INTRODUÇÃO: O tratamento cirúrgico da endometriose profunda tem se mostrado benéfico para os resultados de Reprodução Assistida. O motivo que leva aos melhores resultados ainda é desconhecido, mas remete à etiologia multifatorial dessa doença. Observa-se, então, a oportunidade de investigar mecanismos moleculares que possam justificar este fato. Nesse contexto, os microRNAs podem desempenhar papel fundamental na medida em que alteram a expressão de diferentes genes por meio da inibição póstranscricional. OBJETIVO: Analisar o efeito da remoção cirúrgica das lesões de endometriose profunda na expressão dos microRNAs -21, -451 e -29c, além da expressão da proteína FKBP52. MÉTODOS: Trata-se de estudo clínico, prospectivo, longitudinal e comparativo no qual foram incluídas 26 pacientes que foram divididas em dois grupos, segundo o resultado da ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal. As pacientes que não apresentaram alterações sugestivas de endometriose compuseram o grupo controle (n = 11) e foram submetidas à coleta de amostra de endométrio. As pacientes do grupo de estudo (n = 15) foram submetidas à amostragem endometrial antes e após o tratamento cirúrgico da endometriose, além de ter sido realizada a coleta de amostra da lesão profunda durante o ato operatório. Foi realizada a extração total de RNA dessas amostras e, posteriormente, PCR em tempo real para análise de expressão dos microRNAs -21, -451 e -29c, além da proteína FKBP52. RESULTADOS: A comparação da expressão relativa dos microRNAs -21 e -451 entre as amostras, de forma geral, não mostrou diferença estatisticamente significante. A expressão relativa do microRNA-29c foi maior no endométrio de pacientes com endometriose em relação ao grupo controle e ainda maior nas lesões de endometriose profunda. Após a cirurgia, a expressão do microRNA-29c no endométrio, foi equivalente à do grupo controle. A expressão da FKBP52 foi menor no endométrio das mulheres com endometriose e nas lesões da doença em comparação ao grupo controle. Após o tratamento cirúrgico houve aumento da expressão de FKBP52 nas amostras de endométrio nas pacientes com endometriose que passou a ser semelhante à do grupo controle. CONCLUSÕES: Os resultados sugerem que a presença das lesões de endometriose pode aumentar a expressão do microRNA-29c no endométrio e, por conseguinte, diminuir a expressão de um dos seus RNA mensageiros alvos que codifica a proteína FKBP52. Após o tratamento cirúrgico, com remoção das lesões de endometriose, a expressão do microRNA-29c e da FKBP52 se assemelhou à do grupo controle / INTRODUCTION: Surgical treatment of deeply infiltrating endometriosis appears to yield benefits to the affected women and also to the assisted reproduction treatments. Although the mechanisms involved on the improvement of the outcomes are still unknown; yet, they are similar to the multifactorial origin of the endometriosis. Considering that the microRNAs can modify different genes expression, it was investigated their role concerning the molecular pathways leading to endometriosis and the clinical betterment of the assisted reproductive procedures after the surgical treatment. OBJECTIVE: The aim of this study was to evaluate the effect of surgical treatment in women with endometriosis focusing the microRNAs -21, -451 and -29c expression, as well as the protein FKBP52 expression. METHODS: This is a clinical, prospective, longitudinal and comparative study which included 26 patients that were divided into two groups according to the findings of the transvaginal ultrasound with bowel preparation. Eleven women without evidence of DIE composed the control group and were submitted to eutopic endometrium sampling. Fifiteen women presented with evidence for DIE detected by pelvic ultrasound were also submitted to eutopic endometrium sampling before and after surgical treatment. Surgical procedures revealed the presence of relevant DIE. Total RNA extraction of all samples was performed and followed by real time PCR to evaluate microRNAs -21, -451, -29c and protein FKBP52 expression. RESULTS: MicroRNAs -21 and -451 expression analysis did not show statistically significant difference among samples. Nonetheless, expression of microRNA-29c was elevated in eutopic endometrium of women suffering from DIE in comparison to the control group. After surgery, the microRNA- 29c expression in eutopic endometrium became equivalent to the control group. The expression for FKBP52 was lower in women having DIE than those without endometriosis. The surgical treatment increased the expression of the protein FKBP52 in eutopic endometrial samples, turning it similar to the control group. CONCLUSIONS: The results of this study suggest that the presence of DIE might increase the expression of microRNA-29c in eutopic endometrium and consequently decrease the expression of one of its target messenger RNA that codifies the protein FKBP52. After surgical removal of endometriosis lesions, the microRNA-29c and the FKBP52 expression returned to a level similar to the control group

Orientador: Pedro de Magalhães Padilha / Coorientador: Luís Artur Loyola Charduto / Banca: Luciana Francisco Fleury / Banca: Angélica Simone Cravo Pereira / Resumo: O presente trabalho retrata estudo metaloproteômico no tecido muscular de bovinos da raça Nelore (Bos indicus) contrastantes para a característica de maciez da carne baseado em métodos de separação de proteínas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE), identificação dos íons cálcio nos spots proteicos por fluorescência de raio-X (SR-XRF) e caracterização das proteínas por espectrometria de massas (ESI-MS). Os animais selecionados para compor o grupo M (carne macia) expressaram valores de força de cisalhamento (FC) entre 3,39 e 3,98 kg, já os animais selecionados para o grupo D (carne dura) expressaram valores de FC entre 7,11 e 7,45 kg. Foi incluído um terceiro grupo (P) de animais da raça Piemontês (Bos taurus) como modelo comparativo do grau de maciez da carne. O número médio de spots proteicos encontrados nas repetições dos géis dos grupos M, D e P foram de 186 ± 20, 146,5 ± 16,5 e 175 ± 15, respectivamente. As correlações obtidas nas repetições dos géis indicaram que os procedimentos de extração da proteína total foram eficientes e preservaram a estrutura metal-proteína. A maior detecção (56%) qualitativa de cálcio por SR-XRF nos spots proteicos de animais com carne macia é um indicativo da ocorrência da atividade proteolítica no tecido muscular durante o período post mortem. A 2D-PAGE foi eficiente no fracionamento das proteínas presentes em amostras de tecido muscular (Longissimus dorsi). As correlações obtidas nas repetições dos géis indicaram que os procedimentos de extração da proteína total foram eficientes e preservaram a estrutura metal-proteína / Abstract: The present article describes a metalloproteomics study of bovine muscle tissue with different grades of meat tenderness from animals of the Nellore breed (Bos indicus) based on protein separation by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE), the identification of calcium ions in protein spots by Synchrotron Radiation X-ray Fluorescence (SR-XRF) and the characterization of proteins by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS). The meat from the animals selected to form the Te group (tender meat) expressed shear force (SF) values ranging from 3.39 to 3.98 kg, and the meat from the animals selected for the To group (tough meat) expressed values ranging from SF 7.11 to 7.45 kg. A third group (P) of Piedmontese animals (Bos taurus) was included as a comparative model for the level of meat tenderness. The mean number of protein spots found in the gel replicates of the Te, To and P groups were 186 ± 20, 146.5 ± 16.5 and 175 ± 15, respectively. The correlations found in the gel replicates indicated that the total protein extraction procedures were efficient and preserved the metal-protein structure. The higher qualitative detection of calcium (56%) by SR-XRF in the protein spots of animals with tender meat was indicative of the occurrence of proteolytic activity in the muscle tissue during the post mortem period. The 2D-PAGE was efficient fractionation of proteins present in muscle tissue samples (Longissimus dorsi). The correlations obtained in repetitions of the gels indicated that the procedures for extraction of total protein were efficient and preserved the structure metal-protein / Mestre

INTRODUÇÃO: O tratamento cirúrgico da endometriose profunda tem se mostrado benéfico para os resultados de Reprodução Assistida. O motivo que leva aos melhores resultados ainda é desconhecido, mas remete à etiologia multifatorial dessa doença. Observa-se, então, a oportunidade de investigar mecanismos moleculares que possam justificar este fato. Nesse contexto, os microRNAs podem desempenhar papel fundamental na medida em que alteram a expressão de diferentes genes por meio da inibição póstranscricional. OBJETIVO: Analisar o efeito da remoção cirúrgica das lesões de endometriose profunda na expressão dos microRNAs -21, -451 e -29c, além da expressão da proteína FKBP52. MÉTODOS: Trata-se de estudo clínico, prospectivo, longitudinal e comparativo no qual foram incluídas 26 pacientes que foram divididas em dois grupos, segundo o resultado da ultrassonografia transvaginal com preparo intestinal. As pacientes que não apresentaram alterações sugestivas de endometriose compuseram o grupo controle (n = 11) e foram submetidas à coleta de amostra de endométrio. As pacientes do grupo de estudo (n = 15) foram submetidas à amostragem endometrial antes e após o tratamento cirúrgico da endometriose, além de ter sido realizada a coleta de amostra da lesão profunda durante o ato operatório. Foi realizada a extração total de RNA dessas amostras e, posteriormente, PCR em tempo real para análise de expressão dos microRNAs -21, -451 e -29c, além da proteína FKBP52. RESULTADOS: A comparação da expressão relativa dos microRNAs -21 e -451 entre as amostras, de forma geral, não mostrou diferença estatisticamente significante. A expressão relativa do microRNA-29c foi maior no endométrio de pacientes com endometriose em relação ao grupo controle e ainda maior nas lesões de endometriose profunda. Após a cirurgia, a expressão do microRNA-29c no endométrio, foi equivalente à do grupo controle. A expressão da FKBP52 foi menor no endométrio das mulheres com endometriose e nas lesões da doença em comparação ao grupo controle. Após o tratamento cirúrgico houve aumento da expressão de FKBP52 nas amostras de endométrio nas pacientes com endometriose que passou a ser semelhante à do grupo controle. CONCLUSÕES: Os resultados sugerem que a presença das lesões de endometriose pode aumentar a expressão do microRNA-29c no endométrio e, por conseguinte, diminuir a expressão de um dos seus RNA mensageiros alvos que codifica a proteína FKBP52. Após o tratamento cirúrgico, com remoção das lesões de endometriose, a expressão do microRNA-29c e da FKBP52 se assemelhou à do grupo controle / INTRODUCTION: Surgical treatment of deeply infiltrating endometriosis appears to yield benefits to the affected women and also to the assisted reproduction treatments. Although the mechanisms involved on the improvement of the outcomes are still unknown; yet, they are similar to the multifactorial origin of the endometriosis. Considering that the microRNAs can modify different genes expression, it was investigated their role concerning the molecular pathways leading to endometriosis and the clinical betterment of the assisted reproductive procedures after the surgical treatment. OBJECTIVE: The aim of this study was to evaluate the effect of surgical treatment in women with endometriosis focusing the microRNAs -21, -451 and -29c expression, as well as the protein FKBP52 expression. METHODS: This is a clinical, prospective, longitudinal and comparative study which included 26 patients that were divided into two groups according to the findings of the transvaginal ultrasound with bowel preparation. Eleven women without evidence of DIE composed the control group and were submitted to eutopic endometrium sampling. Fifiteen women presented with evidence for DIE detected by pelvic ultrasound were also submitted to eutopic endometrium sampling before and after surgical treatment. Surgical procedures revealed the presence of relevant DIE. Total RNA extraction of all samples was performed and followed by real time PCR to evaluate microRNAs -21, -451, -29c and protein FKBP52 expression. RESULTS: MicroRNAs -21 and -451 expression analysis did not show statistically significant difference among samples. Nonetheless, expression of microRNA-29c was elevated in eutopic endometrium of women suffering from DIE in comparison to the control group. After surgery, the microRNA- 29c expression in eutopic endometrium became equivalent to the control group. The expression for FKBP52 was lower in women having DIE than those without endometriosis. The surgical treatment increased the expression of the protein FKBP52 in eutopic endometrial samples, turning it similar to the control group. CONCLUSIONS: The results of this study suggest that the presence of DIE might increase the expression of microRNA-29c in eutopic endometrium and consequently decrease the expression of one of its target messenger RNA that codifies the protein FKBP52. After surgical removal of endometriosis lesions, the microRNA-29c and the FKBP52 expression returned to a level similar to the control group

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-13Bitstream added on 2015-05-14T16:59:00Z : No. of bitstreams: 1 000829164.pdf: 1229097 bytes, checksum: c02b3e98095839e2ebc9ba29eeeeba97 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O silenciamento por RNA é um mecanismo conservado de resposta a moléculas de RNA dupla fita (dsRNA) presente em todos eucariontes, que desempenha papéis fundamentais na regulação da expressão gênica, na resistência a vírus e no controle da transposição de elementos móveis. Sabe-se que proteínas de diferentes origens, viral ou endógena, são capazes de suprimir o silenciamento por RNA, mas o mecanismo de ação da maioria delas não é totalmente compreendido. Um desses supostos supressores endógenos é uma proteína do tipo calmodulina denominada rgs-CaM (regulator of gene silencing CaM) que foi identificada em plantas de tabaco. Calmodulinas são proteínas que desempenham papéis importantes na sinalização mediada por cálcio em células eucarióticas e regulam a atividade de inúmeras proteínas com diversas funções celulares. Recentemente, porém, foi demonstrado que a rgs-CaM está envolvida na resposta de contra-defesa da planta aos supressores virais. Deste modo, os dados disponíveis na literatura sobre a função da rgs-CaM permanecem contraditórios. Pensando nisso, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar funcionalmente a proteína rgs-CaM de tabaco. Para tal, diferentes abordagens foram utilizadas: estudo de interação com a proteína viral HC-Pro, localização subcelular desta interação, identificação de proteínas endógenas que interagem com a rgs-CaM, e análise funcional de plantas de tabaco transgênicas com superexpressão ou silenciadas para o gene que codifica a rgs-CaM. Análises estruturais da rgs-CaM expressa em Escherichia coli e analises in silico revelam uma proteína rica em hélices alfa, dotada de dois domínios globulares ligados por uma longa hélice α, e apresentando apenas 3 sítios de ligação para o íon cálcio. A presença desse íon ocasiona mudança na estrutura secundária da proteína. Deste modo, o fluxo e a ligação de Ca2+ pela rgs-CaM parece ser um ponto chave ... / RNA silencing is a conserved mechanism activated by double-stranded RNA molecules (dsRNA) that is present in eukaryotes. It plays basic roles in the regulation of gene expression and in host resistance to viruses and transposons. It is known that proteins of different origins, viral or endogenous, are able to suppress RNA silencing, but the mechanism of action of most of them are not fully understood. One of these endogenous suppressor is a protein called rgs-CaM (regulator of gene silencing CaM), which is a calmodulin-like protein (CaM) identified in tobacco plants. Calmodulins are proteins that play important roles in calcium signaling in eukaryotic cells and able to regulate the activity of numerous proteins with diverse cellular functions. Recently, however, rgs-CaM was shown to be a protein involved in the plant response to counterattack viral suppressors. Thus the data available in the literature about rgs-CaM function still contradictory. Taking these into consideration, the objective of this work was to functionally characterize the tobacco rgs-CaM. For such, different approaches were used: study of its interaction with the viral HC-Pro protein, the subcellular localization of this interaction, identification of endogenous proteins that interact with rgs-CaM and functional analysis of transgenic tobacco plants overexpressing or silenced for rgs-CaM. Structural analysis of the rgs-CaM expressed in Escherichia and in silico analysis revealed a protein rich in alpha helix, possessing two globular domains connected by a long alpha helix, and three binding sites for calcium. The presence of calcium led to a change in rgs-CaM secondary structure, suggesting that the flux and binding of Ca2+ by rgs-CaM may be a key point for its funtion during virus-plant interaction. The results of in vivo interaction employing BiFC showed no interaction between rgs-CaM and HC-Pro in the tested conditions, suggesting a possible ...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-06-14Bitstream added on 2014-06-13T20:08:43Z : No. of bitstreams: 1 000754514.pdf: 1170892 bytes, checksum: 2e07af1d94d3f5fbc4f47fea88dd613c (MD5) / O presente trabalho retrata estudo metaloproteômico no tecido muscular de bovinos da raça Nelore (Bos indicus) contrastantes para a característica de maciez da carne baseado em métodos de separação de proteínas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE), identificação dos íons cálcio nos spots proteicos por fluorescência de raio-X (SR-XRF) e caracterização das proteínas por espectrometria de massas (ESI-MS). Os animais selecionados para compor o grupo M (carne macia) expressaram valores de força de cisalhamento (FC) entre 3,39 e 3,98 kg, já os animais selecionados para o grupo D (carne dura) expressaram valores de FC entre 7,11 e 7,45 kg. Foi incluído um terceiro grupo (P) de animais da raça Piemontês (Bos taurus) como modelo comparativo do grau de maciez da carne. O número médio de spots proteicos encontrados nas repetições dos géis dos grupos M, D e P foram de 186 ± 20, 146,5 ± 16,5 e 175 ± 15, respectivamente. As correlações obtidas nas repetições dos géis indicaram que os procedimentos de extração da proteína total foram eficientes e preservaram a estrutura metal-proteína. A maior detecção (56%) qualitativa de cálcio por SR-XRF nos spots proteicos de animais com carne macia é um indicativo da ocorrência da atividade proteolítica no tecido muscular durante o período post mortem. A 2D-PAGE foi eficiente no fracionamento das proteínas presentes em amostras de tecido muscular (Longissimus dorsi). As correlações obtidas nas repetições dos géis indicaram que os procedimentos de extração da proteína total foram eficientes e preservaram a estrutura metal-proteína / The present article describes a metalloproteomics study of bovine muscle tissue with different grades of meat tenderness from animals of the Nellore breed (Bos indicus) based on protein separation by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE), the identification of calcium ions in protein spots by Synchrotron Radiation X-ray Fluorescence (SR-XRF) and the characterization of proteins by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS). The meat from the animals selected to form the Te group (tender meat) expressed shear force (SF) values ranging from 3.39 to 3.98 kg, and the meat from the animals selected for the To group (tough meat) expressed values ranging from SF 7.11 to 7.45 kg. A third group (P) of Piedmontese animals (Bos taurus) was included as a comparative model for the level of meat tenderness. The mean number of protein spots found in the gel replicates of the Te, To and P groups were 186 ± 20, 146.5 ± 16.5 and 175 ± 15, respectively. The correlations found in the gel replicates indicated that the total protein extraction procedures were efficient and preserved the metal-protein structure. The higher qualitative detection of calcium (56%) by SR-XRF in the protein spots of animals with tender meat was indicative of the occurrence of proteolytic activity in the muscle tissue during the post mortem period. The 2D-PAGE was efficient fractionation of proteins present in muscle tissue samples (Longissimus dorsi). The correlations obtained in repetitions of the gels indicated that the procedures for extraction of total protein were efficient and preserved the structure metal-protein

Orientador: Ivan de Godoy Maia / Banca: Andrea Akemi Hoshino / Banca: Marcos Antonio Machado / Banca: Marcos César Gonçalves / Banca: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Resumo: O silenciamento por RNA é um mecanismo conservado de resposta a moléculas de RNA dupla fita (dsRNA) presente em todos eucariontes, que desempenha papéis fundamentais na regulação da expressão gênica, na resistência a vírus e no controle da transposição de elementos móveis. Sabe-se que proteínas de diferentes origens, viral ou endógena, são capazes de suprimir o silenciamento por RNA, mas o mecanismo de ação da maioria delas não é totalmente compreendido. Um desses supostos supressores endógenos é uma proteína do tipo calmodulina denominada rgs-CaM (regulator of gene silencing CaM) que foi identificada em plantas de tabaco. Calmodulinas são proteínas que desempenham papéis importantes na sinalização mediada por cálcio em células eucarióticas e regulam a atividade de inúmeras proteínas com diversas funções celulares. Recentemente, porém, foi demonstrado que a rgs-CaM está envolvida na resposta de contra-defesa da planta aos supressores virais. Deste modo, os dados disponíveis na literatura sobre a função da rgs-CaM permanecem contraditórios. Pensando nisso, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar funcionalmente a proteína rgs-CaM de tabaco. Para tal, diferentes abordagens foram utilizadas: estudo de interação com a proteína viral HC-Pro, localização subcelular desta interação, identificação de proteínas endógenas que interagem com a rgs-CaM, e análise funcional de plantas de tabaco transgênicas com superexpressão ou silenciadas para o gene que codifica a rgs-CaM. Análises estruturais da rgs-CaM expressa em Escherichia coli e analises in silico revelam uma proteína rica em hélices alfa, dotada de dois domínios globulares ligados por uma longa hélice α, e apresentando apenas 3 sítios de ligação para o íon cálcio. A presença desse íon ocasiona mudança na estrutura secundária da proteína. Deste modo, o fluxo e a ligação de Ca2+ pela rgs-CaM parece ser um ponto chave ... / Abstract: RNA silencing is a conserved mechanism activated by double-stranded RNA molecules (dsRNA) that is present in eukaryotes. It plays basic roles in the regulation of gene expression and in host resistance to viruses and transposons. It is known that proteins of different origins, viral or endogenous, are able to suppress RNA silencing, but the mechanism of action of most of them are not fully understood. One of these endogenous suppressor is a protein called rgs-CaM (regulator of gene silencing CaM), which is a calmodulin-like protein (CaM) identified in tobacco plants. Calmodulins are proteins that play important roles in calcium signaling in eukaryotic cells and able to regulate the activity of numerous proteins with diverse cellular functions. Recently, however, rgs-CaM was shown to be a protein involved in the plant response to counterattack viral suppressors. Thus the data available in the literature about rgs-CaM function still contradictory. Taking these into consideration, the objective of this work was to functionally characterize the tobacco rgs-CaM. For such, different approaches were used: study of its interaction with the viral HC-Pro protein, the subcellular localization of this interaction, identification of endogenous proteins that interact with rgs-CaM and functional analysis of transgenic tobacco plants overexpressing or silenced for rgs-CaM. Structural analysis of the rgs-CaM expressed in Escherichia and in silico analysis revealed a protein rich in alpha helix, possessing two globular domains connected by a long alpha helix, and three binding sites for calcium. The presence of calcium led to a change in rgs-CaM secondary structure, suggesting that the flux and binding of Ca2+ by rgs-CaM may be a key point for its funtion during virus-plant interaction. The results of in vivo interaction employing BiFC showed no interaction between rgs-CaM and HC-Pro in the tested conditions, suggesting a possible ... / Doutor

Orientador: Marcelo Brocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T03:27:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cordeiro_TamiresFernandaVilasBoas_M.pdf: 3029203 bytes, checksum: 69ac5762ed6eaafac425a284455352cf (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Salmonella enterica é um dos patógenos de origem alimentar mais prevalente. É uma bactéria gram-negativa, pertencente à família Enterobacteriaceae, intracelular facultativa, não formadora de esporo, anaeróbia facultativa, capaz de infectar animais incluindo o homem. Geralmente é adquirida por meio de alimentos contaminados com tal micro-organismo e pode causar em humanos gastroenterite e bacteremia. O presente trabalho propõe a construção de linhagens mutantes de S. enterica Typhimurium para genes codificadores de proteínas associadas ao nucleóide (NAPs ¿ Nucleoid-Associated Proteins). Tais proteínas auxiliam no enovelamento do DNA, permitindo que o cromossomo bacteriano seja compactado, além disso também influenciam na regulação transcricional de genes, em especial daqueles que respondem a mudanças ambientais. As NAPs são numerosas e o estudo desse grupo é bastante importante, pois vários esclarecimentos ainda precisam ser feitos a respeito de grande parte dessas proteínas. Dados recentes do nosso grupo de pesquisa têm demonstrado que mutantes nulos de S. enterica Typhimurium para genes codificadores de NAPs são atenuados quanto à virulência e capazes de induzir proteção no modelo murino de infecção. Esses resultados demonstram o importante papel de tais proteínas na virulência bacteriana. Assim, o presente estudo tem como objetivo a construção de mutantes nulos para dois genes codificadores de NAPs (stpA e ybaB) em S. enterica Typhimurium e a avaliação do fenótipo desses mutantes. Não há dados na literatura sobre o papel de tais NAPs com relação à virulência bacteriana. No caso de YbaB, não existem dados na literatura sobre o papel desta NAP em enterobactérias. Foi utilizado o sistema de recombinação ? Red para obtenção dos mutantes. Para observação do fenótipo de tais linhagens, foram feitos experimentos in vitro e in vivo. Os resultados observados nos experimentos in vitro mostram fenótipos interessantes das linhagens mutantes em comparação com as respectivas linhagens selvagens. No caso da mutação ?stpA, foi observada maior sobrevivência de células com essa deleção a certas situações de estresse em comparação com a linhagem selvagem. Já para a mutação ?ybaB, nossos ensaios de motilidade sugerem que a deleção desse gene teve efeito sobre a motilidade das células mutantes. Quanto à virulência dos mutantes construídos, tais mutações não afetaram a patogenicidade de S. enterica de modo considerável. Assim, as linhagens mutantes obtidas no presente trabalho não apresentam potencial de serem aplicadas como vacinas, mas lançam perspectivas para estudos futuros a respeito do papel biológico de YbaB em S. enterica / Abstract: Salmonella enterica is one of the most prevalent foodborne pathogens. It is a gram- negative bacterium, belonging to the Enterobacteriaceae family, intracellular facultative, non-spore forming, anaerobic facultative, capable of infecting animals, including man. It¿s usually acquired through foods contaminated with such microorganism and can cause gastroenteritis and bacteremia in humans. This study proposes the construction of mutant strains of S. enterica Typhimurium for genes encoding nucleoid-associated proteins (NAPs). These proteins help on folding of DNA, allowing the bacterial chromosome to be compressed, also influencing the transcriptional regulation of genes, especially those that respond to environmental changes. The NAPs are numerous and the study of this group is very important, because several explanations still have to be made regarding most of these proteins. Recent data from our research group has shown that null mutants of S. enterica Typhimurium for genes encoding NAPs are attenuated for virulence and capable of inducing protection in a murine model of infection. These results demonstrate the important role of these proteins in bacterial virulence. Thus, the present study aims at the construction of null mutants for two genes encoding NAPs (stpA and ybaB) in S. enterica Typhimurium and at the evaluation of the phenotype of these mutants. There are no data in the literature about the role of such NAPs regarding bacterial virulence. For the YbaB, there are no data in the literature about the role of this NAP in enterobacteria. The ? Red recombination system was used to obtain the mutants. For observation of the phenotype of such strains, in vitro and in vivo experiments were performed. The results obtained in in vitro experiments showed interesting phenotypes of mutant strains compared to their wild-type strains. In the case of ?stpA mutation, increased cell survival was observed on certain stress situations compared to the wild-type strain. For the ?ybaB mutation, our studies suggest that deletion of this gene had effect on motility of mutant cells. For virulence of the constructed mutants, these mutations did not affect the pathogenicity of S. enterica considerably. Thus, the mutant strains obtained in this study have no potential to be applied as vaccines, but this work provides prospects for future studies on the biological role of YbaB in S. enterica / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:08:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 199.pdf: 2457764 bytes, checksum: f3219878be3144c523ae28e85c474b10 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Os tripanossomatídeos são caracterizados por processos moleculares diferenciados como a transcrição policistrônica e regulação pós-transcricional da expressão gênica. Em mamíferos, a tradução se inicia com a ligação do complexo eIF4F (formado pelos eIF4A, eIF4E e eIF4G) a extremidade 5' dos mRNAs, o que facilita seu reconhecimento pelo ribossomo. A atividade do eIF4F é reforçada pela proteína de ligação a cauda poli-A (PABP), na extremidade 3' dos mRNAs, que interage com o eIF4G. Dois complexos do tipo eIF4F foram identificados em tripanossomatídeos: o primeiro formado pelos EIF4G3, EIF4E4 e EIF4AI com a PABP1; e um outro baseado na interação do EIF4G4 com o EIF4E3 e o EIF4A1. Este trabalho buscou caracterizar as interações entre as subunidades destes complexos e sua associação com PABPs de Leishmania, avaliando o efeito de mutações em motivos específicos. Proteínas recombinantes foram geradas fusionadas a GST e avaliadas quanto a sua habilidade de interagir com parceiros marcados radioativamente em ensaios do tipo pull-down. Para o EIF4G3, mutações individuais em dois resíduos vizinhos (I8A e R9A), afetaram a interação com o EIF4E4 e a mutação de ambos os resíduos equivalentes do EIF4G4 (IL25-26AA) também impediu sua ligação ao EIF4E3, sugerindo um motivo comum para a ligação aos seus parceiros. As proteínas EIF4E3 e EIF4E4 foram avaliadas quanto à capacidade de interagir com a PABP2 e PABP1 respectivamente, e mutações em motivos conservados nas regiões N-terminais dos EIF4E (Boxes A, B e C) aboliram sua interação com os homólogos da PABP. Para identificar que regiões da PABP1 estão relacionadas às interações com o parceiro EIF4E4, foram obtidas proteínas PABP1 mutantes em motivos conservados e observou-se que a mutação no motivo TGM, C-terminal, aboliu sua interação com o EIF4E4. Com estas abordagens conseguiu-se avançar na definição das interações entre as referidas subunidades do eIF4F e PABP, identificando-se diferenças relevantes em relação a outros eucariotos

A troponina C é o componente do complexo heterotrimérico troponina ao qual o Ca2+ se associa. Essa associação torna a contração muscular um processo regulado por Ca2+. Pearlstone et al. (Biochemistry 31, 6545, (1992)) utilizaram o cDNA da troponina C de músculo esquelético de galinha (sTnC) para construir um mutante onde a fenilalanina da posição 29 foi substituída por triptofano (mutante F29W). Esse mutante permitiu que a ligação de Ca2+ aos sítios regulatórios amino terminais fosse acompanhada através de técnicas fluorescentes. Entretanto, algumas propriedades da sTnC foram alteradas pela mutação (Li et al. (1995) Biochemistry 34, 8330). No presente estudo, ensaios de ligação direta de Ca2+ bem como titulações de Ca2+ seguidas por fluorescência foram usadas para melhor se entenderem os efeitos da mutação Phe→Trp na posição 29 bem como a influência de certos aminoácidos componentes do sítio de ligação de Ca2+ nas propriedades do domínio regulatório. Dois novos mutantes foram construídos nos quais os análogos do triptofano 5-hidroxitriptofano ou 7 -azatriptofano foram introduzidos na posição 29 (resultando nos mutantes F29HW e F29ZW, respectivamente). Os dados mostraram que, quando comparada com a sTnC, a afinidade por Ca2+ dos sítios amino terminais foi elevada na F29W em aproximadamente seis vezes, três vezes na F29ZW e levemente diminuída na F29HW . A curva de fluorescência associada à ligação de Ca2+ à F29ZW mostrou-se bimodal, com cada fase podendo ser relacionada à ligação de Ca2+ a cada um dos sítios regulatórios. Esta é a primeira descrição através de técnicas de fluorescência da ligação sequencial de Ca2+ aos sítios amino terminais. Para investigar a influência de cada um dos sítios amino terminais nas propriedades de ligação ao Ca2+ ou propriedades fluorescentes da sTnC, F29W, F29HW e F29ZW , construímos mutantes duplos e triplos através da substituição do aspartato da posição 30 ou 66 (ou ambos) por alanina. Essas mutações afetam respectivamente a capacidade de ligação ao Ca2+ dos sítios I e II. Os dados mostraram que: 1) nas concentrações de Ca2+ analisadas, a mutação Asp→Ala na posição 30 impede somente a ligação de Ca2+ ao sítio I, enquanto a mutação Asp → Ala na posição 66 impede a ligação de Ca2+ aos sítios I e II, e 2) a mutação Asp → Ala na posição 30 torna silenciosa a substituição da fenilalanina da posição 29 por Trp, 5-hidroxitriptofano ou 7-azatriptofano. Concluímos que o sítio I é essencialmente inativo sem a ligação prévia de Ca2+ ao sítio II e que a posição 29 influencia a afinidade ao Ca2+ do sítio I \"ajustado\". / Troponin C is the Ca2+ binding component of heterotrimeric troponin. It makes skeletal muscle contraction a Ca2+ regulated process. We have previously used the cDNA of chicken skeletal TnC (sTnC) to construct a mutant where phenylalanine at position 29 was replaced by tryptophan (F29W mutant) [Pearlstone et al. (1992) Biochemistry 31, 6545]. This mutant allowed calcium binding to the regulatory amino terminal sites to be followed through fluorescence techniques, but altered some properties of sTnC [Li et al. (1995) Biochemistry 34, 8330]. In the present study, direct calcium binding assays and fluorescence followed calcium titrations were used to better understand the effects of the Phe→Trp mutation at position 29 as well as the influence of each amino site on the calcium binding properties of the regulatory domain. Two new mutants were constructed in which the tryptophan analogs 5-hydroxytryptophan or 7-azatryptophan were introduced at position 29 (resulting in F29HW and F29ZW mutants, respectively). The data showed that when compared to sTnC, the Ca2+ affinity of amino sites was increased sixfold in F29W, nearly threefold in F29ZW and slightly decreased in F29HW. The F29ZW fluorescence followed Ca2+ titration displayed a bimodal curve that could be related to Ca2+ binding to each of the amino sites. This is the first report of fluorescence detection of the sequential Ca2+ binding to the regulatory sites. To investigate the influence of each amino site in the calcium binding or fluorescence properties of sTnC, F29W, F29HW and F29ZW, we have constructed double and triple mutants by replacing aspartate at position 30 or 66 (or both) by alanine. These mutations affect respectively the binding capacity of sites I and II. The data showed that: 1) in the calcium concentration range analyzed, the Asp→Ala mutation at position 30 impairs calcium binding to site I on1y, while Asp→Ala mutation at position 66 impairs calcium binding to both sites I and II, and 2) the Asp→Ala mutation at position 30 makes silent the replacement of Phe at position 29 by Trp, 5-hydroxytryptophan or 7-azatryptophan. We conclude that site I is essentially defunct without previous binding to site II and that position 29 influences the affinity of this adjusted site I.

Na patogênese do diabete melito tipo 1 (DM1) vários genes e fatores ambientais, como as infecções virais, interagem para iniciar um ataque autoimune contra as células beta pancreáticas. Durante a fase inicial desse processo, as células beta desempenham um papel importante através da promoção de um “diálogo” com o sistema imune. Recentemente, o uso de técnicas de genotipagem em larga escala proporcionou um aumento significativo no número de genes conhecidos potencialmente associados ao desenvolvimento do DM1. Para compreender como esses novos genes candidatos modificam as respostas das células beta pancreáticas a mediadores inflamatórios e aos vírus, nós analisamos os dados de estudos prévios de array e um banco de dados online (www.t1dbase.org) para identificar os genes expressos nas células beta e modificados por citocinas ou pelo subproduto da replicação viral, RNA de fita dupla (RNAfd). Dois genes foram selecionados para serem estudados nesta tese, PTPN2 e MDA5. PTPN2 é uma proteína tirosina fosfatase que tem entre os seus alvos o STAT1, um fator de transcrição chave no processo de morte das células beta. Inicialmente, confirmamos a presença de PTPN2 pela quantificação do seu RNAm e produto protéico em uma linhagem de células beta (INS-1E), células beta primárias de rato purificadas por FACS e ilhotas humanas. Tratamento com citocinas ou RNAfd intracelular significativamente aumentou a sua expressão. O knockdown específico deste gene pela técnica de RNA de interferência aumentou significativamente a apoptose das células beta expostas a uma combinação de citocinas (interleucina-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) ou RNAfd intracelular, e converteu IFN-" isoladamente em um estímulo pró-apoptótico. O silenciamento do PTPN2 amplificou a fosforilação do STAT1. O duplo knockdown, PTPN2 + STAT1, protegeu as células beta contra a apoptose induzida por citocinas, sugerindo que PTPN2 age como um regulador negativo dos efeitos pró-apoptóticos do STAT1. Contudo, o silenciamento do PTPN2 não produziu nenhuma alteração maior na expressão de citocinas e quimiocinas. O segundo gene candidato, MDA5, é uma helicase associada com o reconhecimento de ácidos nucléicos virais intracelulares. A principal função do MDA5 é a detecção de infecções virais; sendo assim, esse gene foi avaliado apenas no contexto do mimético viral RNAfd. A transfecção de células INS-1E e células beta primárias de rato purificadas por FACS com RNAfd induziu um aumento significativo no RNAm codificando MDA5. O silenciamento do MDA5 e do RIG-I (outra helicase envolvida no reconhecimento do RNAfd intracelular) não modificou a frequência da apoptose induziu por RNAfd. Por outro lado, o knockdown do MDA5, mas não do RIG-I, significativamente reduziu a expressão de várias citocinas/quimiocinas produzidas pelas células beta expostas ao RNAfd intracelular. Concluindo, os dados apresentados sugerem que esses dois genes candidatos, através de suas funções nas células beta, podem ter importantes papéis no desenvolvimento do DM1. PTPN2 aparentemente previne a apoptose das células beta controlando a ativação do STAT1, enquanto MDA5 pode regular o ataque imune local através da diminuição no recrutamento e ativação das células do sistema imune. / In type 1 diabetes (T1D) several genes and environmental factors, such as viral infections, interact to trigger a chronic autoimmune assault against the insulin-producing pancreatic beta cells. During this process beta cells have an important role in maintenance/amplification of this autoimmune response via a cross-talk with the immune system. In recent years the development of high-throughput techniques for searching new genetic variants significantly increased the number of known genes potentially contributing for T1D. To clarify how these new candidate genes modify pancreatic beta responses to proinflammatory mediators and viruses, we used data from our previous array studies and an online beta cell database (www.t1dbase.org) to select candidate genes that are expressed in beta cells and modified by cytokines or the viral by-product double-stranded RNA (dsRNA). Two genes were identified, PTPN2 and MDA5, and further studied in this thesis. PTPN2 is a protein tyrosine phosphatase with several targets including STAT1, a key transcription factor involved in beta cell death. We confirmed at mRNA and protein levels the expression of PTPN2 in a beta cell linage (INS-1E), primary FACS-purified rat beta cells and human islets. Exposure to cytokines or to intracellular dsRNA increased PTPN2 expression. Knockdown of PTPN2, by using specific small interference (si)RNAs, exacerbated beta cell apoptosis after treatment with a combination of cytokines (interleukin-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) or intracellular dsRNA, and converted IFN-" alone in a pro-apoptotic stimulus. Importantly, PTPN2 silencing amplified STAT1 phosphorylation. The double knockdown of PTPN2 and STAT1 protected beta cells against cytokine-induced apoptosis, suggesting that PTPN2 acts as a negative regulator of the pro-apoptotic transcription factor STAT1. Knocking-down PTPN2, however, did not affect to any major extent the expression of cytokines and chemokines. The second candidate gene, MDA5, is an helicase involved in recognition of intracellular viral nucleic acids. Since MDA5 works as a receptor for detection of viral infection, this gene was only evaluated in the context of the viral mimetic dsRNA. Transfection of INS-1E cells and FACSpurified rat beta cells with dsRNA significantly upregulated the mRNA expression of MDA5. The silencing of MDA5 and RIG-I (another helicase involved in recognition of intracellular dsRNA) did not modify dsRNA-induced apoptosis. On the other hand, the knockdown of MDA5, but not of RIG-I, decreased the expression of several cytokines/chemokines in beta cells exposed to intracellular dsRNA. In conclusion, our data suggest that these two candidate genes may have important roles in the development of T1D via their actions at the beta cell level. PTPN2 seems to prevent beta cells apoptosis by controlling STAT1 activation, while MDA5 might regulate the local autoimmune assault via decreasing recruitment and activation of immune cells.