Os Transtornos psiquiátricos acompanham a história da humanidade. Classificados em categorias distintas podemos observar que dentre todas as patologias que constituem os transtornos mentais e de comportamento, as doenças mais prevalentes são as doenças de Ansiedade e de Transtorno Depressivo Maior (TDM). Mesmo com muitos avanços nas neurociências, assim como na terapêutica (psicofarmacologia), ainda hoje a fisiopatologia e o desenvolvimento farmacológico são áreas que necessitam intenso estudo. Avanços recentes tem sugerido que drogas capazes de modular os sistemas glutamatérgico e purinérgico possuem potencial efeito neuromodulador, sendo promissores candidatos para o desenvolvimento de novas drogas com ação ansiolítica e/ou antidepressiva. Dessa maneira, o objetivo desta tese foi investigar o potencial efeito ansiolítico da guanosina (GUO) em modelos animais preditivos para o estudo da potencial atividade ansiolítica de novos compostos, assim como seu potencial efeito antidepressivo no modelo animal de depressão da Bulbectomia Olfatória Bilateral (OBX). Inicialmente, nossos resultados demonstram que a administração de GUO foi capaz de produzir um consistente efeito ansiolítico modulando os níveis de adenosina (ADO) e glutamato cerebral. Ainda, pela primeira vez, foi observado que a GUO per se promoveu uma diminuição da liberação de glutamato em preparações de sinaptosomas de hipocampo, um efeito dependente da ativação dos receptores A1 de ADO. Após a caracterização do potencial efeito ansiolítico da GUO, nosso objetivo foi avaliar o potencial efeito antidepressivo da GUO em um modelo animal com validade de face e de constructo, como o modelo da OBX. Contudo, após revisão da literatura em estudos que utilizaram o modelo da OBX, observou-se a necessidade de uma investigação a longo prazo, das principais alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pela OBX. Nossos resultados, mostram pela primeira vez, que camundongos submetidos a OBX apresentaram simultaneamente alterações comportamentais e neuroquímicas transitórias e de longa duração. Ademais, as evidências indicam que o hipocampo possui alta susceptibilidade aos danos induzidos pela OBX, visto que uma sinaptotoxicidade transitória, acompanhada de um duradouro desequilíbrio redox e aumento da resposta inflamatória foram observados. Por fim, o tratamento crônico com GUO foi capaz de reverter a maioria das alterações identificadas previamente como duradouras nos parâmetros comportamentais e neuroquímicos no modelo da OBX. Considerando os resultados neuroquímicos obtidos pelos diferentes protocolos de tratamento realizados neste estudo, novas hipóteses de mecanismos de ação exercidos pela GUO foram apresentadas, e mecanismos já estabelecidos foram reproduzidos. Por fim, de uma maneira geral os dados apresentados nesta tese reforçam a hipótese do envolvimento do sistema purinérgico nos transtornos psiquiátricos, e sugerem que a GUO apresenta uma potencial ação terapêutica para o tratamento destas doenças, abrindo assim novas perspectivas para elucidação dos mecanismos envolvidos na fisiopatologia da ansiedade e TDM. / Psychiatric disorder had accompanied the course of human history. Mental and behavioral disorders are classified in different categories and among all different psychiatric disorders; anxiety and major depressive disorder (MDD) are the most prevalents. Despite the substantial advances in our knowledge on the neurobiological bases of both anxiety and MDD, as well as in the therapeutic area (psychopharmacology), even today, the pathophysiology of these disorders as well as pharmacological development are still under investigation. Recent advances have suggested that drugs able to modulate glutamatergic and purinergic systems present a potential neuromodulatory effect, and are promising candidates for the development of new drugs with both anxiolytic and antidepressant effects. Thus, the aim of this work was to investigate the potential guanosine (GUO) anxiolytic-like effects in predictive animal models largely used to elucidate anxiolytic properties of new compounds, as well as investigate the potential GUO antidepressant effect in Olfactory Bulbectomy (OBX) model of depression. Initially, our results demonstrate that acute GUO administration was able to induce a consistent anxiolytic-like effect, by modulating the adenosine and glutamate cerebrospinal levels. Here, for the first time, it was observed that GUO per se was able to decrease the glutamate release in hippocampal synaptosome. After characterizing the potential anxiolytic-like effect promoted by GUO, our second goal was to evaluate the potential GUO antidepressant-like effect in an animal model with recognized face and construct validity as the OBX model of depression. However, given the lack of studies in the literature considering the time course of the behavioral and neurochemical changes after the depressive-like behavior onset induced by OBX we firstly characterize some important features regarding the OBX model. Collectively, mice submitted to the OBX model of depression and followed up to 8 weeks simultaneously presented transient and long-lasting deleterious effects in behavioral and neurochemical parameters. The evidences pointed that hippocampus was the most affected brain structure, since a transient hippocampal-related synaptotoxicity, accompanied by a long-lasting hippocampal imbalance in redox and inflammatory homeostasis were observed. Additionally, the neurochemical effects seem to strengthen our behavioral findings. Finally, chronic GUO treatment, similarly to the classical tricyclic antidepressant imipramine, was able to improve the long-term behavioral phenotype impairment induced by OBX, specifically improving behavioral performances that require cognitive functions, accompanied by reversion of hippocampal redox imbalance parameters, as well as in peripheral and central anti-inflammatory IL-10 release. Thus, in present study, the pre-clinical evaluation of GUO as a potential drug for treatment of the most prevalent psychiatric disorders (anxiety and MDD) presented promising results. Furthermore, additional GUO mechanisms of action were evidenced and new perspectives were established. Thus, the data presented in this thesis support the hypothesis of the involvement of the purinergic system in mood disorders, and suggest that GUO has a potential therapeutic activity for the treatment of psychiatric disorders.

O Schistosoma mansoni, parasita responsável pela esquistossomose (barriga dágua), doença que afeta cerca de 300 milhões de pessoas em todo mundo, não possui a via de síntese de purinas, dependendo integralmente da via de salvação de purinas para seu suprimento dessas bases. Uma vez que a terapia se resume a administração de um único fármaco, o praziquantel, diversos casos de resistência do parasita a esse medicamento foram reportadas, sendo assim esta via tem sido citada como alvo potencial para o desenvolvimento de novos fármacos contra a doença. As enzimas adenosina kinase (AK), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT), adenilsuccinato liase (ADSL) e adenilsuccinato sintetase (ADSS) são enzimas chave desta via. Este trabalho faz parte de um projeto maior que visa a obtenção de todas as estruturas das enzimas envolvidas na via de salvação de purinas de Schistosoma mansoni. O cDNA correspondente às enzimas foi amplificado e clonado no vetor de expressão pOPIN; as enzimas AK isoforma 1, HGPRT isoforma 1 e ADSL foram expressas em E. coli Lemo21(DE3) e HGPRT isoforma 3 em E. coli B834(DE3); purificadas em coluna de cobalto agarose por afinidade, concentradas e cristalizadas no kit de cristalização Morpheus (Molecular Dimensions) no Oxford Protein Production Facility (OPPF) em Harwell UK. As coletas de dados por difração de raio-X foram realizadas no Síncrotron Diamond Light Source (DLS) - UK. Foram coletadas duas estruturas de ADSL, a 2.36Å de resolução em complexo com AMP e 2.14Å na forma Apo. A análise das estruturas revelou uma estrutura tetramérica bastante conservada entre as ADSLs, sendo este estado de oligomerização requerido, uma vez que resíduos de três das quatro subunidades compõem o sítio ativo. Apesar do sítio ativo ser altamente conservado entre SmADSL e ADSL humana, a interface dimérica dessas enzimas tem se apresentado suficientemente distintas, o que pode representar um potencial alvo para o desenvolvimento de um inibidor. O ensaio de atividade enzimática de ADSL revelou uma reação endotérmica, indicando que a contribuição da entropia relacionada a grande quantidade de moléculas de água presentes no sítio ativo é importante para a reação cinética. Após diversos experimentos de otimização dos cristais de HGPRT1 e aproximadamente 200 cristais testados, foi obtida uma estrutura em complexo com IMP a 2.8Å de resolução. A análise da estrutura revelou uma estrutura tetramérica. Apesar das subunidades não compartilharem o sítio ativo, este estado de oligomerização é requerido, uma vez que resíduos que compõem o sítio ativo também estão envolvidos em interações na interface dimérica, orientando o resíduo invariável Arg206 na direção do sítio ativo. Foram identificadas quatro mutações na região do sítio ativo entre SmHGPRT e HGPRT humana: Ile149Met, Pro176Arg, Val189Ile e Arg192Lys. Desta forma, a obtenção das estruturas contribui para o entendimento bioquímico desta via essencial para o parasita e de como este pode ser seletivamente privado de recursos. / Schistosoma mansoni is the parasite responsible for schistosomiasis, disease that affects about 300 million people worldwide, and does not have the purine de novo pathway, depending entirely on the purine salvage pathway to supply its demands on purines. Currently, both direct treatment and most disease control initiatives, rely on chemotherapy using a single drug, praziquantel. Concerns over the possibility of resistance developing to praziquantel, has stimulated efforts to develop new drugs for the treatment of schistosomiasis. The purine salvage pathway has been reported as a potential target for developing new drugs against schistosomiasis. Adenosine kinase (AK), hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT), adenylosuccinate lyase (ADSL), adenylosuccinate synthetase (ADSS) are key enzymes in this pathway. This work is part of a larger project aimed at obtaining all the structures of enzymes involved in purine salvage pathway of Schistosoma mansoni. The cDNA corresponding to the enzymes was amplified and cloned in vector pOPIN, AK isoform 1, HGPRT isoform 1 and ADSL were expressed in E. coli Lemo 21 (DE3) and HGPRT isoform 3 in E. coli B834(DE3); purified in cobalt agarose column, concentrated and crystallized in several conditions of the Morpheus (Molecular Dimensions) crystallization kit at the Oxford Protein Production Facility (OPPF) in Harwell UK. The data collection by xray diffraction were performed at Diamond Light Source UK. Two ADSL structures were obtained, ADSL in complex with AMP at 2.36Å resolution and ADSL Apo form at 2.14Å The analysis revealed a tetrameric structure highly conserved between ADSLs, and this oligomerization state is required since residues three of the four subunits comprise the active site. Despite the active site being highly conserved between human ADSL and SmADSL, the dimeric interface of these enzymes it has been shown sufficiently distinct, which may represent a potential target for the development of an inhibitor. The ADSL enzymatic activity assay showed an endothermic reaction, indicating the contribution of the entropy related to the large quantity of water molecules present in the active site is important for the reaction kinetics. After several optimization experiments of HGPRT1 crystals and about 200 crystals tested was obtained a structure in complex with IMP at 2.8Å resolution. The structure analysis revealed a tetrameric structure. Despite the subunits do not share the active site, this oligomerization state is required, since residues that make up the active site are also involved in interactions in dimeric interface, guiding the invariable residue Arg206 toward the active site. Four mutations were identified in the region of the active site between SmHGPRT and human HGPRT: Ile149Met, Pro176Arg, Val189Ile e Arg192Lys. These structures increase the important structural information available about the Schistosoma mansoni purine salvage pathway and how it can be selectively private resources.

O Schistosoma mansoni, parasita responsável pela esquistossomose (barriga dágua), doença que afeta cerca de 300 milhões de pessoas em todo mundo, não possui a via de síntese de purinas, dependendo integralmente da via de salvação de purinas para seu suprimento dessas bases. Uma vez que a terapia se resume a administração de um único fármaco, o praziquantel, diversos casos de resistência do parasita a esse medicamento foram reportadas, sendo assim esta via tem sido citada como alvo potencial para o desenvolvimento de novos fármacos contra a doença. As enzimas adenosina kinase (AK), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT), adenilsuccinato liase (ADSL) e adenilsuccinato sintetase (ADSS) são enzimas chave desta via. Este trabalho faz parte de um projeto maior que visa a obtenção de todas as estruturas das enzimas envolvidas na via de salvação de purinas de Schistosoma mansoni. O cDNA correspondente às enzimas foi amplificado e clonado no vetor de expressão pOPIN; as enzimas AK isoforma 1, HGPRT isoforma 1 e ADSL foram expressas em E. coli Lemo21(DE3) e HGPRT isoforma 3 em E. coli B834(DE3); purificadas em coluna de cobalto agarose por afinidade, concentradas e cristalizadas no kit de cristalização Morpheus (Molecular Dimensions) no Oxford Protein Production Facility (OPPF) em Harwell UK. As coletas de dados por difração de raio-X foram realizadas no Síncrotron Diamond Light Source (DLS) - UK. Foram coletadas duas estruturas de ADSL, a 2.36Å de resolução em complexo com AMP e 2.14Å na forma Apo. A análise das estruturas revelou uma estrutura tetramérica bastante conservada entre as ADSLs, sendo este estado de oligomerização requerido, uma vez que resíduos de três das quatro subunidades compõem o sítio ativo. Apesar do sítio ativo ser altamente conservado entre SmADSL e ADSL humana, a interface dimérica dessas enzimas tem se apresentado suficientemente distintas, o que pode representar um potencial alvo para o desenvolvimento de um inibidor. O ensaio de atividade enzimática de ADSL revelou uma reação endotérmica, indicando que a contribuição da entropia relacionada a grande quantidade de moléculas de água presentes no sítio ativo é importante para a reação cinética. Após diversos experimentos de otimização dos cristais de HGPRT1 e aproximadamente 200 cristais testados, foi obtida uma estrutura em complexo com IMP a 2.8Å de resolução. A análise da estrutura revelou uma estrutura tetramérica. Apesar das subunidades não compartilharem o sítio ativo, este estado de oligomerização é requerido, uma vez que resíduos que compõem o sítio ativo também estão envolvidos em interações na interface dimérica, orientando o resíduo invariável Arg206 na direção do sítio ativo. Foram identificadas quatro mutações na região do sítio ativo entre SmHGPRT e HGPRT humana: Ile149Met, Pro176Arg, Val189Ile e Arg192Lys. Desta forma, a obtenção das estruturas contribui para o entendimento bioquímico desta via essencial para o parasita e de como este pode ser seletivamente privado de recursos. / Schistosoma mansoni is the parasite responsible for schistosomiasis, disease that affects about 300 million people worldwide, and does not have the purine de novo pathway, depending entirely on the purine salvage pathway to supply its demands on purines. Currently, both direct treatment and most disease control initiatives, rely on chemotherapy using a single drug, praziquantel. Concerns over the possibility of resistance developing to praziquantel, has stimulated efforts to develop new drugs for the treatment of schistosomiasis. The purine salvage pathway has been reported as a potential target for developing new drugs against schistosomiasis. Adenosine kinase (AK), hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT), adenylosuccinate lyase (ADSL), adenylosuccinate synthetase (ADSS) are key enzymes in this pathway. This work is part of a larger project aimed at obtaining all the structures of enzymes involved in purine salvage pathway of Schistosoma mansoni. The cDNA corresponding to the enzymes was amplified and cloned in vector pOPIN, AK isoform 1, HGPRT isoform 1 and ADSL were expressed in E. coli Lemo 21 (DE3) and HGPRT isoform 3 in E. coli B834(DE3); purified in cobalt agarose column, concentrated and crystallized in several conditions of the Morpheus (Molecular Dimensions) crystallization kit at the Oxford Protein Production Facility (OPPF) in Harwell UK. The data collection by xray diffraction were performed at Diamond Light Source UK. Two ADSL structures were obtained, ADSL in complex with AMP at 2.36Å resolution and ADSL Apo form at 2.14Å The analysis revealed a tetrameric structure highly conserved between ADSLs, and this oligomerization state is required since residues three of the four subunits comprise the active site. Despite the active site being highly conserved between human ADSL and SmADSL, the dimeric interface of these enzymes it has been shown sufficiently distinct, which may represent a potential target for the development of an inhibitor. The ADSL enzymatic activity assay showed an endothermic reaction, indicating the contribution of the entropy related to the large quantity of water molecules present in the active site is important for the reaction kinetics. After several optimization experiments of HGPRT1 crystals and about 200 crystals tested was obtained a structure in complex with IMP at 2.8Å resolution. The structure analysis revealed a tetrameric structure. Despite the subunits do not share the active site, this oligomerization state is required, since residues that make up the active site are also involved in interactions in dimeric interface, guiding the invariable residue Arg206 toward the active site. Four mutations were identified in the region of the active site between SmHGPRT and human HGPRT: Ile149Met, Pro176Arg, Val189Ile e Arg192Lys. These structures increase the important structural information available about the Schistosoma mansoni purine salvage pathway and how it can be selectively private resources.

Os Transtornos psiquiátricos acompanham a história da humanidade. Classificados em categorias distintas podemos observar que dentre todas as patologias que constituem os transtornos mentais e de comportamento, as doenças mais prevalentes são as doenças de Ansiedade e de Transtorno Depressivo Maior (TDM). Mesmo com muitos avanços nas neurociências, assim como na terapêutica (psicofarmacologia), ainda hoje a fisiopatologia e o desenvolvimento farmacológico são áreas que necessitam intenso estudo. Avanços recentes tem sugerido que drogas capazes de modular os sistemas glutamatérgico e purinérgico possuem potencial efeito neuromodulador, sendo promissores candidatos para o desenvolvimento de novas drogas com ação ansiolítica e/ou antidepressiva. Dessa maneira, o objetivo desta tese foi investigar o potencial efeito ansiolítico da guanosina (GUO) em modelos animais preditivos para o estudo da potencial atividade ansiolítica de novos compostos, assim como seu potencial efeito antidepressivo no modelo animal de depressão da Bulbectomia Olfatória Bilateral (OBX). Inicialmente, nossos resultados demonstram que a administração de GUO foi capaz de produzir um consistente efeito ansiolítico modulando os níveis de adenosina (ADO) e glutamato cerebral. Ainda, pela primeira vez, foi observado que a GUO per se promoveu uma diminuição da liberação de glutamato em preparações de sinaptosomas de hipocampo, um efeito dependente da ativação dos receptores A1 de ADO. Após a caracterização do potencial efeito ansiolítico da GUO, nosso objetivo foi avaliar o potencial efeito antidepressivo da GUO em um modelo animal com validade de face e de constructo, como o modelo da OBX. Contudo, após revisão da literatura em estudos que utilizaram o modelo da OBX, observou-se a necessidade de uma investigação a longo prazo, das principais alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pela OBX. Nossos resultados, mostram pela primeira vez, que camundongos submetidos a OBX apresentaram simultaneamente alterações comportamentais e neuroquímicas transitórias e de longa duração. Ademais, as evidências indicam que o hipocampo possui alta susceptibilidade aos danos induzidos pela OBX, visto que uma sinaptotoxicidade transitória, acompanhada de um duradouro desequilíbrio redox e aumento da resposta inflamatória foram observados. Por fim, o tratamento crônico com GUO foi capaz de reverter a maioria das alterações identificadas previamente como duradouras nos parâmetros comportamentais e neuroquímicos no modelo da OBX. Considerando os resultados neuroquímicos obtidos pelos diferentes protocolos de tratamento realizados neste estudo, novas hipóteses de mecanismos de ação exercidos pela GUO foram apresentadas, e mecanismos já estabelecidos foram reproduzidos. Por fim, de uma maneira geral os dados apresentados nesta tese reforçam a hipótese do envolvimento do sistema purinérgico nos transtornos psiquiátricos, e sugerem que a GUO apresenta uma potencial ação terapêutica para o tratamento destas doenças, abrindo assim novas perspectivas para elucidação dos mecanismos envolvidos na fisiopatologia da ansiedade e TDM. / Psychiatric disorder had accompanied the course of human history. Mental and behavioral disorders are classified in different categories and among all different psychiatric disorders; anxiety and major depressive disorder (MDD) are the most prevalents. Despite the substantial advances in our knowledge on the neurobiological bases of both anxiety and MDD, as well as in the therapeutic area (psychopharmacology), even today, the pathophysiology of these disorders as well as pharmacological development are still under investigation. Recent advances have suggested that drugs able to modulate glutamatergic and purinergic systems present a potential neuromodulatory effect, and are promising candidates for the development of new drugs with both anxiolytic and antidepressant effects. Thus, the aim of this work was to investigate the potential guanosine (GUO) anxiolytic-like effects in predictive animal models largely used to elucidate anxiolytic properties of new compounds, as well as investigate the potential GUO antidepressant effect in Olfactory Bulbectomy (OBX) model of depression. Initially, our results demonstrate that acute GUO administration was able to induce a consistent anxiolytic-like effect, by modulating the adenosine and glutamate cerebrospinal levels. Here, for the first time, it was observed that GUO per se was able to decrease the glutamate release in hippocampal synaptosome. After characterizing the potential anxiolytic-like effect promoted by GUO, our second goal was to evaluate the potential GUO antidepressant-like effect in an animal model with recognized face and construct validity as the OBX model of depression. However, given the lack of studies in the literature considering the time course of the behavioral and neurochemical changes after the depressive-like behavior onset induced by OBX we firstly characterize some important features regarding the OBX model. Collectively, mice submitted to the OBX model of depression and followed up to 8 weeks simultaneously presented transient and long-lasting deleterious effects in behavioral and neurochemical parameters. The evidences pointed that hippocampus was the most affected brain structure, since a transient hippocampal-related synaptotoxicity, accompanied by a long-lasting hippocampal imbalance in redox and inflammatory homeostasis were observed. Additionally, the neurochemical effects seem to strengthen our behavioral findings. Finally, chronic GUO treatment, similarly to the classical tricyclic antidepressant imipramine, was able to improve the long-term behavioral phenotype impairment induced by OBX, specifically improving behavioral performances that require cognitive functions, accompanied by reversion of hippocampal redox imbalance parameters, as well as in peripheral and central anti-inflammatory IL-10 release. Thus, in present study, the pre-clinical evaluation of GUO as a potential drug for treatment of the most prevalent psychiatric disorders (anxiety and MDD) presented promising results. Furthermore, additional GUO mechanisms of action were evidenced and new perspectives were established. Thus, the data presented in this thesis support the hypothesis of the involvement of the purinergic system in mood disorders, and suggest that GUO has a potential therapeutic activity for the treatment of psychiatric disorders.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-08-18Bitstream added on 2014-06-13T20:29:19Z : No. of bitstreams: 1 silva_don_me_sjrp.pdf: 1054782 bytes, checksum: 832047dd271670cc0bc6debdbd5dc8d8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) catalisa a fosforólise de nucleosídeos de purina para suas respectivas bases e açucares (ribose ou desoxirribose) 1-fosfato. A PNP desempenha uma função central no metabolismo das purinas, normalmente operando na via de recuperação do DNA das células. Mais ainda, a PNP cliva ligações glicosídicas com inversão da configuração para produzir a-ribose 1-fosfato. Acredita-se que no organismo do Mycobacterium tuberculosis a PNP desempenha tarefas similares, o que levanta o interesse em desenvolver ciência que dê suporte para o desenvolvimento de drogas baseadas na estrutura desta proteína. A proteína é um homotrímero simétrico com um arranjo triangular das subunidades, similar às PNPs triméricas de mamíferos. Cada monômero consiste de um enovelamento a/ß formado por onze fitas ß circundadas por oito hélices a. O estudo desta PNP visa proporcionar comparações com outras estruturas, na intenção de identificar as bases estruturais de possíveis diferenças ou similaridades funcionais entre esta e outras PNPs, num esforço para desenvolver pesquisa que dê suporte para o desenho de novas drogas mais seletivas e poderosas contra a tuberculose. / The Purine nucleoside phosphorylase (PNP) catalyses the phosphorolysis of purine nucleosides to corresponding bases and ribose 1-phosphate. PNP plays a central role in purine metabolism, normally operating in the purine salvage pathway of cells. Moreover, PNP cleaves glycosidic bond with inversion of configuration to produce á-ribose 1-phosphate. It is believed that in the MtPNP is responsible for the same labor in the Mycobacterium tuberculosis organism, which arouses the interest in developing science for giving support to the development of structure based drugs. The protein is a symmetrical homotrimer with triangular arrangement of the subunits, similar to the trimeric mammalian PNPs. Each monomer consist of a á/â folding formed by eleven â sheet surrounded by eight á helices. The study of this PNP aims the possibility of caring out comparisons with other structures, in order to identify the structural basis of possible differences or functional similarities between this and other PNPs, in an effort to develop research which gives support to the design of more selective and powerful new drugs against tuberculosis.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-23Bitstream added on 2014-06-13T20:10:04Z : No. of bitstreams: 1 souza_mm_me_sjrp.pdf: 836354 bytes, checksum: 11c4cceceb0b5cfc0fbfbee0acea3de5 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / De acordo com a OMS, a tuberculose mata 5000 pessoas por dia, e se não controlada, são estimados 35 milhões de novos casos nos próximos vinte anos. A alta susceptibilidade dos infectados por HIV para a tuberculose, bem como a proliferação da tuberculose multidroga-resistente (MDR), tem criado um grande interesse mundial de expansão nos programas atuais de pesquisas sobre a tuberculose. A Purina Nucleosídeo Fosforilase do Mycobacterium tuberculosis (MtPNP) é um potencial alvo para novas drogas anti-tuberculose visto que é responsável pela síntese de novo de ribonucleotídeos de purina. A Inibição específica da PNP poderia potencialmente levar o M. tuberculosis ao estado latente. O objetivo desde trabalho é resolver a estrutura da MtPNP complexada com adenina, e analisar as interações com os ligantes. A MtPNP foi cristalizada utilizando condições experimentais descritas posteriormente, e o ligante (adenina) foi adicionado por soaking. Os dados de difração de raios X foram coletados no detector CCD utilizando fonte de radiação síncotron (Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, LNLS, Campinas, Brazil). O programa MOSFLM foi utilizado para o processamento, e os dados foram escalonados através do programa SCALA, apresentando o grupo espacial ortorrômico P21212 (a=118,96Å, b=134,65 Å, c=44,42 Å). O cristal foi determinado utilizando o método de substituição... / In according to the WHO, the tuberculosis kills 5000 people every day, if does not controlled, are esteemed 35 millions of new cases in next 20 years. The high susceptibility of human immunodeficiency virus infected persons to the disease and the proliferation of multidrug-resistant (MDR) strains have created a worldwide interest in expanding current programs in tuberculosis research. The Purine Nucleoside Phosphorylase from Mycobacterum tuberculosis (MtPNP) is a potential target for new drug anti-tuberculosis, whereas is responsible for de novo synthesis of purine ribonucleotides. The specific inhibition of M. tuberculosis PNP could potentially lead to the latent state of M. tuberculosis. The objective of this work is to solve the structure from MtPNP complexed with adenine, and to analyze their interactions with the ligand. MtPNP was crystallized using the experimental conditions described elsewhere, and the ligand (adenine) was added by soaking. The X-ray diffraction data were collected on a CCD detector using synchrotron radiation source (Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, LNLS, Campinas, Brazil). It was used the MOSFLM program to processing, and the data were scaled through the program SCALA, presenting orthorhombic spatial group P21212 (a=118,96Å, b=134,65 Å, c=44,42 Å). The crystal was determined by molecular replacement methods using the program AMoRe. The final model has Rfree and Rfactor of 23.87% and 17.51% respectively, and maximum resolution of 1.86Å. It was observed a large...(Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Claudia Rocha (claudia.rocha@udesc.br) on 2018-02-19T14:37:08Z No. of bitstreams: 1 PGCA16MA189.pdf: 195058 bytes, checksum: d718ac1f6d250d64aa0878094047280c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-19T14:37:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA16MA189.pdf: 195058 bytes, checksum: d718ac1f6d250d64aa0878094047280c (MD5) Previous issue date: 2016-01-26 / UNIEDU / FUMDES / T. evansi causes a highly pathogenic disease in horses popularly known as "Surra" or "Mal das Cadeiras". The Pantanal (Brazil) outbreaks are recorded due to the large population of horses. To date there are no effective treatment methods causing major damage to livestock. Trypanosomes present themselves vulnerable in relation to the metabolism of purines as these organisms do not have the pathway “De novo” of meeting their requirements through the rescue of preformed bases and demonstrate complete dependence of purines of their hosts. Among the components of this system point out that adenosine has its concentration controlled by the enzyme adenosine deaminase (ADA). The objectives of this study were to amplify, clone and sequence the ADA gene from T. evansi DNA samples and express the recombinant protein ADA. The coding region of the ADA gene was amplified from genomic DNA of T. evansi and yielded a sequence of 1857 bp showed high degree of similarity (95%) ADA T. brucei. This region was cloned into the pGEM-T vector Easy®. After digestion of construct pGEM: ADA fragments were cloned into expression vector pET30. The expression analysis by SDS-PAGE demonstrated that the temperature of 18ºC for 24 hours and 0,05 mM IPTG induction was the most effective indicating molecular mass of approximately 68 kDa. The Western blot analysis detected the ADA enzyme in the protein extract of T. evansi only in the insoluble fraction. The protein was solubilized and purified by affinity chromatography. Through these results the presence of ADA in T. evansi was confirmed. tests will be performed to detect the enzymatic activity of ADA. Their study can contribute to the development of new chemotherapeutic agents and the development of specific inhibitors for the ADA / T. evansi causa uma doença altamente patogênica em equídeos popularmente conhecida como “Surra” ou “Mal das Cadeiras”. No Pantanal (Brasil) surtos são registrados devido à grande população de equinos. Até o presente momento não existem métodos de tratamento eficazes gerando grandes prejuízos à pecuária. Os tripanossomas apresentam-se vulneráveis em relação ao metabolismo das purinas pois estes organismos não contam com a via De novo satisfazendo suas exigências por meio do salvamento das bases pré-formadas e demonstram completa dependência das purinas dos seus hospedeiros. Entre os componentes desse sistema destacamos a adenosina que tem sua concentração controlada pela enzima adenosina deaminase (ADA). Os objetivos deste estudo foram amplificar, clonar e sequenciar o gene ADA a partir de amostras do DNA de T. evansi e expressar a proteína recombinante ADA. A região codificadora do gene da enzima ADA foi amplificada a partir do DNA genômico de T. evansi e originou uma sequência de 1857 bp que apresentou alto grau de similaridade (95%) com a enzima ADA de T. brucei. Essa região foi clonada no vetor pGEM-T Easy®. Após a digestão da construção pGEM:ADA, os fragmentos foram clonados em vetor de expressão pET30. A análise da expressão através do SDS-PAGE demonstrou que a temperatura de 18ºC por 24 horas e indução com IPTG 0.05 mM foi a mais eficiente indicando massa molecular de aproximadamente 68 kDa. A análise Western-Blot detectou a enzima ADA no extrato proteico de T. evansi apenas na fração insolúvel. A proteína foi solubilizada e purificada por meio da cromatografia de afinidade. SDS-PAGE e o Western-blot confirmaram a eficiência destes protocolos. Através desses resultados a presença da enzima ADA em T. evansi foi confirmada. Seu estudo pode contribuir para o desenvolvimento de novos agentes quimioterápicos e o desenvolvimento de agentes inibidores específicos para ADA

Os Transtornos psiquiátricos acompanham a história da humanidade. Classificados em categorias distintas podemos observar que dentre todas as patologias que constituem os transtornos mentais e de comportamento, as doenças mais prevalentes são as doenças de Ansiedade e de Transtorno Depressivo Maior (TDM). Mesmo com muitos avanços nas neurociências, assim como na terapêutica (psicofarmacologia), ainda hoje a fisiopatologia e o desenvolvimento farmacológico são áreas que necessitam intenso estudo. Avanços recentes tem sugerido que drogas capazes de modular os sistemas glutamatérgico e purinérgico possuem potencial efeito neuromodulador, sendo promissores candidatos para o desenvolvimento de novas drogas com ação ansiolítica e/ou antidepressiva. Dessa maneira, o objetivo desta tese foi investigar o potencial efeito ansiolítico da guanosina (GUO) em modelos animais preditivos para o estudo da potencial atividade ansiolítica de novos compostos, assim como seu potencial efeito antidepressivo no modelo animal de depressão da Bulbectomia Olfatória Bilateral (OBX). Inicialmente, nossos resultados demonstram que a administração de GUO foi capaz de produzir um consistente efeito ansiolítico modulando os níveis de adenosina (ADO) e glutamato cerebral. Ainda, pela primeira vez, foi observado que a GUO per se promoveu uma diminuição da liberação de glutamato em preparações de sinaptosomas de hipocampo, um efeito dependente da ativação dos receptores A1 de ADO. Após a caracterização do potencial efeito ansiolítico da GUO, nosso objetivo foi avaliar o potencial efeito antidepressivo da GUO em um modelo animal com validade de face e de constructo, como o modelo da OBX. Contudo, após revisão da literatura em estudos que utilizaram o modelo da OBX, observou-se a necessidade de uma investigação a longo prazo, das principais alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pela OBX. Nossos resultados, mostram pela primeira vez, que camundongos submetidos a OBX apresentaram simultaneamente alterações comportamentais e neuroquímicas transitórias e de longa duração. Ademais, as evidências indicam que o hipocampo possui alta susceptibilidade aos danos induzidos pela OBX, visto que uma sinaptotoxicidade transitória, acompanhada de um duradouro desequilíbrio redox e aumento da resposta inflamatória foram observados. Por fim, o tratamento crônico com GUO foi capaz de reverter a maioria das alterações identificadas previamente como duradouras nos parâmetros comportamentais e neuroquímicos no modelo da OBX. Considerando os resultados neuroquímicos obtidos pelos diferentes protocolos de tratamento realizados neste estudo, novas hipóteses de mecanismos de ação exercidos pela GUO foram apresentadas, e mecanismos já estabelecidos foram reproduzidos. Por fim, de uma maneira geral os dados apresentados nesta tese reforçam a hipótese do envolvimento do sistema purinérgico nos transtornos psiquiátricos, e sugerem que a GUO apresenta uma potencial ação terapêutica para o tratamento destas doenças, abrindo assim novas perspectivas para elucidação dos mecanismos envolvidos na fisiopatologia da ansiedade e TDM. / Psychiatric disorder had accompanied the course of human history. Mental and behavioral disorders are classified in different categories and among all different psychiatric disorders; anxiety and major depressive disorder (MDD) are the most prevalents. Despite the substantial advances in our knowledge on the neurobiological bases of both anxiety and MDD, as well as in the therapeutic area (psychopharmacology), even today, the pathophysiology of these disorders as well as pharmacological development are still under investigation. Recent advances have suggested that drugs able to modulate glutamatergic and purinergic systems present a potential neuromodulatory effect, and are promising candidates for the development of new drugs with both anxiolytic and antidepressant effects. Thus, the aim of this work was to investigate the potential guanosine (GUO) anxiolytic-like effects in predictive animal models largely used to elucidate anxiolytic properties of new compounds, as well as investigate the potential GUO antidepressant effect in Olfactory Bulbectomy (OBX) model of depression. Initially, our results demonstrate that acute GUO administration was able to induce a consistent anxiolytic-like effect, by modulating the adenosine and glutamate cerebrospinal levels. Here, for the first time, it was observed that GUO per se was able to decrease the glutamate release in hippocampal synaptosome. After characterizing the potential anxiolytic-like effect promoted by GUO, our second goal was to evaluate the potential GUO antidepressant-like effect in an animal model with recognized face and construct validity as the OBX model of depression. However, given the lack of studies in the literature considering the time course of the behavioral and neurochemical changes after the depressive-like behavior onset induced by OBX we firstly characterize some important features regarding the OBX model. Collectively, mice submitted to the OBX model of depression and followed up to 8 weeks simultaneously presented transient and long-lasting deleterious effects in behavioral and neurochemical parameters. The evidences pointed that hippocampus was the most affected brain structure, since a transient hippocampal-related synaptotoxicity, accompanied by a long-lasting hippocampal imbalance in redox and inflammatory homeostasis were observed. Additionally, the neurochemical effects seem to strengthen our behavioral findings. Finally, chronic GUO treatment, similarly to the classical tricyclic antidepressant imipramine, was able to improve the long-term behavioral phenotype impairment induced by OBX, specifically improving behavioral performances that require cognitive functions, accompanied by reversion of hippocampal redox imbalance parameters, as well as in peripheral and central anti-inflammatory IL-10 release. Thus, in present study, the pre-clinical evaluation of GUO as a potential drug for treatment of the most prevalent psychiatric disorders (anxiety and MDD) presented promising results. Furthermore, additional GUO mechanisms of action were evidenced and new perspectives were established. Thus, the data presented in this thesis support the hypothesis of the involvement of the purinergic system in mood disorders, and suggest that GUO has a potential therapeutic activity for the treatment of psychiatric disorders.

A presente tese foi elaborada em três capítulos, correspondente às seções 2, 3 e 4. No primeiro objetivou-se avaliar a associação de quitosana com grão de soja integral nas dietas sobre o consumo, fermentação ruminal, digestibilidade e metabolismo de nutrientes e seus efeitos sobre a produção de leite, perfil de ácidos graxos do leite e a eficiência produtiva de vacas em lactação. Para tal, 24 vacas multíparas da raça Holandesa, oito dessas com cânula ruminal, foram distribuídas em quadrados latinos 4×4 replicados. Os tratamentos foram obtidos por esquema fatorial 2×2 pela combinação de quitosana e grão de soja integral nas dietas. De modo geral, a associação de quitosana com grão de soja aumentou a eficiência de fermentação ruminal, reduziu as populações bacterianas ligadas à biohidrogenação e aumentou o teor de ácidos graxos insaturados na gordura do leite, mas houve significativa redução do consumo e digestibilidade dos nutrientes, da síntese de proteína microbiana e da produção de leite. No entanto, a adição de quitosana em dietas sem suplementação lipídica pode ser uma boa estratégia nutricional para aumentar a retenção de N e a eficiência alimentar de vacas em lactação, e adicionalmente, aumentar o teor de ácidos graxos insaturados e de cis-9, trans-11 CLA no leite. No segundo capítulo, o objetivo geral foi avaliar os indicadores externos Cr2O3 e TiO2 e os internos MSi, FDNi e FDAi, estes analisados em diferentes sacos de incubação in situ, a partir da acurácia, precisão e robustez das estimativas de excreção fecal em ensaio de digestão com vacas leiteiras consumindo diferentes dietas. Foram utilizadas oito vacas canuladas no rúmen para a realização de coletas totais de fezes com 24, 48 e 72 h de duração. De modo geral, o Cr2O3 gerou estimativas acuradas e precisas, no entanto a recuperação fecal e a robustez foram afetadas pelo consumo de extrato etéreo das vacas. O indicador TiO2 apresentou incompleta recuperação fecal, baixa acurácia, precisão e robustez. Dentre as combinações avaliadas para os indicadores internos, a FDNi em sacos de poliéster teve completa recuperação fecal e gerou as estimativas mais acuradas, precisas e robustas. A falta de acurácia e precisão dos indicadores têm grande impacto final sobre as estimativas de digestibilidade. No terceiro capítulo, o objetivo foi avaliar o uso da creatinina como indicador do volume urinário para estimativas de excreção total de derivados de purinas como técnica de avaliação da produção microbiana ruminal em vacas leiteiras alimentadas com diferentes dietas. Também foram utilizadas as oito vacas canuladas no rúmen para a realização de coletas totais de urina com 24, 48 e 72 h de duração. De modo geral, a creatinina foi afetada pelas condições experimentais do estudo, incluindo efeito de dieta e variações conforme o período experimental e animais. Apesar da relação entre excreção observada e estimada de derivados de purinas, essa deve ser vista com cautela, em razão de que o volume urinário foi subestimado e que as estimativas não identificaram corretas diferenças entre as dietas, comprometendo as avaliações sobre a produção microbiana ruminal. / The present thesis was elaborated in three chapters, corresponding to sections 2, 3 and 4. In the first one, the aim was to evaluate the association of chitosan (C) and whole raw soybean (WRS) in diets, evaluating the intake, ruminal fermentation, digestibility and nutrient metabolism and its effects on milk production, milk fatty acids profile and the productive efficiency of lactating cows. Twenty four multiparous Holstein cows, eight of them fitted with ruminal cannula, were distributed in a replicated 4 × 4 Latin squares. The treatments were a combination of C and WRS diets arranged in a 2 × 2 factorial design. This association increased the efficiency of ruminal fermentation, reducing the bacterial population responsible for the biohydrogenation and increased the unsaturated fatty acids in milk. The C and WRS diets caused a significant reduction in DMI and nutrient digestibility, in microbial protein synthesis and milk yield. However, the addition of C in diets without a lipid supplementation may be a good nutritional strategy to increase the N retention and increase the food efficiency of lactating cows, and, indeed, to increase the unsaturated fatty acids content, mainly cis-9, trans-11 CLA. In the second chapter, the objective was to evaluate the external indicators Cr2O3 and TiO2 and the indigestible internal DM, NDF and ADF that were determined in in situ different incubation bags from the accuracy, precision and robustness of the fecal excretion estimates in a digestion assay with different dairy cow diets. Eight cows fitted with ruminal cannula were used to perform total fecal collection over 24, 48 and 72 hours. The Cr2O3 generated accurate estimates, however, the fecal recovery and robustness were affected by the ether extract intake. The TiO2 indicator showed incomplete fecal recovery, low accuracy, precision and robustness. Among the combinations for the internal indicators, the iNDF in polyester bags had a complete recovery and generated the most accurate and robust estimates. The lack of accuracy and precision of the indicators have a big impact on the digestibility estimates. In the third chapter, the aim was to evaluate the use of creatinine as an indicator of urinary volume. It would be possible to estimate the total excretion of purine derivatives to evaluate the ruminal microbial protein synthesis in different cow diets. Also, eight multiparous cows fitted with ruminal cannula were used to make total urine collection over 24, 48 and 72 hours. The creatinine was affected by the study experimental conditions, including dietary effect and variations according to period and animals. The relationship between observed and estimated excretion of purine derivatives should be viewed with caution, because the urinary volume was underestimated and the estimates did not identify the correct differences between diets, that could compromise the evaluations of ruminal microbial production.

A hipoxantina, principal oxipurina envolvida na via de salvação das purinas no cérebro, acumula-se na doença de Lesch-Nyhan, um erro inato do metabolismo das purinas. Os sintomas clínicos manifestam-se precocemente na vida dos pacientes, incluindo alterações motoras e cognitivas, retardo mental e automutilação. Embora os mecanismos subjacentes da disfunção cerebral na doença de Lesch-Nyhan sejam pouco compreendidos, o acúmulo de hipoxantina parece contribuir para os danos neurológicos. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da administração intraestriatal de hipoxantina em ratos infantis e adultos jovens submetidos à cirurgia estereotáxica. Neste estudo, analisamos primeiramente o efeito da hipoxantina sobre os parâmetros neuroinflamatórios e oxidativos em estriados de ratos infantis e adultos jovens. Foram avaliados também alguns parâmetros neuroenergéticos. Ratos Wistar de 21 e 60 dias de vida foram submetidos à cirurgia estereotáxica e foram divididos em dois grupos: controle (infusão de solução salina 0,9%) e hipoxantina (10 IJM). A administração intraestriatal de hipoxantina aumentou os níveis de IL-6 e TNF-a e o imunoconteúdo da subunidade NF-kB I p65 nuclear em estriado de ambas as idades de ratos. A ativação microglial e astrocitária foram observadas pelo aumento do imunoconteúdo de lba1 e GFAP, respectivamente, no estriado de ratos de 21 dias. Todos os parâmetros oxidativos foram alterados, sugerindo uma forte relação neurotóxica de hipoxantina e estresse oxidativo. Em ratos de 60 dias de vida, a hipoxantina aumentou a atividade da succinato desidrogenase e do complexo 11 e diminuiu a atividade da citocromo c oxidase e seu imunoconteúdo. A injeção de hipoxantina diminuiu a porcentagem marcação de membrana mitocondrial e aumentou marcação de potencial mitocondrial. A hipoxantina também diminuiu o número de células vivas e aumentou o número de células apoptóticas. Em ratos de 21 dias de vida, a hipoxantina alterou alguns parâmetros do metabolismo energético e diminui a atividade de Na+,K+-ATPase, provavelmente por danos às proteínas, visto pela redução de conteúdo de sulfidrilas. Nossos achados mostram que a administração de hipoxantina alterou parâmetros neuroinflamatórios e neuroenergéticos, possivelmente por meio de desequilíbrio oxidativo, sugerindo que esses processos podem estar envolvidos, pelo menos em parte, com os distúrbios neurológicos encontrados em pacientes com doença de Lesch-Nyhan. / Hypoxanthine, the major oxypurine metabolite involved in purine's salvage pathway in the brain, is accumulated in Lesch-Nyhan disease, an in bom errar of metabolism of purine. The clinicai symptoms manifest early in the patients' lives, including motor and cognitiva alterations, mental retardation and self-mutilation. Although the underlying mechanisms of brain dysfunction in Lesch-Nyhan disease are poorly understood, the accumulation of hypoxanthine appears to contribute to neurological damage. The purpose of this study was to investigate the effects of hypoxanthine intrastriatal administration in infant and young adult rats submitted to stereotactic surgery. We firstly analyzed the effect of hypoxanthine on neuroinflammatory and oxidative parameters in striatum of infant and young adult rats. We also evaluated some neuroenergetic parameters. Wistar rats of 21 and 60 days of life underwent stereotactic surgery and were divided into two groups: contrai (infusion of saline 0.9%) and hypoxanthine (10 IJM). lntrastriatal administration of hypoxanthine increased IL- 6 and TNF-a leveis and nuclear immunocontent of NF-KB/p65 subunit in striatum of rats of both ages. Microglial and astrocyte activation was seen by the increase in lba1 and GFAP immunocontent, respectively, in striatum of infant rats. Ali oxidative parameters were altered, suggesting a strong neurotoxic hypoxanthine role on oxidative stress. In 60-day-old rats hypoxanthine increased succinate dehydrogenase and complex 11 activities and diminished cytochrome c oxidase activity and immunocontent. Hypoxanthine injection decreased the percentage of cells with mitochondrial membrana label and increased mitochondrial mass potential labeling. Hypoxanthine also diminished the number of live cells and increased the number of apoptotic cells. In 21-days-old rats hypoxanthine altered some energy metabolism parameters and decreased Na•,K•-ATPase activity probably by protein damage, seen in the reduction of sulfhydryl content. Our findings show that the administration of hypoxanthine altered neuroinflammatory and neuroenergetic parameters, possibly through oxidative imbalance, suggesting that these processes may be involved, at least in part, with the neurological disorders found in patients with Lesch-Nyhan disease.