Na patogênese do diabete melito tipo 1 (DM1) vários genes e fatores ambientais, como as infecções virais, interagem para iniciar um ataque autoimune contra as células beta pancreáticas. Durante a fase inicial desse processo, as células beta desempenham um papel importante através da promoção de um “diálogo” com o sistema imune. Recentemente, o uso de técnicas de genotipagem em larga escala proporcionou um aumento significativo no número de genes conhecidos potencialmente associados ao desenvolvimento do DM1. Para compreender como esses novos genes candidatos modificam as respostas das células beta pancreáticas a mediadores inflamatórios e aos vírus, nós analisamos os dados de estudos prévios de array e um banco de dados online (www.t1dbase.org) para identificar os genes expressos nas células beta e modificados por citocinas ou pelo subproduto da replicação viral, RNA de fita dupla (RNAfd). Dois genes foram selecionados para serem estudados nesta tese, PTPN2 e MDA5. PTPN2 é uma proteína tirosina fosfatase que tem entre os seus alvos o STAT1, um fator de transcrição chave no processo de morte das células beta. Inicialmente, confirmamos a presença de PTPN2 pela quantificação do seu RNAm e produto protéico em uma linhagem de células beta (INS-1E), células beta primárias de rato purificadas por FACS e ilhotas humanas. Tratamento com citocinas ou RNAfd intracelular significativamente aumentou a sua expressão. O knockdown específico deste gene pela técnica de RNA de interferência aumentou significativamente a apoptose das células beta expostas a uma combinação de citocinas (interleucina-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) ou RNAfd intracelular, e converteu IFN-" isoladamente em um estímulo pró-apoptótico. O silenciamento do PTPN2 amplificou a fosforilação do STAT1. O duplo knockdown, PTPN2 + STAT1, protegeu as células beta contra a apoptose induzida por citocinas, sugerindo que PTPN2 age como um regulador negativo dos efeitos pró-apoptóticos do STAT1. Contudo, o silenciamento do PTPN2 não produziu nenhuma alteração maior na expressão de citocinas e quimiocinas. O segundo gene candidato, MDA5, é uma helicase associada com o reconhecimento de ácidos nucléicos virais intracelulares. A principal função do MDA5 é a detecção de infecções virais; sendo assim, esse gene foi avaliado apenas no contexto do mimético viral RNAfd. A transfecção de células INS-1E e células beta primárias de rato purificadas por FACS com RNAfd induziu um aumento significativo no RNAm codificando MDA5. O silenciamento do MDA5 e do RIG-I (outra helicase envolvida no reconhecimento do RNAfd intracelular) não modificou a frequência da apoptose induziu por RNAfd. Por outro lado, o knockdown do MDA5, mas não do RIG-I, significativamente reduziu a expressão de várias citocinas/quimiocinas produzidas pelas células beta expostas ao RNAfd intracelular. Concluindo, os dados apresentados sugerem que esses dois genes candidatos, através de suas funções nas células beta, podem ter importantes papéis no desenvolvimento do DM1. PTPN2 aparentemente previne a apoptose das células beta controlando a ativação do STAT1, enquanto MDA5 pode regular o ataque imune local através da diminuição no recrutamento e ativação das células do sistema imune. / In type 1 diabetes (T1D) several genes and environmental factors, such as viral infections, interact to trigger a chronic autoimmune assault against the insulin-producing pancreatic beta cells. During this process beta cells have an important role in maintenance/amplification of this autoimmune response via a cross-talk with the immune system. In recent years the development of high-throughput techniques for searching new genetic variants significantly increased the number of known genes potentially contributing for T1D. To clarify how these new candidate genes modify pancreatic beta responses to proinflammatory mediators and viruses, we used data from our previous array studies and an online beta cell database (www.t1dbase.org) to select candidate genes that are expressed in beta cells and modified by cytokines or the viral by-product double-stranded RNA (dsRNA). Two genes were identified, PTPN2 and MDA5, and further studied in this thesis. PTPN2 is a protein tyrosine phosphatase with several targets including STAT1, a key transcription factor involved in beta cell death. We confirmed at mRNA and protein levels the expression of PTPN2 in a beta cell linage (INS-1E), primary FACS-purified rat beta cells and human islets. Exposure to cytokines or to intracellular dsRNA increased PTPN2 expression. Knockdown of PTPN2, by using specific small interference (si)RNAs, exacerbated beta cell apoptosis after treatment with a combination of cytokines (interleukin-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) or intracellular dsRNA, and converted IFN-" alone in a pro-apoptotic stimulus. Importantly, PTPN2 silencing amplified STAT1 phosphorylation. The double knockdown of PTPN2 and STAT1 protected beta cells against cytokine-induced apoptosis, suggesting that PTPN2 acts as a negative regulator of the pro-apoptotic transcription factor STAT1. Knocking-down PTPN2, however, did not affect to any major extent the expression of cytokines and chemokines. The second candidate gene, MDA5, is an helicase involved in recognition of intracellular viral nucleic acids. Since MDA5 works as a receptor for detection of viral infection, this gene was only evaluated in the context of the viral mimetic dsRNA. Transfection of INS-1E cells and FACSpurified rat beta cells with dsRNA significantly upregulated the mRNA expression of MDA5. The silencing of MDA5 and RIG-I (another helicase involved in recognition of intracellular dsRNA) did not modify dsRNA-induced apoptosis. On the other hand, the knockdown of MDA5, but not of RIG-I, decreased the expression of several cytokines/chemokines in beta cells exposed to intracellular dsRNA. In conclusion, our data suggest that these two candidate genes may have important roles in the development of T1D via their actions at the beta cell level. PTPN2 seems to prevent beta cells apoptosis by controlling STAT1 activation, while MDA5 might regulate the local autoimmune assault via decreasing recruitment and activation of immune cells.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-17T18:21:20Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2822554 bytes, checksum: 7bef13d6e29446a21866e18f47787668 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-17T18:21:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2822554 bytes, checksum: 7bef13d6e29446a21866e18f47787668 (MD5) Previous issue date: 2005-02-23 / A proteína BiP ("binding protein") de plantas tem sido descrita como um importante mediador de translocação, dobramento e montagem de proteínas recém-sintetizadas no lúmem do retículo endoplasmático, exibindo uma forte indução em resposta a uma variedade de estresses bióticos e abióticos. Apesar de sua relevância funcional, muito pouco se sabe com relação aos mecanismos de regulação da expressão dos genes BiP de plantas e da estrutura de seus promotores. Nesta investigação, dois promotores de BiP de soja, designados gsBiP6 e gsBiP9, bem como diferentes extensões de suas extremidades 5' foram fusionados ao gene repórter beta-glucuronidase (GUS) e introduzidas em Nicotiana tabacum via transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. Os promotores de gsBiP6 e gsBiP9 possuem cis-elementos gerais, característicos de promotores de genes de plantas, como as seqüências de transcrição CAAT e TATA, e cis-elementos que respondem a estresses do retículo endoplasmático (ERSE), além de seqüências relacionadas com o G-box. Ensaios de atividade de GUS em discos foliares transformados com os genes quiméricos BiP6-GUS e BiP9-GUS demonstraram que o promotor de gsBiP6 é induzido por uma variedade de estresses, enquanto gsBiP9 é induzido apenas por tunicamicina, um potente ativador da via de resposta a proteínas mal-dobradas (UPR). Além disso, análises histoquímicas de plantas transformadas com as construções -358pbip6-gus (BiP6) e -2200pbip9-gus (BiP9) revelaram que os promotores de BiP produziram um padrão intenso e uniforme de expressão de GUS em folhas, caules, raízes e meristemas apicais. Este padrão de distribuição espacial da atividade de GUS está correlacionado com uma expressão desses genes em tecidos que apresentam alta atividade celular secretória e alta proporção de células em um processo ativo de divisão celular. Análises de deleções do promotor de gsBiP9 em plantas transformadas identificaram dois domínios regulatórios cis-atuantes, denominados CRD-1 (-1090 a -670) e CRD-2 (-670 a +1), que são importantes para regulação espacial dos promotores de BiP em condições normais de desenvolvimento. A região de CRD-1 é caracterizada pela predominância quase absoluta de adenina e timina exibindo uma alta atividade do gene repórter GUS. Este domínio funcional possui uma atividade similar à de “enhancer”, já que é capaz de restaurar altos níveis de expressão quando fusionado diretamente à extremidade 5’ do promotor de BiP9. De fato, a atividade do gene repórter -glucuronidase (GUS) nas plantas contendo esse domínio regulatório cis-atuante foi praticamente idêntica àquela exibida pelo promotor inteiro. Além disso, a análise histoquímica e fluorimétrica de plantas contendo tais seqüências mostraram um aumento significativo na atividade do gene repórter GUS. A região de CDR-2 é caracterizada por conter elementos regulatórios positivos, que coordenam a expressão tecido-específica do promotor de gsBiP9, sendo capaz de restaurar em parte, os níveis de expressão basal do gene repórter GUS, uma vez que se detectou atividade do promotor em raízes e caule, entretanto, os níveis de expressão em folhas, principalmente na região dos feixes vasculares, não foram suficientemente altos e nem tão pouco de forma generalizada como visto nas construções contendo o promotor completo de BiP, sendo necessário seqüências adicionais delimitadas até a posição -1090 para uma alta atividade. Estes resultados sugerem que o controle da expressão dos genes BiP de plantas envolve múltiplos e complexos mecanismos e depende de uma complexa integração de múltiplos cis-elementos regulatórios no promotor. / Plant BiP (binding protein) has been described as an important mediator of translocation, folding and assembly of nascent secretory proteins in the endoplasmic reticulum lumen and it responds to a variety of biotic and abiotic stresses. Despite its functional relevance, little is known about the regulation mechanisms of plant BiP gene expression and the structure of their promoters. Here, we have fused two BiP promoters, designated gsBiP6 and gsBiP9, as well as different extensions of their 5'-flanking sequences to beta-glucuronidase (GUS) reporter gene and introduced into Nicotiana tabacum by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. The gsBiP6 and gsBiP9 promoters possess cis-regulatory elements of most plant promoters, such as CAAT e TATA boxes, in addition to potential regulatory cis-elements, such as endoplasmic reticulum stress elements (ERSE) and G-box-related sequences. GUS activity assays from leaf discs expressing BiP6- GUS e BiP9-GUS demonstrated that gsBiP6 promoter is induced by a variety of stress conditions, whereas the induction of gsBiP9 is restricted to tunicamycin treatment, a potent activator of the unfolded protein response (UPR) pathway. Furthermore, histochemical analysis of transgenic lines harbouring -358pbip6-gus (BiP6) and -2200pbip9-gus (BiP9) revealed that BiP promoters drove an intense and uniform pattern of GUS expression in leaves and stems, with the expression of BiP genes in tissues with high secretory activity and in regions of intense cell division. Promoter deletion analyses allowed to identify two cis-regulatory functional domains, designated CRD-1 (-1090 to -670) and CRD-2 (-670 to +1), that are important for the spatially-regulated activation of BiP expression under normal plant development. CRD-1 corresponds to an AT-rich enhancer-like region, capable of promoting a significant increase in GUS activity in all analysed tissues. CDR-2 is able to maintain a basal expression of the reporter gene in root, stem and leaves and, most likely, it contains all the required elements of a eukaryotic promoter. In spite of that, the gene reporter expression levels driven by CRD-2 domain were not sufficiently high in these organs, and GUS activity were not detected in apical meristems. In fact, the BiP promoter activity in meristematic tissues requires the presence of a second activating domain CRD-1 (-1090 to -670), that corresponds to an AT-rich enhancer-like region, capable of promoting a significant increase in GUS activity in all analysed tissues. These results suggest that the tissue-specific control of BiP gene expression requires a complex integration of multiple cis- acting regulatory elements on the promoter. / Dissertação importada do Alexandria

Na patogênese do diabete melito tipo 1 (DM1) vários genes e fatores ambientais, como as infecções virais, interagem para iniciar um ataque autoimune contra as células beta pancreáticas. Durante a fase inicial desse processo, as células beta desempenham um papel importante através da promoção de um “diálogo” com o sistema imune. Recentemente, o uso de técnicas de genotipagem em larga escala proporcionou um aumento significativo no número de genes conhecidos potencialmente associados ao desenvolvimento do DM1. Para compreender como esses novos genes candidatos modificam as respostas das células beta pancreáticas a mediadores inflamatórios e aos vírus, nós analisamos os dados de estudos prévios de array e um banco de dados online (www.t1dbase.org) para identificar os genes expressos nas células beta e modificados por citocinas ou pelo subproduto da replicação viral, RNA de fita dupla (RNAfd). Dois genes foram selecionados para serem estudados nesta tese, PTPN2 e MDA5. PTPN2 é uma proteína tirosina fosfatase que tem entre os seus alvos o STAT1, um fator de transcrição chave no processo de morte das células beta. Inicialmente, confirmamos a presença de PTPN2 pela quantificação do seu RNAm e produto protéico em uma linhagem de células beta (INS-1E), células beta primárias de rato purificadas por FACS e ilhotas humanas. Tratamento com citocinas ou RNAfd intracelular significativamente aumentou a sua expressão. O knockdown específico deste gene pela técnica de RNA de interferência aumentou significativamente a apoptose das células beta expostas a uma combinação de citocinas (interleucina-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) ou RNAfd intracelular, e converteu IFN-" isoladamente em um estímulo pró-apoptótico. O silenciamento do PTPN2 amplificou a fosforilação do STAT1. O duplo knockdown, PTPN2 + STAT1, protegeu as células beta contra a apoptose induzida por citocinas, sugerindo que PTPN2 age como um regulador negativo dos efeitos pró-apoptóticos do STAT1. Contudo, o silenciamento do PTPN2 não produziu nenhuma alteração maior na expressão de citocinas e quimiocinas. O segundo gene candidato, MDA5, é uma helicase associada com o reconhecimento de ácidos nucléicos virais intracelulares. A principal função do MDA5 é a detecção de infecções virais; sendo assim, esse gene foi avaliado apenas no contexto do mimético viral RNAfd. A transfecção de células INS-1E e células beta primárias de rato purificadas por FACS com RNAfd induziu um aumento significativo no RNAm codificando MDA5. O silenciamento do MDA5 e do RIG-I (outra helicase envolvida no reconhecimento do RNAfd intracelular) não modificou a frequência da apoptose induziu por RNAfd. Por outro lado, o knockdown do MDA5, mas não do RIG-I, significativamente reduziu a expressão de várias citocinas/quimiocinas produzidas pelas células beta expostas ao RNAfd intracelular. Concluindo, os dados apresentados sugerem que esses dois genes candidatos, através de suas funções nas células beta, podem ter importantes papéis no desenvolvimento do DM1. PTPN2 aparentemente previne a apoptose das células beta controlando a ativação do STAT1, enquanto MDA5 pode regular o ataque imune local através da diminuição no recrutamento e ativação das células do sistema imune. / In type 1 diabetes (T1D) several genes and environmental factors, such as viral infections, interact to trigger a chronic autoimmune assault against the insulin-producing pancreatic beta cells. During this process beta cells have an important role in maintenance/amplification of this autoimmune response via a cross-talk with the immune system. In recent years the development of high-throughput techniques for searching new genetic variants significantly increased the number of known genes potentially contributing for T1D. To clarify how these new candidate genes modify pancreatic beta responses to proinflammatory mediators and viruses, we used data from our previous array studies and an online beta cell database (www.t1dbase.org) to select candidate genes that are expressed in beta cells and modified by cytokines or the viral by-product double-stranded RNA (dsRNA). Two genes were identified, PTPN2 and MDA5, and further studied in this thesis. PTPN2 is a protein tyrosine phosphatase with several targets including STAT1, a key transcription factor involved in beta cell death. We confirmed at mRNA and protein levels the expression of PTPN2 in a beta cell linage (INS-1E), primary FACS-purified rat beta cells and human islets. Exposure to cytokines or to intracellular dsRNA increased PTPN2 expression. Knockdown of PTPN2, by using specific small interference (si)RNAs, exacerbated beta cell apoptosis after treatment with a combination of cytokines (interleukin-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) or intracellular dsRNA, and converted IFN-" alone in a pro-apoptotic stimulus. Importantly, PTPN2 silencing amplified STAT1 phosphorylation. The double knockdown of PTPN2 and STAT1 protected beta cells against cytokine-induced apoptosis, suggesting that PTPN2 acts as a negative regulator of the pro-apoptotic transcription factor STAT1. Knocking-down PTPN2, however, did not affect to any major extent the expression of cytokines and chemokines. The second candidate gene, MDA5, is an helicase involved in recognition of intracellular viral nucleic acids. Since MDA5 works as a receptor for detection of viral infection, this gene was only evaluated in the context of the viral mimetic dsRNA. Transfection of INS-1E cells and FACSpurified rat beta cells with dsRNA significantly upregulated the mRNA expression of MDA5. The silencing of MDA5 and RIG-I (another helicase involved in recognition of intracellular dsRNA) did not modify dsRNA-induced apoptosis. On the other hand, the knockdown of MDA5, but not of RIG-I, decreased the expression of several cytokines/chemokines in beta cells exposed to intracellular dsRNA. In conclusion, our data suggest that these two candidate genes may have important roles in the development of T1D via their actions at the beta cell level. PTPN2 seems to prevent beta cells apoptosis by controlling STAT1 activation, while MDA5 might regulate the local autoimmune assault via decreasing recruitment and activation of immune cells.

A troponina C é o componente do complexo heterotrimérico troponina ao qual o Ca2+ se associa. Essa associação torna a contração muscular um processo regulado por Ca2+. Pearlstone et al. (Biochemistry 31, 6545, (1992)) utilizaram o cDNA da troponina C de músculo esquelético de galinha (sTnC) para construir um mutante onde a fenilalanina da posição 29 foi substituída por triptofano (mutante F29W). Esse mutante permitiu que a ligação de Ca2+ aos sítios regulatórios amino terminais fosse acompanhada através de técnicas fluorescentes. Entretanto, algumas propriedades da sTnC foram alteradas pela mutação (Li et al. (1995) Biochemistry 34, 8330). No presente estudo, ensaios de ligação direta de Ca2+ bem como titulações de Ca2+ seguidas por fluorescência foram usadas para melhor se entenderem os efeitos da mutação Phe→Trp na posição 29 bem como a influência de certos aminoácidos componentes do sítio de ligação de Ca2+ nas propriedades do domínio regulatório. Dois novos mutantes foram construídos nos quais os análogos do triptofano 5-hidroxitriptofano ou 7 -azatriptofano foram introduzidos na posição 29 (resultando nos mutantes F29HW e F29ZW, respectivamente). Os dados mostraram que, quando comparada com a sTnC, a afinidade por Ca2+ dos sítios amino terminais foi elevada na F29W em aproximadamente seis vezes, três vezes na F29ZW e levemente diminuída na F29HW . A curva de fluorescência associada à ligação de Ca2+ à F29ZW mostrou-se bimodal, com cada fase podendo ser relacionada à ligação de Ca2+ a cada um dos sítios regulatórios. Esta é a primeira descrição através de técnicas de fluorescência da ligação sequencial de Ca2+ aos sítios amino terminais. Para investigar a influência de cada um dos sítios amino terminais nas propriedades de ligação ao Ca2+ ou propriedades fluorescentes da sTnC, F29W, F29HW e F29ZW , construímos mutantes duplos e triplos através da substituição do aspartato da posição 30 ou 66 (ou ambos) por alanina. Essas mutações afetam respectivamente a capacidade de ligação ao Ca2+ dos sítios I e II. Os dados mostraram que: 1) nas concentrações de Ca2+ analisadas, a mutação Asp→Ala na posição 30 impede somente a ligação de Ca2+ ao sítio I, enquanto a mutação Asp → Ala na posição 66 impede a ligação de Ca2+ aos sítios I e II, e 2) a mutação Asp → Ala na posição 30 torna silenciosa a substituição da fenilalanina da posição 29 por Trp, 5-hidroxitriptofano ou 7-azatriptofano. Concluímos que o sítio I é essencialmente inativo sem a ligação prévia de Ca2+ ao sítio II e que a posição 29 influencia a afinidade ao Ca2+ do sítio I \"ajustado\". / Troponin C is the Ca2+ binding component of heterotrimeric troponin. It makes skeletal muscle contraction a Ca2+ regulated process. We have previously used the cDNA of chicken skeletal TnC (sTnC) to construct a mutant where phenylalanine at position 29 was replaced by tryptophan (F29W mutant) [Pearlstone et al. (1992) Biochemistry 31, 6545]. This mutant allowed calcium binding to the regulatory amino terminal sites to be followed through fluorescence techniques, but altered some properties of sTnC [Li et al. (1995) Biochemistry 34, 8330]. In the present study, direct calcium binding assays and fluorescence followed calcium titrations were used to better understand the effects of the Phe→Trp mutation at position 29 as well as the influence of each amino site on the calcium binding properties of the regulatory domain. Two new mutants were constructed in which the tryptophan analogs 5-hydroxytryptophan or 7-azatryptophan were introduced at position 29 (resulting in F29HW and F29ZW mutants, respectively). The data showed that when compared to sTnC, the Ca2+ affinity of amino sites was increased sixfold in F29W, nearly threefold in F29ZW and slightly decreased in F29HW. The F29ZW fluorescence followed Ca2+ titration displayed a bimodal curve that could be related to Ca2+ binding to each of the amino sites. This is the first report of fluorescence detection of the sequential Ca2+ binding to the regulatory sites. To investigate the influence of each amino site in the calcium binding or fluorescence properties of sTnC, F29W, F29HW and F29ZW, we have constructed double and triple mutants by replacing aspartate at position 30 or 66 (or both) by alanine. These mutations affect respectively the binding capacity of sites I and II. The data showed that: 1) in the calcium concentration range analyzed, the Asp→Ala mutation at position 30 impairs calcium binding to site I on1y, while Asp→Ala mutation at position 66 impairs calcium binding to both sites I and II, and 2) the Asp→Ala mutation at position 30 makes silent the replacement of Phe at position 29 by Trp, 5-hydroxytryptophan or 7-azatryptophan. We conclude that site I is essentially defunct without previous binding to site II and that position 29 influences the affinity of this adjusted site I.

A síndrome de McCune Albrigth (SMA) é uma doença genética não hereditária, com incidência estimada entre 1/100.000 e 1/1.000.000 casos/ano. A SMA caracteriza-se clinicamente pela tríade: displasia óssea fibrosa (FD), manchas cutâneas café-com-leite e hiperfunção endócrina tais como: síndrome de Cushing, pseudo-puberdade precoce, hipertiroidismo, acromegalia. O diagnóstico da SMA clássica é usualmente baseado no quadro clínico associado a dosagens hormonais e exames de imagem, principalmente cintilografia do esqueleto. No entanto, quadros atípicos e formas parciais muitas vezes dificultam o diagnóstico preciso da síndrome. O objetivo deste estudo foi padronizar dentre as técnicas de PNA (peptide nucleic acid) e PCT em Tempo Real, para a detecção de polimorfismos de base única (SNPs), a técnica mais sensível para a discriminação das mutações ativadoras da subunidade da proteína G. Para este estudo foram selecionados 32 pacientes, 1 masculino e 31 femininos, com SMA, todos em seguimento no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP. Como resultado positivo, apresentamos nesse trabalho pela primeira vez o uso do RT-PCR genotipagem na detecção das mutações ativadoras da proteína G, em DNA extraído de tecidos afetados e em leucócitos de sangue periférico, sendo a técnica considerada sensível o suficiente para discriminar de forma simples e rápida as mutações ativadoras da PGs. Sugerimos nesse estudo o uso da técnica de discriminação alélica pelo sistema Taqman. Essa técnica possibilita a detecção destas mutações gsp no sangue periférico mesmo numa baixa porcentagem, uma vez que nem sempre o tecido afetado (gônada, osso, hipófise) é disponível. / The McCune-Albright Syndrome (MAS) is a genetic disease, with incidence estimated at 1/100.000 and 1/1000000 cases per year. MAS is clinically characterized by the triad: bone fibrous dysplasia (FD) café-au-lait skin spots and endocrine hyperfunction, such as: precocious puberty (PP), Cushing's syndrome, hyperthyroidism and acromegaly. The diagnosis of MAS is originally based on clinical characteristics associated with hormonal and imaging studies. However, atypical and partial forms often hamper the accurate diagnosis of the syndrome. For this study we selected 32 patients, 1male and 31 females, all being treated in Hospital das Clínicas, School of Medicine, University of São Paulo. As a positive result, we showed for the first time the use of Real Time PCR/genotyping for the detection of activating mutations of the stimulatory G protein, using blood leucocytes DNA. This technique was sensible and can bring fast results for the patient and the physician, making the diagnosis easier. Our study proposes the use of allelic discrimination by Taqman system, which can be used as a probe that allows the identification of specific genotypes. These techniques could help detect these mutations in peripheral blood when the affected tissue is not available.

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Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-02T11:18:16Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1153894 bytes, checksum: 9901a149af4914546c5701fb68fce782 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-02T11:18:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1153894 bytes, checksum: 9901a149af4914546c5701fb68fce782 (MD5) Previous issue date: 2004-07-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Objetivou-se, neste trabalho, detectar variantes alélicas do gene da Proteína de Ligação de Ácidos Graxos - Coração para construção de mapas de restrição e estudar as associações entre as variantes detectadas e características quantitativas avaliadas em animais F2, para possíveis aplicações em programas de melhoramento genético de suínos. A Proteína de Ligação de Ácidos Graxos - Coração (H-FABP), produto do gene FABP3, é uma proteína da família das FABPs. O gene, que está localizado no cromossomo suíno seis, foi seqüenciado em animais parentais de um cruzamento F2 entre varrões da raça nativa brasileira Piau e fêmeas comerciais (Landrace x Large White x Pietrain). Os animais tiveram seu DNA extraído de células brancas do sangue e amplificado por meio da reação de polimerização em cadeia (PCR). Os primers usados na reação foram desenhados para amplificar os quatro éxons do gene. Os fragmentos amplificados foram seqüenciados em sequenciador automático ABI PRISM 310 (Applied biosystems). Os fragmentos gerados foram comparados com a seqüência do gene depositada no GenBank. Foram notadas divergências entre as seqüências geradas e as do GenBank, tanto em alguns animais Piau quanto em algumas fêmeas comerciais. Essas alterações serviram como marcas para associações dos polimorfismos desse gene, com características quantitativas. Construiu-se um mapa de restrição, permitindo a identificação de enzimas que reconhecessem as alterações nas seqüências analisadas. Neste estudo, utilizou-se a enzima de restrição Hinf I, que reconheceu o sítio polimórfico presente no primeiro fragmento amplificado, na posição 108, caracterizado pela deleção de uma base Timina (T). Foram genotipados 246 animais F2 por meio da reação de restrição. Dois genótipos foram identificados, sendo 198 animais HH e 48 animais Hh. O polimorfismo estudado apresentou efeito significativo para as características: peso aos 63 dias de idade (p=0,1528), idade ao abate (p=0,0110), comprimento de carcaça pelo método americano (p=0,1789), espessura de toucinho imediatamente após a última costela (p=0,0449), espessura de toucinho entre a última e a penúltima vértebra lombar (p=0,1199), espessura de toucinho medida na carcaça direita resfriada na região da última costela, a partir de corte transversal no carré, a 6,5cm da linha dorso-lombar (p=0,1377), comprimento do intestino (p=0,0287), peso total de copa (p=0,1623), peso da copa sem pele e sem capa de gordura (p=0,1271), peso total de carré (p=0,0442), peso de papada (p=0,0195), peso de filezinho (p=0,0867), peso de rim (p=0,0028) e pH 45 minutos após o abate (p=0,1256). Os resultados obtidos indicam que o gene da H-FABP possui potencial para aplicação em programas de seleção assistida por marcadores moleculares para características de interesse econômico na cadeia produtiva de suínos. / The objectives of this study were to identify genetic polymorphisms in the Heart Fatty Acid Binding Protein gene for construction of restriction maps and to study associations between the polymorphisms detected and quantitative traits evaluated in F2 animals, to use in genetic improvement in animal production. The Heart Fatty Acid Binding Protein (H-FABP), the product of the gene FABP3, is a protein of the family of the FABPs. This gene, that is located in the swine chromosome number six, was sequenced in parental animals of a F2 crossing between boars of the Brazilian native breed Piau and commercial sows (Landrace x Large White x Pietrain). The DNA of animals was extracted of white cells of blood and amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR). Primers used in the reaction were drawn to amplify four exons of the gene. The PCR products were sequenced in ABI PRISM 310 (Applied biosystems). The sequences were compared with the sequence of the gene deposited in the GenBank. Divergences between the generated sequences and the GenBank sequences were noticed in both genetics groups. A restriction map was constructed allowing the identification of enzymes that recognize the alterations in the analyzed sequences. In this study, was used enzyme of restriction Hinf I, that recognize the polymorphism in the position 108 in sequence I, characterized by the absence of a Thymine (T). Using the restriction reaction, 246 F2 animals were genotyped. Two genotypes were identified, 198 HH animals and 48 Hh animals. The polymorphism was significantly associated with: weight at 63 days of age (p=0.1528), slaughter age (p=0.0110), carcass length by the american carcass classification method (p=0.1789), backfat thickness after last rib (p=0.0449), backfat thickness between last 1st-2nd lumbar vertebrae (p=0.1199), backfat thickness after last rib, at 6.5 cm from the midline (p=0.1377), intestine length (p=0.0287), total boston shoulder weight (p=0.1623), skinless and fatless boston shoulder weight (p=0.1271), loin (bone- in) weight (p=0.0442), jowl weight (p=0.0195), sirloin weight (p=0.0867), kidney weight (p=0.0028) and pH evaluated at 45 minutes after slaughter (p=0.1256). These results show that H-FABP gene has potential for application in programs of marker assisted selection for quantitative traits in swine.

Resumo não disponível.

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A síndrome de McCune Albrigth (SMA) é uma doença genética não hereditária, com incidência estimada entre 1/100.000 e 1/1.000.000 casos/ano. A SMA caracteriza-se clinicamente pela tríade: displasia óssea fibrosa (FD), manchas cutâneas café-com-leite e hiperfunção endócrina tais como: síndrome de Cushing, pseudo-puberdade precoce, hipertiroidismo, acromegalia. O diagnóstico da SMA clássica é usualmente baseado no quadro clínico associado a dosagens hormonais e exames de imagem, principalmente cintilografia do esqueleto. No entanto, quadros atípicos e formas parciais muitas vezes dificultam o diagnóstico preciso da síndrome. O objetivo deste estudo foi padronizar dentre as técnicas de PNA (peptide nucleic acid) e PCT em Tempo Real, para a detecção de polimorfismos de base única (SNPs), a técnica mais sensível para a discriminação das mutações ativadoras da subunidade da proteína G. Para este estudo foram selecionados 32 pacientes, 1 masculino e 31 femininos, com SMA, todos em seguimento no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP. Como resultado positivo, apresentamos nesse trabalho pela primeira vez o uso do RT-PCR genotipagem na detecção das mutações ativadoras da proteína G, em DNA extraído de tecidos afetados e em leucócitos de sangue periférico, sendo a técnica considerada sensível o suficiente para discriminar de forma simples e rápida as mutações ativadoras da PGs. Sugerimos nesse estudo o uso da técnica de discriminação alélica pelo sistema Taqman. Essa técnica possibilita a detecção destas mutações gsp no sangue periférico mesmo numa baixa porcentagem, uma vez que nem sempre o tecido afetado (gônada, osso, hipófise) é disponível. / The McCune-Albright Syndrome (MAS) is a genetic disease, with incidence estimated at 1/100.000 and 1/1000000 cases per year. MAS is clinically characterized by the triad: bone fibrous dysplasia (FD) café-au-lait skin spots and endocrine hyperfunction, such as: precocious puberty (PP), Cushing's syndrome, hyperthyroidism and acromegaly. The diagnosis of MAS is originally based on clinical characteristics associated with hormonal and imaging studies. However, atypical and partial forms often hamper the accurate diagnosis of the syndrome. For this study we selected 32 patients, 1male and 31 females, all being treated in Hospital das Clínicas, School of Medicine, University of São Paulo. As a positive result, we showed for the first time the use of Real Time PCR/genotyping for the detection of activating mutations of the stimulatory G protein, using blood leucocytes DNA. This technique was sensible and can bring fast results for the patient and the physician, making the diagnosis easier. Our study proposes the use of allelic discrimination by Taqman system, which can be used as a probe that allows the identification of specific genotypes. These techniques could help detect these mutations in peripheral blood when the affected tissue is not available.