitates with insulin, especially under severe fast. Part of these samples was subjected to quantification of glucose, insulin and circulating HSP72, whose results show high concentration of heat shock protein during severe hypoglycemia induced by insulin. Part of the in vivo studies from this work were also carried out in healthy rats submitted to an acute (15 min) HS (41.5 °C) session or in HSP70 (HSPA1A)-injected rats, assigned into control (C) and HS groups which were observed immediately and after 6, 12 and 24 h post-shock. Both the constitutive (predominantly) and the inducible forms of eHSP70 were observed in the plasma of heat shocked animals, being the times 12 and 24 h those in which the highest concentrations were noted. Our studies suggest that in vivo produces eHSP70 change in plasma glucose tolerance, greater hyperglycemia when glucose tolerance test is performed 12 h after heat shock, and this effect was abrogated by anti-HSP70 antibody administration (i.p.) and independent of de novo synthesis of HSP70. Moreover, the presence of eHSP70 (HS-induced or injected) in the plasma or in soleus muscle incubations elicits lower glucose uptake from the skeletal muscle. Isolated muscle studies indicate that eHSP70 inhibiting effect over glucose uptake is insulin-dependent. However, although evidence suggests a role for HSP70 binding to insulin over glucose offering, it cannot be discarded the possibility that eHSP70 actions are due to their binding to specific HSP70 membrane receptors within the muscle cell, and/or that are part of a stress response in which the counter-regulatory hormone are involved. In short, the results indicate that eHSP70 plasma is able to bind to insulin, causing impaired glucose tolerance and decrease glucose uptake by skeletal muscle, increasing blood glucose availability.
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A interação diferencial da proteína de choque térmico de 70kDa com o receptor dos produtos finais de glicação avançada e toll-like 4: uma relação com suas diferentes conformações e com o estado redox

Grunwald, Marcelo Sartori January 2017 (has links)
A expressão da HSP70 intracelular está associada a efeitos citoprotetores contra uma variada gama de estímulos estressores e situações onde é comum que proteínas sofram ação de agentes oxidantes. A HSP70 foi recentemente detectada no meio extracelular, e sua presença tem sido associada a situações patológicas, nas quais ela exerce efeitos modulatórios sobre células do sistema imunológico. Para investigar a possível associação entre HSP70 oxidada e efeitos citoprotetores ou morte celular, macrófagos da linhagem RAW 264.7 foram incubados com HSP70 e HSP70 oxidada. Observamos que a oxidação da HSP70 alterou a estrutura da proteína; e que os macrófagos tratados com HSP70 oxidada apresentaram menor proliferação, maior produção de espécies reativas de oxigênio, menor atividade fagocítica e menor liberação de TNF-α. Estes resultados indicam que a oxidação da HSP70 extracelular modifica suas propriedades sinalizadoras, causando alterações na modulação das funções e da viabilidade dos macrófagos. Uma vez que estes resultados não concordam com as vias de sinalização ativadas classicamente por HSP70, via receptor TLR4, observamos uma nova interação com o receptor dos produtos finais de glicação avançada em um modelo de cultura de células A549 através de sondas fluorescentes. A quantificação do experimento mostrou um maior número de interações quando as células são tratadas com HSP70 na sua conformação ligada à ATP em comparação com o tratamento com HSP70 na sua conformação ligada à ADP; e, através de sucessivos experimentos de docking molecular propusemos um modelo putativo para a interação. Além disso, mostramos que na conformação ligada à ADP, a HSP70 interage preferencialmente com TLR4, de forma similar ao peptídeo MD-2, necessário para o reconhecimento de LPS, sugerindo que a chaperona atue como uma molécula acessória ou como citocina, dependendo do receptor e da situação patológica ou fisiológica. / Expression of intracellular HSP70 is associated to cytoprotective effects against a wide range extent of stressful stimuli and conditions where is common to proteins to suffer the action of oxidative agents. HSP70 was recently detected in the extracellular medium and its presence in serum is commonly associated with pathological situations, where it exerts modulatory effects on cells of the immune system. To investigate the possible association between oxidized HSP70 and cytoprotection or cell death, we incubated RAW 264.7 macrophages with oxidized HSP70. We observed that the Oxidation of HSP70 altered its protein structure; and that macrophages treated with oxidized HSP70 presented lower proliferation, higher reactive oxygen species production, lower phagocytic activity and TNF-α release. These results indicate that oxidation of extracellular HSP70 modify its signaling properties, causing alterations on its modulatory effects on macrophage function and viability. As these results do not concur with the signaling pathways classically activated by HSP70, via TLR4, we observed a new interaction with the receptor for advanced glycation end products through fluorescent probes in a A549 cell culture model. Quantification of the experiment showed a higher number of interactions when cells are treated with HSP70 bound to ATP when compared to the treatment with HSP70 in the conformation ADP-bound; and, by successive molecular docking experiments, we proposed a putative model for such interaction. Moreover, we showed that on its ADP-bound conformation, HSP70 binds preferentially to TLR4, in a similar way as the peptide MD-2, necessary for the recognizing of LPS, suggesting that the chaperone could act as an accessory molecule or as a cytokine, depending on the receptor and physiological or pathological situation.

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