Thesis--Wisconsin. / Vita. Includes bibliographical references.

Thesis (M.S.)--University of Wisconsin--Madison, 1983. / Typescript. eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references (leaves 79-84).

Psychrotrophic bacteria, such as Pseudomonas fluorescens B52, are a major cause of milk spoilage at refrigeration temperature due to the production of lipolytic and proteolytic enzymes. Regulatory mechanisms controlling the production of lipase and protease by the B52 lipA and aprX genes were investigated. Transposon mutagenesis identified the possible involvement of a poly-A polymerase enzyme which destabilises mRNA by 3' polyadenylation. A homologue of the E. coli EnvZ/OmpR two-component sensor/regulator system was identified by transposon mutagenesis and shown to repress lipase and protease production. This system responds to Na+ and K+ concentration in E. coli and these ions were also shown to repress lipase and protease expression in B52, however the EnvZ/OmpR system is not solely responsible for this. Assays of translational lacZ fusions with aprX and lipA were used to speculate on the mechanism by which Na+ and EnvZ/OmpR repress the aprX-lipA operon. A membrane-bound sensor, MspA, which regulates protease production in P. fluorescens LS107d<SUB>2</SUB>, was shown to exist in B52 but mutagenesis of the B52 mspA gene had no effect on lipase and protease expression. A homologue of the P. fluorescens CHA0 rsmA gene, encoding an RNA-binding translation repressor, was found in B52. Although aprX and possibly lipA contain consensus sequences for RsmA, mutagenesis of rsmA had no significant effect on lipase and protease expression. Repression of lipase and protease expression by Na+ was increased by expression of the P. fluorescens M114 pbrA sigma-factor gene in B52.

This study examined the efficacy of potassium lactate and lactic acid to control Campylobacter sp. and psychrotrophic bacteria on chicken. The objectives of the two studies conducted were to determine the optimal combination of potassium lactate and lactic acid to inhibit Campylobacter sp. in a challenge study and to inhibit naturally occurring Campylobacter sp. and psychrotrophic bacteria in a shelf life study. Boneless, skinless chicken breasts were injected with three levels of potassium lactate (0,1.5,2%), in conjunction with four levels of lactic acid. Lactic acid was injected (0, 0.1, 0.2, 0.3%) as well as applied directly to the surface (0.1% of weight of chicken breast). The chicken breasts were surface inoculated with a mixture of Campylobacter sp. and sampled over a period of 28 days at 11oC. The greatest inhibition was found using 2% potassium lactate in conjunction with any level of lactic acid (injected) or 0.1% lactic acid (surface application). Results of this study indicate that potassium lactate and lactic acid can be used to control the growth and/or survival of Campylobacter sp. on boneless chicken breasts. The second study eliminated the 1.5% potassium lactate and 0.2% and 0.3% lactic acid treatments and chicken breasts were not inoculated with Campylobacter sp.. This 4oC shelf life study occurred over 32 days, testing for Campylobacter species, psychrotrophic bacteria, as well as testing for sensory perceptions of color and odor changes in the chicken. The most effective treatment was the 2% potassium lactate-0.1% lactic acid surface treatment, demonstrating the most inhibition against both target populations. This treatment also had the greatest impact upon the odor of the chicken breasts. This treatment had the greatest difference from control samples, which was achieved by the inhibition of spoilage organisms on the chicken breasts. / Master of Science

Este estudo objetivou analisar o potencial de deterioração da microbiota psicrotrófica presente em presunto cozido fatiado comercializado entre Maio e Junho de 2015 e Fevereiro e Março de 2016 no mercado público da cidade de Porto Alegre/RS e avaliar a influência de fatores ambientais na qualidade microbiológica do mesmo. Os presuntos foram coletados em 4 bancas desse local e foram realizadas contagens de bactérias psicrotróficas de 8 amostras e pesquisa de Listeria monocytogenes. Selecionaram-se 134 colônias de psicrotróficos isolados de presunto fatiado, 71 deles apresentaram atividade proteolítica, 58 atividade lipolítica e 12 apresentaram produção de exopolissacarídeo. Selecionaram-se 2 bactérias com a presença dessas atividades para identificação molecular, as quais foram identificadas como Kluyvera sp. e Carnobacterium sp. Além delas, mais 2 Listeria monocytogenes isoladas nesse trabalho foram submetidas ao teste de produção de biofilme, resultando como fracas formadoras e também ao teste de aderência em aço inoxidável, todas apresentando capacidade de adesão. A pesquisa de Listeria monocytogenes nos presuntos fatiados mostrou 100% de presença, sendo que 50% foram identificadas como L. monocytogenes, as quais pertenceram aos sorotipos 1/2a (1), 1/2b (2), 1/2c (2). Realizou-se análise de presunto cozido inteiro, em sua embalagem original, sendo que não foram encontrados micro-organismos Tratou-se o presunto fatiado com extrato de hibisco a 40% e pediocina a 0,5% e 1,0% e realizou-se contagem de mesófilos, psicrotróficos, Listeria spp., S. aureus e E.coli. O extrato de hibisco reduziu a carga desses micro-organismos. Pediocina 0,5% e 1% apresentaram pouca ação frente ao controle de mesófilos, psicrotróficos e E. coli, mas mantiveram a carga de S. aureus controlada e foram eficazes contra Listeria spp. Foram realizadas também contagens para Listeria monocytogenes, E. coli, S. aureus, mesófilos e psicrotróficos em suabes oriundos de fatiador de alimentos, superfície de contato e utensílio utilizados nas bancas do mercado público. Em conclusão grande parte dos psicrotróficos apresentou atividade proteolítica e lipolítica, as quais alteram organolepticamente o alimento. Alguns apresentaram produção de biofilme e capacidade de aderência, fato indesejado, pois sua remoção é mais difícil no ambiente industrial, com isso nota-se que a legislação brasileira apresenta carência na contagem de psicrotróficos em produtos cárneos. / This study aimed to evaluate the microbiota present in sliced cooked ham sold in the public market in Porto Alegre/RS and evaluate the ability of compounds with antimicrobial activity of hibiscus extract and pediocin to control the microbiota found. Ham collected was stored refrigerated until to arrive the laboratory for analysis. Psychrotrophic bacteria counts were performed. Were selected 134 colonies of psychrotrophic microorganisms isolated for sliced ham and 71 of them showed proteolytic activity, 58 lipase activity, 12 showed production of exopolysaccharide. Two of these bacteria were selected for molecular identification which were identified as Kluyvera sp. and Carnobacterium sp. These two bacteria plus two Listeria monocytogenes isolated for sliced ham were subjected to testing of biofilm production (resulting as weak forming of biofilm) and were tested for adhesion in stainless steel and all showed this property. The research of Listeria spp. in sliced cooked ham showed 100% of presence, which 50% were identified as L. monocytogenes to serotypes 1/2a (1) 1/2b (2), 1/2c (2). Analysis was carried out of a whole piece of cooked ham in its original packaging and none microorganisms were found. The sliced ham was treated with hibiscus extract of 40% and pediocin of 0.5% and 1.0% and has been mesophilic, psychrotrophic, Listeria spp., S. aureus and E. coli counts The hibiscus extract reduced the quantity of these microorganisms. Pediocin 0.5% and 1,0% had little action against the control of mesophilic, psychrotrophic and E. coli, but in S. aureus counts were controlled bacteria charge and were effective against Listeria spp.. Also counts of Listeria monocytogenes, E. coli, S. aureus, mesophilic and psychrotrophic bacteria were performed from swabs of slicer food, contact surface and food tool (knife or spatula) used in public market stalls. In conclusion, most of the psychrotrophs presented proteolytic and lipolytic activity, which alter organoleptically the food. Some of them have presented biofilm production and adhesion capacity, undesirable fact because when the biofilm is formed is more difficult to remove it in the industrial environment. With this it is showed that the brazilian legislation presents a lack in the research of psychrotrophs in meat products kept refrigerated.

Este estudo objetivou analisar o potencial de deterioração da microbiota psicrotrófica presente em presunto cozido fatiado comercializado entre Maio e Junho de 2015 e Fevereiro e Março de 2016 no mercado público da cidade de Porto Alegre/RS e avaliar a influência de fatores ambientais na qualidade microbiológica do mesmo. Os presuntos foram coletados em 4 bancas desse local e foram realizadas contagens de bactérias psicrotróficas de 8 amostras e pesquisa de Listeria monocytogenes. Selecionaram-se 134 colônias de psicrotróficos isolados de presunto fatiado, 71 deles apresentaram atividade proteolítica, 58 atividade lipolítica e 12 apresentaram produção de exopolissacarídeo. Selecionaram-se 2 bactérias com a presença dessas atividades para identificação molecular, as quais foram identificadas como Kluyvera sp. e Carnobacterium sp. Além delas, mais 2 Listeria monocytogenes isoladas nesse trabalho foram submetidas ao teste de produção de biofilme, resultando como fracas formadoras e também ao teste de aderência em aço inoxidável, todas apresentando capacidade de adesão. A pesquisa de Listeria monocytogenes nos presuntos fatiados mostrou 100% de presença, sendo que 50% foram identificadas como L. monocytogenes, as quais pertenceram aos sorotipos 1/2a (1), 1/2b (2), 1/2c (2). Realizou-se análise de presunto cozido inteiro, em sua embalagem original, sendo que não foram encontrados micro-organismos Tratou-se o presunto fatiado com extrato de hibisco a 40% e pediocina a 0,5% e 1,0% e realizou-se contagem de mesófilos, psicrotróficos, Listeria spp., S. aureus e E.coli. O extrato de hibisco reduziu a carga desses micro-organismos. Pediocina 0,5% e 1% apresentaram pouca ação frente ao controle de mesófilos, psicrotróficos e E. coli, mas mantiveram a carga de S. aureus controlada e foram eficazes contra Listeria spp. Foram realizadas também contagens para Listeria monocytogenes, E. coli, S. aureus, mesófilos e psicrotróficos em suabes oriundos de fatiador de alimentos, superfície de contato e utensílio utilizados nas bancas do mercado público. Em conclusão grande parte dos psicrotróficos apresentou atividade proteolítica e lipolítica, as quais alteram organolepticamente o alimento. Alguns apresentaram produção de biofilme e capacidade de aderência, fato indesejado, pois sua remoção é mais difícil no ambiente industrial, com isso nota-se que a legislação brasileira apresenta carência na contagem de psicrotróficos em produtos cárneos. / This study aimed to evaluate the microbiota present in sliced cooked ham sold in the public market in Porto Alegre/RS and evaluate the ability of compounds with antimicrobial activity of hibiscus extract and pediocin to control the microbiota found. Ham collected was stored refrigerated until to arrive the laboratory for analysis. Psychrotrophic bacteria counts were performed. Were selected 134 colonies of psychrotrophic microorganisms isolated for sliced ham and 71 of them showed proteolytic activity, 58 lipase activity, 12 showed production of exopolysaccharide. Two of these bacteria were selected for molecular identification which were identified as Kluyvera sp. and Carnobacterium sp. These two bacteria plus two Listeria monocytogenes isolated for sliced ham were subjected to testing of biofilm production (resulting as weak forming of biofilm) and were tested for adhesion in stainless steel and all showed this property. The research of Listeria spp. in sliced cooked ham showed 100% of presence, which 50% were identified as L. monocytogenes to serotypes 1/2a (1) 1/2b (2), 1/2c (2). Analysis was carried out of a whole piece of cooked ham in its original packaging and none microorganisms were found. The sliced ham was treated with hibiscus extract of 40% and pediocin of 0.5% and 1.0% and has been mesophilic, psychrotrophic, Listeria spp., S. aureus and E. coli counts The hibiscus extract reduced the quantity of these microorganisms. Pediocin 0.5% and 1,0% had little action against the control of mesophilic, psychrotrophic and E. coli, but in S. aureus counts were controlled bacteria charge and were effective against Listeria spp.. Also counts of Listeria monocytogenes, E. coli, S. aureus, mesophilic and psychrotrophic bacteria were performed from swabs of slicer food, contact surface and food tool (knife or spatula) used in public market stalls. In conclusion, most of the psychrotrophs presented proteolytic and lipolytic activity, which alter organoleptically the food. Some of them have presented biofilm production and adhesion capacity, undesirable fact because when the biofilm is formed is more difficult to remove it in the industrial environment. With this it is showed that the brazilian legislation presents a lack in the research of psychrotrophs in meat products kept refrigerated.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1046907 bytes, checksum: 3e2156440d7134bf2b8e8f5a387cc61a (MD5) Previous issue date: 2011-07-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Among the psychrotrophic micro-organisms that are able to grow during refrigeration, some of them produce thermostable proteases which can cause many technological problems in the dairy industry. The food industries need to high throughput methods for the quality control raw of milk, thus, fast and sensitive methods for psychrotrophic detection, specially Pseudomonas fluorescens, predominant specie, are economically interesting to the dairy industry. In order to establish a protocol for the detection of P. fluorescens by using the polymerase chain reaction (PCR), five DNA extraction methods for milk samples, two target genes for the PCR amplification and the detection limit in raw milk and sterilized milk inoculated with P. fluorescens were evaluated. A commercial DNA extraction kit and a modified filtration method were the most appropriate for successfully bacterial DNA extraction from milk samples. These methods were selected and used for the detection of the target genes. Nevertheless, the modified filtration method was more efficient showing a lower detection limit in raw milk and sterilized milk inoculated with P. fluorescens. By means of PCR amplification of the 16S rRNA target gene, an 850 bp amplicon was observed and it was possible to detect as few as 102 UFC/ml of P. fluorescens from inoculated milk. In raw milk samples, Pseudomonas and psychrotrophic bacteria were detected at 106 UFC/mL and 107 to 109 UFC/mL, respectively. The relationship between the psychrotrophic population and the degradation of milk proteins was evaluated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The results showed the proteolysis degree in raw milk doesn t depend just on the psychrotrophic bacteria count. / Entre os micro-organismos psicrotróficos que são capazes de crescer durante a refrigeração, alguns produzem proteases termorresistentes relacionadas com problemas tecnológicos nos derivados lácteos. Visto que a demanda por métodos que permitem alta taxa de processamento exigida em indústrias de alimentos para controle da qualidade de leite cru é crescente, a avaliação de métodos mais sensíveis e mais rápidos para detecção de psicrotróficos, especialmente Pseudomonas fluorescens, espécie predominante, é de grande importância. Com a finalidade de estabelecer um protocolo para detecção de P. fluorescens pela reação em cadeia da polimerase (PCR), foram avaliados cinco métodos de extração de DNA total do leite, dois genes alvos na PCR e o limite de detecção dos métodos para análise de leite cru e leite esterilizado e inoculado com P. fluorescens. O kit comercial e o método de filtração modificado foram os métodos mais adequados para extração de DNA total de amostras de leite, por isso, foram utilizados nas análises seguintes para detecção dos genes alvos. No entanto, a utilização do método de filtração modificado para análise de leite inoculado com P. fluorescens e leite cru resultou em um menor limite de detecção quando comparado com o kit comercial. Por meio da amplificação do gene alvo rDNA 16S, foi possível observar um amplificado de 850 pb quando a população do leite inoculado com P. fluorescens era da ordem de 102 UFC/ml. Em amostras de leite cru, foi possível detectar o produto quando a contagem de Pseudomonas era da ordem de 106 UFC/ml e a população de psicrotróficos estava entre 107 e 109 UFC/ml. A análise do grau de proteólise das amostras de leite cru por eletroforese em gel de poliacrilamida demonstrou que a relação entre a população de psicrotróficos e a degradação das proteínas do leite depende de outros fatores além da contagem de psicrotróficos.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PriscillaDLS.pdf: 447651 bytes, checksum: a15751ca9e9de37e7c6b4041718d3642 (MD5) Previous issue date: 2005-12-15 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Extended storage of refrigerated milk can lead to reduced quality of raw and processed milk, which is a consequence of the growth and metabolic activities of psychrotrophic bacteria, able to grow under 7oC or lower temperatures. Although most of these microorganisms are destroyed by heat treatment, some have the potential to produce termoresistant proteolytic and lipolytic enzymes that can survive even UHT processing and reduce the processed products quality. Recently, the IN 51 determineds that milk should be refrigerated and stored at the farm what increased the importance of this group of microorganisms. In this work, psychrotrophic bacteria were isolated from 20 communitarian bulk tanks and 23 individual bulk tanks from dairy farms located at Zona da Mata region of Minas Gerais State and from southeastern Rio de Janeiro. Selected milk dilutions were plated on standard agar and after incubation for 10 days at 7oC, five colonies were isolated, firstly using nutrient agar and after using McConkey agar for 24 hours at 21oC. The isolates were identified by morphology, Gram stain method, catalase production, fermentative/oxidative metabolism and by API 20E, API 20NE, API Staph, API Coryne or API 50 CH (BioMerieux). In order to ensure reproductibility, API was repeated for 50% of the isolates. Species identification was considered when APILAB indexes reached 75% or higher. 309 strains were isolated, 250 Gram negative and 59 Gram positive. 250 Gram negative isolates were identified as: Acinetobacter spp. (39), Aeromonas spp. (07), A. Hydrophila (16), A. sobria (1), A. caviae (1), Alcaligenes feacalis (1), Burkholderia cepacia (12), Chryseomonas luteola (3), Enterobacter sp. (1), Ewingella americana(6), Hafnia alvei (7), Klebsiella sp. (1), Klebsiella oxytoca (10), Yersinia spp. (2), Methylobacterium mesophilicum (1), Moraxella spp. (4), Pantoea spp. (16), Pasteurella sp. (1), Pseudomonas spp. (10), P. fluorescens (94), P. putida (3), Serratia spp. (3), Sphigomonas paucomobilis (1). Five isolates kept unidentified. Pseudomonas was the predominant bacteria found (43%) and P. fluorescens the predominant species (37.6%), in accordance with previous reports. Qualitative analysis of proteolytic and lipolytic activity was based on halo formation using caseinate agar and tributirina agar during 72 hours at 21oC and during 10 days at 4?C, 10oC and 7?C. Among 250 Gram negative bacteria found, 104 were identified as Pseudomonas spp. and 60,57% of this group showed proteolytic and lipolytic acitivities over all four studied temperatures. 20% of Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Burkholderia, Chryseomonas, Methylobacterium, Moraxella presented only lipolytic activity. Some isolates presented enzymatic activity in one or more studied temperatures. Among Gram positive bacteria, 30.51% were proteolytic and lipolytic at 10oC, 8.47% were proteolytic at 7oC, 10oC, and 21oC, 8.47% were proteolytic at all studied temperatures (4oC, 7oC, 10oC and 21oC) and 3.38% were proteolytic only at 21oC. At 4oC, only one isolate showed proteolytic activity and six isolates were lipolytic. In relation to Gram negative microorganisms, 4% were proteolytic and lipolytic at 7oC, 10oC and 21oC, 10% were proteolytic at 10oC and 4.4% were lipolytic at 4oC, 7oC, 10oC and 21oC, while 6.4% of all isolates were proteolytic and lipolytic at 10oC and 21oC as well as lipolytic at 4oC and 7oC. These findings are in accordance with previous researches that pointed out Pseudomonas as the predominant psycrotrophic flora in stored refrigerated raw milk / O processo de conserva??o do leite cru em temperaturas de refrigera??o por per?odos prolongados pode acarretar perda de qualidade do leite e, conseq?entemente, de seus produtos derivados, fato associado ao crescimento e ? atividade enzim?tica de bact?rias psicrotr?ficas, as quais podem se desenvolver em temperaturas abaixo de 7?C. Estes microrganismos geralmente s?o eliminados durante o tratamento t?rmico do leite, por?m suas enzimas proteol?ticas e lipol?ticas s?o termoest?veis, podendo resistir at? mesmo ao tratamento UAT e permanecerem ativas causando perda de qualidade dos produtos processados. Recentemente a INSTRU??O NORMATIVA 51, estabelece que o leite deve ser refrigerado e armazenado na propriedade rural, o que aumentou a import?ncia desse grupo de bact?rias. Neste trabalho, foram isoladas e identificadas bact?rias contaminantes de leite cru refrigerado proveniente de 20 tanques comunit?rios e 23 tanques individuais de propriedades leiteiras da regi?o da Zona da Mata do Estado de Minas Gerais e sudeste do Rio de Janeiro. Dilui??es selecionadas foram plaqueadas em agar padr?o e ap?s incuba??o a 7?C/10 dias, 5 col?nias foram isoladas em placas contendo agar nutriente, com incuba??o a 21?C/24 h. Os isolados foram identificados de acordo com a morfologia, colora??o de Gram, produ??o de catalase, oxidase, metabolismo fermentativo/oxidativo, crescimento em meio Mac Conkey, rea??o de KOH 3%, hidr?lise da arginina, motilidade, produ??o de H2S e indol em meio SIM e presen?a de esporos, e pelo Sistema API 20E, API 20NE, API Staph, API Coryne ou API 50 CH (BioM?rieux). O sistema API foi repetido para 50% dos isolados para garantir a reprodutibilidade dos resultados. A identifica??o em n?vel de esp?cie foi considerada quando o programa APILAB indicou identidade &#8805; 75%. Foram obtidos 309 isolados, sendo 250 Gram negativos e 59 Gram positivos. Os 250 isolados Gram negativos obtidos foram identificados como: Acinetobacter spp. (39), Aeromonas spp. (07), A. Hydrophila (16), A. sobria (1), A. caviae (1), Alcaligenes feacalis (1), Burkholderia cepacia (12), Chryseomonas luteola (3), Enterobacter sp. (1), Ewingella americana(6), Hafnia alvei (7), Klebsiella sp. (1), Klebsiella oxytoca (10), Yersinia spp. (2), Methylobacterium mesophilicum (1), Moraxella spp. (4), Pantoea spp. (16), Pasteurella sp. (1), Pseudomonas spp. (10), P. fluorescens (94), P. putida (3), Serratia spp. (3), Sphigomonas paucomobilis (1). Cinco isolados n?o puderam ser identificados por meio dos testes utilizados. Pseudomonas foi o g?nero mais isolado (43%) sendo Pseudomonas fluorescens a esp?cie predominante (37,6%), o que corrobora dados da literatura. A produ??o de enzimas proteol?ticas e lipol?ticas foi avaliada qualitativamente pela presen?a de halo em torno da col?nia em agar caseinato e agar tributirina durante 72 horas a 21?C e 10 dias a 4?C, 7?C e 10oC. Do total de 250 Gram negativos, 104 foram identificados como Pseudomonas spp., das quais 60,57% apresentaram atividade proteol?tica e lipol?tica nas quatro temperaturas estudadas. 20% das esp?cies pertencentes aos g?neros: Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Burkholderia, Chryseomonas, Methylobacterium, Moraxella, demonstraram apenas atividade lipol?tica nas quatro condi??es estudadas. Dos 59 isolados Gram-positivas obtidos, foram identificados os seguintes g?neros: Kurthia spp (7), Levedura (1), B. stearothermophilus (1), Bacillus coagulans (1), Bacillus lentus (1), Brevibacterium spp (1), Cellum/Microbacterium (6), Staphylococcus spp (3). Trinta e sete isolados n?o puderam ser identificados por meio dos testes utilizados. Alguns isolados apresentaram atividade enzim?tica em uma ou mais das quatro temperaturas estudadas: Gram-positivos- 30,51% foram proteol?ticas a 7?, 10 e 21?C e lipol?tica a 10?C; 8,47% foram proteol?ticos a 7?, 10? e 21?C; 8,47% foram lipol?tica nas quatro temperaturas estudadas; 3,38% proteol?ticos s? a 21?C e somente um isolado tiveram atividade proteol?tica a 4?C e seis atividade lipol?tica a esta mesma temperatura. Gram negativos - 4% foram proteol?tico e lipol?tico a 7?, 10? e 21?C; 10% proteol?ticas a 10?C; 4,4% lipolitico a 4?, 7? e 21?C; 6,4% foram proteol?tico e lipol?tico a 10? e 21?C e tamb?m lipol?tico a 4? e 7?C. Estes resultados s?o consistentes com os de outras pesquisas, em que tamb?m foram constatados que esp?cies do g?nero Pseudomonas representam a microbiota psicrotr?fica deterioradora mais freq?ente do leite refrigerado

Este estudo objetivou analisar o potencial de deterioração da microbiota psicrotrófica presente em presunto cozido fatiado comercializado entre Maio e Junho de 2015 e Fevereiro e Março de 2016 no mercado público da cidade de Porto Alegre/RS e avaliar a influência de fatores ambientais na qualidade microbiológica do mesmo. Os presuntos foram coletados em 4 bancas desse local e foram realizadas contagens de bactérias psicrotróficas de 8 amostras e pesquisa de Listeria monocytogenes. Selecionaram-se 134 colônias de psicrotróficos isolados de presunto fatiado, 71 deles apresentaram atividade proteolítica, 58 atividade lipolítica e 12 apresentaram produção de exopolissacarídeo. Selecionaram-se 2 bactérias com a presença dessas atividades para identificação molecular, as quais foram identificadas como Kluyvera sp. e Carnobacterium sp. Além delas, mais 2 Listeria monocytogenes isoladas nesse trabalho foram submetidas ao teste de produção de biofilme, resultando como fracas formadoras e também ao teste de aderência em aço inoxidável, todas apresentando capacidade de adesão. A pesquisa de Listeria monocytogenes nos presuntos fatiados mostrou 100% de presença, sendo que 50% foram identificadas como L. monocytogenes, as quais pertenceram aos sorotipos 1/2a (1), 1/2b (2), 1/2c (2). Realizou-se análise de presunto cozido inteiro, em sua embalagem original, sendo que não foram encontrados micro-organismos Tratou-se o presunto fatiado com extrato de hibisco a 40% e pediocina a 0,5% e 1,0% e realizou-se contagem de mesófilos, psicrotróficos, Listeria spp., S. aureus e E.coli. O extrato de hibisco reduziu a carga desses micro-organismos. Pediocina 0,5% e 1% apresentaram pouca ação frente ao controle de mesófilos, psicrotróficos e E. coli, mas mantiveram a carga de S. aureus controlada e foram eficazes contra Listeria spp. Foram realizadas também contagens para Listeria monocytogenes, E. coli, S. aureus, mesófilos e psicrotróficos em suabes oriundos de fatiador de alimentos, superfície de contato e utensílio utilizados nas bancas do mercado público. Em conclusão grande parte dos psicrotróficos apresentou atividade proteolítica e lipolítica, as quais alteram organolepticamente o alimento. Alguns apresentaram produção de biofilme e capacidade de aderência, fato indesejado, pois sua remoção é mais difícil no ambiente industrial, com isso nota-se que a legislação brasileira apresenta carência na contagem de psicrotróficos em produtos cárneos. / This study aimed to evaluate the microbiota present in sliced cooked ham sold in the public market in Porto Alegre/RS and evaluate the ability of compounds with antimicrobial activity of hibiscus extract and pediocin to control the microbiota found. Ham collected was stored refrigerated until to arrive the laboratory for analysis. Psychrotrophic bacteria counts were performed. Were selected 134 colonies of psychrotrophic microorganisms isolated for sliced ham and 71 of them showed proteolytic activity, 58 lipase activity, 12 showed production of exopolysaccharide. Two of these bacteria were selected for molecular identification which were identified as Kluyvera sp. and Carnobacterium sp. These two bacteria plus two Listeria monocytogenes isolated for sliced ham were subjected to testing of biofilm production (resulting as weak forming of biofilm) and were tested for adhesion in stainless steel and all showed this property. The research of Listeria spp. in sliced cooked ham showed 100% of presence, which 50% were identified as L. monocytogenes to serotypes 1/2a (1) 1/2b (2), 1/2c (2). Analysis was carried out of a whole piece of cooked ham in its original packaging and none microorganisms were found. The sliced ham was treated with hibiscus extract of 40% and pediocin of 0.5% and 1.0% and has been mesophilic, psychrotrophic, Listeria spp., S. aureus and E. coli counts The hibiscus extract reduced the quantity of these microorganisms. Pediocin 0.5% and 1,0% had little action against the control of mesophilic, psychrotrophic and E. coli, but in S. aureus counts were controlled bacteria charge and were effective against Listeria spp.. Also counts of Listeria monocytogenes, E. coli, S. aureus, mesophilic and psychrotrophic bacteria were performed from swabs of slicer food, contact surface and food tool (knife or spatula) used in public market stalls. In conclusion, most of the psychrotrophs presented proteolytic and lipolytic activity, which alter organoleptically the food. Some of them have presented biofilm production and adhesion capacity, undesirable fact because when the biofilm is formed is more difficult to remove it in the industrial environment. With this it is showed that the brazilian legislation presents a lack in the research of psychrotrophs in meat products kept refrigerated.

Orientador: Pilar Rodriguez de Massaguer / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-17T01:44:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marques_AlessandraReginadaSilva_D.pdf: 2932913 bytes, checksum: a22dc65d180eab3917e06501dc994ccc (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Esta pesquisa teve por objetivos: a. enumerar os Clostridium psicrotróficos na forma vegetativa e esporulada presentes em cortes bovinos embalados a vácuo e resfriados, deteriorados e não deteriorados; b. caracterizar e identificar estes isolados bioquímica e geneticamente, comparando a precisão entre as duas metodologias; c. monitorar as possíveis fontes de Clostridium psicrotróficos junto à linha de produção em frigorífico no interior do estado de São Paulo; d. testar a habilidade dos isolados, identificados como Clostridium psicrotróficos e recuperados tanto a partir dos cortes bovinos quanto a partir de diversas etapas ao longo da linha de produção do frigorífico, em reproduzir o defeito de estufamento quando inoculados em altas populações em cortes bovinos e acondicionados em embalagens a vácuo e termoencolhimento sob condições praticadas pela indústria (6mBar/83°C-3s) ; e. avaliar se diferentes níveis de vácuo e termoencolhimento teriam efeito sobre as características do estufamento dos isolados que melhor reproduziram o defeito; f. analisar as características físicas das embalagens primárias e secundárias bem como possíveis danos após simulação de transporte para distância de 500km que pudessem favorecer a incidência de Clostridium psicrotrófico ou outras espécies contaminantes. Para as enumerações foram utilizadas 8 amostras deterioradas (6 contra-filés, 1 cupim bovino e 1 picanha bovina) e 5 não deterioradas (contra-filé), sendo analisados: exsudato (1mL), superfície (100cm2) e interior do corte cárneo (25g). As subamostras foram submetidas à enumeração de anaeróbios psicrotróficos vegetativos (Reinforced Clostridial Médium - RCA, 5% de sangue de carneiro desfibrilado estéril, 5% de glicose e 1,5% de Agar, RCM modificado), anaeróbios esporulados ativados pelo calor e pelo álcool, em Perfringens Agar Base (PAB, Oxoid, com 5% de solução de gema de ovo estéril, 15000UI polimixina/500mL e 6mg Kanamicina/500mL, PKP; 200mg cicloserina/500mL (PC)). Os 17 isolados caracterizados preliminarmente como Clostridium foram submetidos ao teste de sensibilidade ao metronidazol. Aqueles com halos de inibição = 3,5mm tiveram seu perfil fenotípico analisado mediante kit API 20A (bioMeriéux) e seu perfil genético analisado (sequênciamento do gene 16S rRNA). O isolamento no ambiente do frigorífico foi realizado a partir das fezes, couro e amostras provenientes do corredor de atordoamento e sangria, sala de desossa, esteiras de corte e embalagem, através de coleta por swabs acondicionados em caldo PYGS em anaerobiose por 4 semanas a 4 e 15°C. Após, as amostras foram plaquea das em meio RCA e SFP (Shahidi Ferguson Perfringens) por 1 mês, caracterizadas e isoladas as colônias diferenciadas e ainda submetidas a confirmação, de gênero, para Clostridium. Os 2 isolados, provenientes de cultivo a 4°C confir mados como Clostridium, foram identificados utilizando mesma metodologia descrita anteriormente para isolados provenientes do corte cárneo. O teste de habilidade de reprodução do defeito de estufamento foi realizado com 12 linhagens, isoladas na primeira etapa da pesquisa, sendo 10 provenientes de cortes cárneos (8 identificados como C.gasigenes e 2 como C.algidicarnis) e 2 isoladas da linha de produção em frigorífico (C.gasigenes). Este teste foi realizado sob condições praticadas na indústria (6mBar com termoencolhimento 83°C/3s), inoculando-se nas superfícies dos bifes ( 10x5x2cm) de contra-filé, 1mL de suspensão padronizada em 108UFC/mL, obtendo-se 106UFC/50cm2. A incubação dos cortes bovinos inoculados juntamente, com 2 controles positivos (inoculados com C.estertheticum) e 2 controles negativos (sem inoculo) foi conduzida a 2° e 15°C por 8 semanas. Os 3 isolados (2 provenien tes dos cortes cárneos ¿ C.algidicarnis e C.gasigenes e 1 proveniente do frigorífico ¿ C.gasigenes) que melhor reproduziram as características do estufamento, seguiram para testes de influência de diferentes níveis de vácuo (6 e 9mBar) e temperaturas de termoencolhimento (83, 84 e 87°C) sob o tempo para aparecimento e intensidade do defeito. Também foram avaliados os sistemas de embalagem primário e secundário a fim de detectar falhas em ambos os sistemas que pudessem favorecer a incidência de espécies de Clostridium psicrotróficas. Mediante teste de simulação de transporte (norma ASMD4169-08, para caminhões) simulou-se o efeito de um percurso de 500km sobre as embalagens primárias e secundárias. Nas carnes deterioradas foi notado esverdeamento, aumento nos valores de pH e odores putrefativos e butíricos. As enumerações de psicrotróficos anaeróbios vegetativos, nas amostras deterioradas, atingiram níveis altíssimos (1014UFC/mL de exsudato). Quanto às formas esporuladas ocorreu predominância das ativadas pelo calor (105UFC/mL), sendo também recuperadas nas amostras não deterioradas. Bacillus facultativos psicrotróficos foram a flora dominante nas amostras deterioradas e não deterioradas com 50 e 70%, respectivamente. Das 17 linhagens, provenientes dos cortes cárneos, suspeitas de serem Clostridium apenas 10 foram confirmadas, destas, apenas 4 apresentaram perfis fenotípico e genético coincidentes (C1I13ESUPPKP; C2I2EXRCM; C4I8RCMEX; C2I5EXCHPC, sendo as 3 primeiras C.gasigenes e a última C.algidicarnis). Destes 10, 8 foram identificadas como C.gasigenes e 2 como C.algidicarnis. É importante enfatizar que em apenas 3 das 8 amostras de cortes cárneos deteriorados analisados (com estufamento), foram recuperados Clostridium psicrotrófico, ou seja, nas demais amostras onde estas espécies não foram recuperadas, a microflora causadora do estufamento pode ser um grupo heterogêneo composto por Bacillus psicrotróficos facultativos, que nesta pesquisa corresponderam a 50% da contaminação para as amostras deterioradas e, muito provavelmente, bactérias ácido lácticas e enterobactérias, conforme já detectado, em pesquisa paralela utilizando as mesmas amostras. Nos ambientes do frigorífico, temperaturas de 15°C fo ram medidas em locais que deveriam estar com temperaturas entre 0-6°C ou no máximo 7°C. A partir das superfícies de contato do frigorífico, fezes e chão, foram recuperados 38 isolados. Destes, apenas 2, 1 recuperado do couro e outro do corredor de abate/esteira de corte (mesmo isolado encontrado nos dois ambientes), foram identificados como Clostridium, os demais foram caracterizados como Bacillus facultativos psicrotróficos. Estes 2 foram identificados como C.gasigenes. A ocorrência destes isolados na forma viável junto à esteira de corte representa grande risco a carne pois uma vez arrastado ao produto final será um potencial causador do defeito de estufamento. Quanto aos ensaios de reprodução do defeito de estufamento, observou-se que a temperatura de 15°C acelerou a tempo para aparecimento dos primeiros sinais de estufamento, passando de 30 dias a 2°C pa ra 4 dias a 15°C e o isolado que melhor e mais rapidamente reproduziu as características do estufamento foi o C2I5EXCHPC (C.algidicarnis), com produção de gás, proteólise e alterações de pH (de 5.5 para 7.5) após 4 dias/15°C e 30 dias/2°C. Resultados similares foram obtidos para o controle positivo (C.estertheticum). Os outros 2 isolados que também reproduziram rápida e intensamente o estufamento foram C2I8EXCHPC e LMI13CA/EC ¿ isolado a partir do corredor de abate/esteira de corte junto ao frigorífico, ambos identificados como C.gasigenes, cabendo esclarecer que o defeito, para estes dois isolados, não foi tão intenso quanto para o C2I5EXCHPC. Todos os isolados foram capazes de reproduzir o defeito de estufamento ao final de 8 semanas de incubação a 15°C, enquanto que, a 2°C, somente 5 tiveram esta capacidade. Assim, temperaturas de abuso de refrigeração (15°C) aceleram o tempo para aparecimento dos primeiros sinais de estufamento por Clostridium e a temperatura de 2°C não é capaz de impedir a ocorrência deste defeito. Amostras inoculadas com C2I5EXCHPKP (C.algidicarnis) e submetidas a termoencolhimento a 83°C e 84°C/6mBar apresentaram períodos similares para aparecimento dos primeiros sinais de deterioração (~14 dias), entretanto, aplicando termoencolhimento a 87°C, foi observado um incremento neste tempo para 4 semanas. Assim sendo, considerando-se o nível de vácuo de 6mBar (aplicado pela indústria) a deterioração somente seria retardada, mas não deixaria de existir, aplicando-se um termoencolhimento a 87°C/3s, provav elmente porque nesta condição as células mais termosensíveis são inativadas. Por outro lado, as amostras tratadas com condições similares de termoencolhimento mas com nível de vácuo de 9mBar, apresentaram decréscimo no tempo de deterioração de 14 para 4 dias quando se aplicou 83 e 84°C/3s, d emonstrando que este vácuo maior estimula espécies de Clostridium. Entretanto, nas amostras tratadas com termoencolhimento a 87°C os primeiros sinais de deterioração somente foram observados após 7 semanas a 1°C. Assim, a condição de vácuo/termoencolhimento que mais prolongou a vida de prateleira da carne, quando inoculada, foi 87°C/9mBar, mas esta condição não impediu o desenvo lvimento do C.algidicarnis e o tempo de atraso do defeito de estufamento ainda foi inferior ao prazo de vida útil do produto. As embalagens primárias e secundárias analisadas estavam de acordo com as especificações do fabricante. Quanto à simulação de transporte, após o percurso de 500km apenas 1 embalagem primária demonstrou alterações que pudessem favorecer a atividade de anaeróbios facultativos. Por esta pesquisa, observou-se coincidência entre a flora encontrada nas superfícies do frigorífico e a flora recuperada a partir das amostras deterioradas. Além disso, a condição mais severa de termoencolhimento e vácuo aplicados (87°C/3s/9mBar), somente foi capaz de retardar o tempo para aparecimento do defeito de estufamento não o impedindo. Mesmo este tempo maior ainda foi inferior ao prazo de validade do produto. Sendo assim, pode-se inferir que a prevenção do defeito de estufamento não deve residir apenas na eliminação de células vegetativas de ambientes de planta mas também na eliminação de esporos que, uma vez arrastados para a embalagem, poderão germinar tornandose potenciais causadores do defeito de estufamento, além, é claro, da manutenção de ambientes de produção e estocagem em temperaturas inferiores a 2°C e higiene adequada durante a manipulação das carcaças e retirada do couro. Em adição, ficou comprovado que o abuso de temperatura de refrigeração acelera o estufamento de embalagens no caso de espécies de Clostridium psicrotróficos estarem presentes, principalmente C.algidicarnis, e que, as condições de vácuo/termoencolhimento aplicadas atualmente pela maioria das indústrias (83°C/3s/6mBar) não se apres entam como barreira eficiente à prevenção do defeito de estufamento na carne bovina embalada a vácuo / Abstract: This research aimed at: a. to enumerate psychrotrophic clostridia vegetative and spores from spoiled and unspoiled chilled vacuum packed red meat; b. to characterize and identify the isolates biochemical and genetically, comparing precision between then; c. to determine possible preslaughter and processing sources of psychrotrophic clostridia causing spoilage of vacuum packed red meats; d. assessment of blowing ability of Clostridium isolates at industrial conditions (6mBar/83°C-3s); e. to evaluate different vacuum and heat shrinking treatments on blown characteristics of the best representative isolates; f. to analyze physical characteristics of primary and secondary packs as well as possible damages after transport simulation (500km) that could lead to psychrotrophic Clostridium and other contaminant species incidence. For enumeration 8 spoiled samples (6 strip-loin, 1 hump beef and 1 rump cap beef) and 5 unspoiled (strip-loin): drip (1mL), surface (100cm2) and deep tissue (25g), were analyzed. Sub-samples were analyzed for vegetative psychrotrophic anaerobes (Reinforced Clostridial Medium - RCA, 5% of sterile defibrinated sheep blood, 5% of glucose and 1.5% of Agar, modified RCM); sporeforming anaerobes were counted by alcohol and heat treatment on Perfringens Agar Base (PAB, Oxoid, containing 5% sterile egg-yolk solution, 15000UI polymixin/500mL e 6mg kanamycin/500mL, PKP; 200mg cycloserin/500mL (PC)). For the 17 isolates characteried as clostridia, metronidazole test was applied for genera determination of Clostridium, isolates with inhibition zones = 3.5mm were phenotypical (by API 20A ¿ bioMeriéux) and genetically (16S rRNA sequence) identified. The slaughterhouse survey was conducted from feces, leather, stunning aisle, boning room, meat cutting conveyor belt and packing conveyor belt by sterile swabs inoculated in PYGS medium, incubated anaerobically at 4 and 15°C/4 weeks. Afte r incubation, loopfuls of the enrichments were directly streaked onto the surface of RCA and SFP (Shahidi Ferguson Perfringes), incubated for a month and then the different colonies were characterized and forwarded to genera confirmation. The confirmation of blowing ability was conducted with 12 strains, isolated from first stage of this research: 10 from red meats (8 identified as C.gasigenes and 2 as C.algidicarnis) and 2 from slaughterhouse (C.gasigenes). This test was conducted under industrial practices (6mBar, 83°C/3s), inocul ating sterile strip-loin beefs surfaces (10x5x2cm) with 1mL of vegetative cells suspension (108CFU/mL), obtained 106CFU/50cm2. Inoculated samples with 2 positive controls (inoculated with C.estertheticum) and 2 negative controls (uninoculeted samples) were performed at 2 and 15°C / 8 weeks. The three best representative isolates (2 from meat samples ¿ C.algidicarnis e C.gasigenes and 1 from slaughterhouse ¿ C.gasigenes) were tested for blown characteristics conducted at different vacuum (6 and 9mBar) and heat shrinking (83, 84 and 87°C) treatments to evaluate the time to first sign of blow pack and spoilage magnitude. The primary and secondary pack systems were evaluated for failures that support the psychrotrophic Clostridium incidence. Effects of a 500km route on primary and secondary packs were measured by transport simulation test (ASMD4169-08, for trucks). Spoiled samples showed green discoloration, increase of pH values and putrefactive and butyric odors. For these samples, the psychrotrophic vegetative anaerobic counts reached very high levels (1014CFU/mL of drip). Concerning sporeforming the heat activated ones were predominant (105CFU/mL) and also were recovered for unspoiled samples. Psychrotrophic facultative Bacillus was the dominant flora in analyzed samples (50% for spoiled and 70% for unspoiled). From 17 Clostridium suspect strains only 10 were confirmed and these 4 showed phenothypical and genetical coincident profiles (C1I13ESUPPKP, C2I2EXRCM and C4I8RCMEX ¿ C.gasigenes; C2I5EXCHPC ¿ C.algidicarnis). Concerning these 10 Clostridium isolates, 8 were identified as C.gasigenes and 2 as C.algidicarnis. It is important to emphasize that only 3 spoiled samples provided psychrotrophic Clostridium isolation, others spoiled samples flora were heterogeneous group, composed by facultative psychrotrophic Bacillus, that represented 50% of isolates from spoiled samples, and, probably, lactic acid bacteria and enterobacteria, according to Chaves (2010), in parallel research using same samples. Inside the slaughterhouse, ambient temperatures of 15°C were observed for places that should be at 0-6°C or 7°C (maximum). From slaugther house ambient and contact surfaces 38 isolates were recovered but only 2, 1 from leather and 1 for stunning aisle/meat cutting conveyor belt (same isolate from both points), were identified as Clostridium, other were characterized as psychrotrophic facultative Bacillus. These 2 isolates were identified as C.gasigenes. The occurrence of viable Clostridium on meat cutting conveyor belt is a risk for meat as a focus of blown pack spoilage clostridia. For confirmation blowing ability tests, abuse temperature decrease the time to first sign of blown pack from 30 days at 2°C to 4 days at 15°C and the isolate that better reproduce (more quickly) the spoilage was C2I5EXCHPC (C.algidicarnis) showing gas production, proteolysis and pH alteration (5.5 to 7.5) after 4 days/15°C and after 30 days/2°C. Similar results we re obtained for C.estertheticum (positive control). In addition, others two isolates that also quickly reproduced the spoilage were C2I8EXCHPC and LMI13CA/EC ¿ isolated from stunning aisle/meat cutting conveyor belt slaughterhouse, both identified as C.gasigenes, however the defect was not intense than for samples inoculated with C2I5EXCHPC (C.algidicarnis). All isolates were capable to reproduce the spoilage at the end of 8 weeks at 15°C while at 2°C, only 5 iso lates reproduce the defect. So, abuse temperature (15°C) accelerate the onset of Clostridium mediate blown pack spoilage and 2°C does not control it. Samples inocu lated with C2I5EXCHPKP (C.algidicarnis) treated with heat shrink of 83 e 84°C/6mBar showed similar perio ds for initial spoilage (~14 days), but applying heat treatment at 87°C, it was observed an increase in t his period to 4 weeks. So, using vacuum at 6mBar (industrial practice) the deterioration is retarded, but does not cease to exist, applying heat shrink of 87°C/3s, probably because this condition inactivated some heat sensitive spores. On other side, samples treated with same conditions of heat shrink but applying vacuum at 9mBar showed a decrease of time to spoilage from 14 to 4 days at 83 and 84°C/3s as lower vacuum may stimulate clostridia germination. However, for samples heat shrinked at 87°C the initial spoilage was only observed after 7 weeks at 1°C. So the condition th at more extended meat shelf-life, when inoculated, was 87°C /9mBar, but this condition not prevented C.algidicarnis development and delay of blown pack was still smaller than product shelf-life. Primary and secondary packs were according to manufacture¿s specifications. Concerning transport simulation, after 500km only one primary pack showed alterations that could support facultative anaerobes activity. In this research, it was observed coincidence between slaughterhouses and spoiled samples flora. Besides, the more rigorous condition applied (87°C/3s/9mBar) was only capable to retard the blown pack not inhibit and the time to deterioration first sign was smaller than product shelf-life. In regard to this fact, the defect prevention of blown pack spoilage is associated with the elimination of vegetative and sporeformers from slaughterhouses that after germination process could induce spoilage, besides, temperature control of production lines and storage environment at = 2°C, must be apply. In addition, abuse temperature accelerate the onset of Clostridium mediate blown pack spoilage, if psychrotrophic clostridia are present, in special, C.algidicarnis, and the industry process condition (vacuum and heat shrink - 6mBar/83°C/3s) are not capable to prevent the spoilage, being necessary the application of more efficient hurdles as efficient sanitization of process line as well as reduce temperature of the refrigerate environment / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos