Antecedentes. El consumo de tabaco es un factor etiológico bien conocido del desarrollo de arrugas faciales así como la mayor causa de enfermedad pulmonar obstructiva crónica en adultos. Las alteraciones de las fibras elásticas de la piel y del pulmón, respectivamente, parecen constituir el sustrato histopatológico de ambas alteraciones.Pacientes y método. A fin de analizar las alteraciones de las fibras elásticas de la piel secundarias al consumo de tabaco, así como la existencia de una posible relación con las alteraciones de la función pulmonar que el hábito de fumar induce, hemos estudiado prospectivamente 78 pacientes (20 no fumadores, 35 exfumadores y 23 fumadores), de 41 a 70 años de edad. A todos ellos se les practicó una biopsia de la cara interna del brazo, y se determinaron los parámetros morfométricos (número y densidad) de las fibras elásticas de la dermis superficial y de la dermis media y profunda. Asimismo se llevaron a cabo inmunotinciones con los anticuerpos antielastina, anticomponente P-amiloide, antiinhibidores de las proteasas plasmáticas y con las lectinas Concanavalina A y Triticum vulgaris. Para establecer el grado de obstrucción del flujo aéreo se realizó una espirometría forzada, la medición de los volúmenes pulmonares y de la capacidad de transferencia de CO.Resultados. Los resultados obtenidos muestran un incremento estadísticamente significativo del número de fibras y del área media relativa ocupada por las fibras elásticas de la dermis media y profunda en los pacientes fumadores respecto a los no fumadores. Este incremento parece ser secundario a un proceso degenerativo que afectaría tanto a la matriz amorfa como al componente microfibrilar de las fibras elásticas. Asimismo, hemos hallado una relación estadísticamente significativa e independiente del consumo de tabaco entre las alteraciones de las fibras elásticas de la dermis y el grado de deterioro de la función pulmonar. Conclusiones. El hábito de fumar conlleva una degeneración de las fibras elásticas de la piel. Por otra parte, la densidad de las fibras elásticas de la piel constituye un factor de riesgo independiente o un indicador de riesgo para el desarrollo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica, tanto en fumadores como en no fumadores. / Background. Cigarette smoking constitutes a risk factor for the development of premature facial wrinkles and airflow obstruction. Similar changes in elastic fibers of skin and lung could play a role in the pathogenesis of both phenomena.Methods. Skin biopsies from the upper inner arm of 78 patients (20 nonsmokers, 35 former smokers and 23 smokers) aged between 41 and 70 years were taken. The mean relative area and number of superficial and deeper dermal elastic fibers were evaluated using morphometry. The specimens were immunostained using antibodies to elastin, P-amyloid component, plasma protease inhibitors and with lectins Concanavalin A and Triticum vulgaris. Spirometry, pulmonary volumes and diffusing capacity for carbon monoxide were used to establish the index of airflow obstruction. The results were statistically compared.Results. The mean relative area and number of the dermal elastic fibers were significantly increased in the cigarette smokers compared to non smokers. This increase seems to be due to degeneration of both components of elastic fibers, elastin and microfibrils. Moreover, after controlling for smoking habit, a significant statistical relationship between the level of airflow obstruction and the increase of dermal elastic fibers density in non-exposed skin was found.Conclusions. We have found abnormalities in the elastic tissue of the non-exposed skin of smokers. On the other hand, density of dermal elastic fibers constitutes an independent risk factor for the development of airflow obstruction in both smokers and non smokers.

La present Tesi Doctoral es situa en el context de les reaccions intramoleculars de radicals 2-indolilacil i està constituïda, d'acord amb els objectius inicials, per dues parts.La primera part centra l'atenció en les ciclacions de radicals 2-indolilacil en condicions reductores, emprant alquens com a acceptors radicalaris per a l'obtenció d'estructures que formen part de productes naturals i d'altres compostos bioactius.En aquest context s'ha aconseguit: - El desenvolupament d'un nou procediment d'anulació indòlica que permet accedir a cetones cícliques 1,2-fusionades amb l'indole.- La síntesi total de l'alcaloide (±)-guatambuïna i la síntesi formal de l'alcaloide olivacina.La segona part es situa en el context de les reaccions intramoleculars de radicals 2-indolilacil amb sistemes aromàtics.Els principals aconseguiments en aquesta part són:- La ciclació de radicals 2-indolilacil sobre anells de benzè en condicions no reductores (n-Bu6Sn2-hvper donar de manera eficient indolil fenil cetones tetracícliques.- La ciclació regioselectiva de radicals 2-indolilacil sobre piridines en condicions no reductores (n-Bu6Sn2-hv per donar indolil 4-piridil cetones tetracícliques. L'efectivitat d'aquest protocol radicalari permet el fàcil accés a elipticina quinones.- La ciclació de radicals 3-(3-quinolil)metil-2-indolilacil en condicions reductores (TTMSS-AIBN) per donar pentacicles relacionats amb la calotrixina, l'estat d'oxidació dels quals varia depenent del tipus de substituent del nitrogen indòlic. A partir d'un substrat convenientment substituït s'ha assolit la síntesi de l'alcaloide calotrixina B.- El desenvolupament d'un protocol "metal free" per a la ciclació de radicals 3-(3-quinolil)metil-2-indolilacil, en el qual es fa evident la importància del paper de l'AIBN en les reaccions de substitució homolítica aromàtica. / This thesis work is placed in the context of intramolecular reactions of 2- indolylacyl radicals. According with the initial objectives it's structured in two parts.The first part focus attention to the cyclisation of 2-indolylacyl radicals under reductive conditions, using alkenes as radical acceptors to obtain structures related with natural products and medicinal compounds.In this first part:- A new annulation procedure based on intramolecular reactions of 2- indolylacyl radicals have been developed. This procedure provides straightforward access to cyclic ketones fused to 1,2-position of the indole nucleus.- A total synthesis of the (±)-guatambuine and a formal synthesis of olivacine alkaloid have been achieved.The second part of the work is placed in the context of intramolecuar reactions of 2-indolylacyl radicals with aromatic systems.In this second part:- The cyclization of 2-indolylacyl radicals under non reductive conditions (n-Bu6Sn2-h"v"to give efficiently tetracyclic phenyl indolyl ketones have been studied.- Regioselective cyclization of 2-indolylacyl radicals upon pyridines under non reductive conditions (n-Bu6Sn2-h"v" to give tetracyclic indolyl 4-pyridyl ketones have been studied. The effectiveness of this radical protocol is illustrated by a fast synthetic entry to ellipticine quinones.- The cyclisation of 3-(3-quinolyl)methyl-2-indolylacyl radicals under TTMSS-AIBN conditions have been studied. This cyclisation provides an efficient synthetic entry to calothrixin-related pentacycles, which are obtained in a different oxidation state depending on the substitution at the indole nitrogen. The synthesis of calothrixin B has been achieved from a radical precursor suitably protected at the indole nitrogen.- A new metal-free protocol for the cyclisation of 3-(3-quinolyl)methyl-2- indolylacyl radicals that illustrates the determinant role of AIBN in homolytic aromatic substitutions have been developed.

La presente Tesis Doctoral se ha centrado en el estudio de especies utilizadas en medicina tradicional china y otras especies utilizadas en medicina popular como antiinflamatorias, particularmente en procesos que afecten a la piel como dermatitis y dermatosis. Las plantas medicinales objeto de estudio han sido Schinus molle, Lysimachia foenum-graecum, Lithospermum erythrorhizon, Forsythia suspensa e Isodon xerophilus.El desarrollo experimental ha consistido en la obtención previa del material vegetal mediante los medios adecuados en cada caso, extracción y fraccionamiento de los extractos. Estudio analítico y farmacológico de todos los extractos obtenidos y aislamiento e identificación de los principios mayoritarios de las fracciones activas.Como métodos experimentales in vivo se han desarrollado los protocolos de inflamación aguda y crónica en oreja de ratón inducida por el 13-acetato de 12-O-tetradecanoilforbol (TPA) y los modelos de edema agudo en pata de ratón inducido por carragenina y fosfolipasa A2 (PLA2). Entre las técnicas in vitro desarrolladas se incluyen la determinación de citotoxicidad, inhibición de la producción de nitritos, leucotrieno B4 y mediadores peptídicos en células aisladas, así como la actividad antioxidante.Entre los resultados más destacables destacan: De la fracción activa de Schinus molle se han aislado dos triterpenos tetracíclicos, los ácidos 3-epi-isomasticadienolálico e isomasticadienonálico, y una biflavanona, chamejasmina, siendo activos como antiinflamatorios los tres principios en diferentes protocolos experimentales, y la flavanona además fue activa como antioxidante. Se ha demostrado por vez primera la actividad antiinflamatoria de un triterpeno con estructura tipo eufano. El compuesto se ha identificado como ácido isomasticadienonálico o ácido (13,14,17,20R,24Z)-3,21-dioxolanostan- 8,24-dien-26-oico. Se han aislado cinco nuevos saponósidos a partir de la especie Lysimachia foenum-graecum, de los cuales, el compuesto identificado como 3-O-{-L-ramnopiranosil(12)--D-glucopiranosil(12)-[-D-glucopiranosil (14)]--L-arabinopiranosil}21,22-O-diangeloil barringtogenol C 28-O-gluco- piranósido, denominado foenumósido E, inhibió la producción de leucotrieno B4 en leucocitos peritoneales de rata y 12-HETE en plaquetas humanas, afectando solo ligeramente la actividad ciclooxigenasa. La fracción diclorometánica de Lithospermum erythrorhizon reduce el edema auricular inducido por TPA en oreja de ratón y el edema inducido por carragenina en pata de ratón. Los principios responsables de la actividad antiinflamatoria han sido identificados como los principios naftoquinónicos shikonina y sus derivados. El efecto farmacológico de la especie y del extracto está relacionado con las propiedades antioxidantes de los compuestos.La fracción diclorometánica de Forsythia suspensa posee propiedades antiinflamatorias. Los principios activos se han aislado e identificado como ácido oleanólico y ácido ursólico, cuya actividad había sido previamente demostrada.Trece diterpenoides derivados de la estructura ent-kaurano, se han aislado e identificado en las hojas de la especie Isodon xerophilus. Todos los derivados presentan los agrupamientos 6-hidroxi,16-en,18-ceto, lo que les confiere unas propiedades similares debidas a estos grupos reactivos. En general todos inhiben la liberación de nitritos en macrófagos murinos RAW 264.7. / In this work we studied medicinal plants used such as anti-inflammatory agents in skin diseases in both Chinese traditional medicine and other folk medicines. The species studies were Schinus molle, Lysimachia foenum-graecum, Lithospermum erythrorhizon, Forsythia suspensa and Isodon xerophilus.In all the cases, plant materials were extracted with the adequate solvents and fractioned with solvents of increased polarity. All the fractions were subjected to an analytical study, and the more representative of them were subjected to a pharmacological study. From the active fractions the principal compounds present were isolated and identified.Different experimental protocols of acute and chronic inflammation were used such as the chronic and acute mouse ear oedemas induced by 12-O-tetradecanoilforbol 13-acetate de (TPA), mouse paw oedema induced by carrageenan and phospholipase A2 (PLA2). Moreover, the cytotoxicity, inhibition of nitrite production, leukotriene B4 production and peptidic mediator production in different cells, as well the antioxidant activity, were tested. The most relevant results were: a) isolation and identification of two active triterpenes and a biflavanone from the dichloromethane extract of Schinus molle and study of their anti-inflammatory activity; b) isolation of five new saponins from Lysimachia foenum-graecum and study of their cytotoxicity and inhibition of leukotriene B4 production; c) determination of the antioxidant activity of extracts from Lithospermum erythrorhizon and principles from this species; d) isolation of two anti-inflammatory triterpenes from Forsythia suspensa and study of their antioxidant activity; and, e) isolation of fourteen diterpenoids from Isodon xerophilus and study of their cytotoxicity and inhibition on nitrite and TNF- production.

La presente Tesis Doctoral se ha centrado en el estudio de 5-O-desmetilnobiletina (DMN), aislado de Sideritis tragoricanum sp. mugronensis, y los iridoides derivados del catalpol denominados escrovalentinósido (SV) y escropoliósido A (SC), aislados de Scrophularia auriculata sp. valentina. La selección de estos tres principios se basó en los estudios previos realizados en los cuales se demostraron las propiedades en modelos experimentales de inflamación aguda.Como métodos experimentales in vivo se han desarrollado nuevos protocolos de inflamación aguda y crónica en ratón, como edema agudo en pata de ratón inducido por carragenina y fosfolipasa A2 (PLA2) y dermatitis en oreja de ratón inducida por aplicación repetida de 13-acetato de 12-O-tetradecanoilforbol (TPA). También se han desarrollado protocolos de hipersensibilidad retardada (DTH) inducida por oxazolona, dinitrofluorobenceno (DNFB) y eritrocitos de cordero (SRBC). En paralelo se han desarrolado diferentes técnicas in vitro para establecer el posible mecanismo de acción de los compuestos estudiados, entre las cuales destacamos la determinación de la citotoxicidad, inhibición de la producción de nitritos, prostaglandina E2, leucotrieno B4 (LTB4), así como de las enzimas que los liberan, interleucinas (IL), factor de necrosis tumoral (TNF) e interferón (IFN) en células aisladas. También se han desarrollado cultivos celulares de macrófagos RAW 264.7, neutrófilos y linfocitos humanos.Entre los resultados y conclusiones más destacables se pueden citar: A) DMN tiene propiedades antialérgicas en diferentes modelos experimentales de DTH, reduciendo la inflamación y la proliferación de linfocitos, afectando principalmente a la evolución del ciclo celular. Su efecto antiproliferativo está mediado por la inhibición de IL-1, IL-4, TNF-, IFN-, y especialmente IL-2. Además, DMN incrementa la producción de la citocina antiinflamatoria IL-10. La actividad antiinflamatoria in vivo se justifica por su efecto sobre el metabolismo del ácido araquidónico, disminuyendo la liberación de LTB4 por inhibición directa de la 5-LOX. B) SV y SC poseen propiedades antiinflamatorias frente a reacciones de DTH, inhibiendo la proliferación linfocitaria y la liberación de IL-1, IL-2, IL-4, TNF-, y especialmente IFN-. SC inhibe la activación del NF-B, lo que justifica la inhibición de la expresión de las enzimas óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y ciclooxigenasa-2 (COX-2). En el caso de SV dicho factor de transcripción no está directamente implicado, si bien también disminuye la actividad de las mencionadas enzimas proinflamatorias. / The aim of this Project is to examine the effect of 5-O-demethylnobiletin, isolated from Sideritis tragoricanum sp. mugronensis, and the two iridoids scrovalentinoside and scropolioside A, isolated from Scrophularia auriculata sp. pseudoauriculata on different experimental models of delayed-type hypersensitivity (DTH) and on acute and cronic inflammation to determine its effects on the mediators and enzymes implicated in these reactions.DMN reduced the oedema formation, cell infiltration, and tissue damage in the inflammation induced by TPA in mouse ears, along with the acute oedema induced by carrageenan in mouse paws and the acute PLA 2-induced oedema in mouse paws. DTH reactions induced by oxazolone, DNFB and SRBC were reduced by demethylnobiletin. The experimental results suggest that demethylnobiletin may act by reducing cell infiltration and by decreasing mediators such as interleukin-2, interleukin-4, tumour necrosis factor- and interferon-, and by concomitantly increasing the production of the anti-inflammatory cytokines such as interleukin-10. However, interleukin-1 was affected only a lower concentrations. Moreover, demethylnobiletin inhibited the proliferation of T cells and induced their apoptosis. In addition, while demethylnobiletin affected nitric-oxide production, it did not modify NOS-2 expression.The flavone inhibited leukotriene B 4 formation in rat neutrophils and elastase release in human neutrophils, prostaglandin E2 formation was inhibited but did not reduce the expression of cyclooxygenase-2 in murine RAW 264.7 macrophages.Scropolioside A and Scrovalentinoside showed anti-inflammatory properties against different experimental models of delayed-type hypersensitivity. Both iridoids reduced the oedema induced by oxazolone and by sheep red blood cells. The observed effect occurred during the last phase or inflammatory response; during the earlier phase or induction of the DTH reaction, no significant activity was noted. In vivo iridoids reduced both oedema formation and cell infiltration whereas in vitro they reduced the proliferation of activated T-lymphocytes affecting the cell cycle progression principally during the first 48h. Scropolioside A and Scrovalentinoside also inhibited the production of prostaglandin E2, leukotriene B4, nitric oxide, interleukin-1β, interleukin-2, interleukin-4, tumour necrosis factor-α and interferon-γ, but had no effect on the production of interleukin-10. Moreover, it modified the expression of both nitric oxide synthase-2 and cyclooxygenase-2, as well as the activation of nuclear factor-κB in RAW 264.7 macrophages in the case of Scropolioside A.

En el tratamiento de los procesos inflamatorios, no sólo tiene importancia conseguir una buena analgesia, sino poder controlar otros aspectos derivados de este proceso, como son el edema, la extravasación plasmática y la migración leucocitaria que caracterizan la zona inflamada. Si bien hasta el momento se conocen los mecanismos periféricos a través de los cuales los opioides inducen analgesia durante la inflamación, se desconoce el papel preciso del sistema opiode endógeno (SOE; ligandos endógenos y los receptores opioides) en la respuesta inflamatoria. Poco se sabe de la influencia que sobre el SOE ejercen los distintos mediadores liberados durante la respuesta inflamatoria desde estructuras anatómicas implicadas en ésta como son: las terminaciones nerviosas sensoriales, las fibras simpáticas postganglionares, las células inmunes, el endotelio vascular y los mastocitos, hecho que nos ha llevado a profundizar en el estudio del papel que desempeñan los opioides en la respuesta inflamatoria. La expresión de los RO así como su caracterización y función antinociceptiva está bien documentada, no sólo a nivel de SNC sino también en tejidos nerviosos periféricos y células inmunes. Por el contrario, su posible función antiinflamatoria no es tan conocida. Nuestra hipótesis plantea que la modulación opioide del edema y la extravasación plasmática, durante la respuesta inflamatoria aguda, se debe a la activación de RO periféricos y a las posibles interrelaciones que se establecen con otros sistemas endógenos, distintos al opioide e implicados en la inflamación. De los resultados obtenidos se concluye que edema y extravasación plasmática son variables inflamatoririas moduladas por mecanismos distintos, con una importante participación en la modulación de la extravasación de plasma de los opioides endógenos, principalmente las encefalinas. La administración sistémica de opioides m y d induce una respuesta bifásica sobre la extravasación plasmática, dosis-dependiente, de manera que se obtiene un efecto inhibidor a dosis iniciales para llegar a un máximo a partir del cual se recuperar nuevamente los niveles basales de exudado plasmático. El empleo de agonistas/antagonistas que no atraviesan la barrera hematoencefálica demuestra la participación de estructuras periféricas en la modulación de esta variable inflamatoria. Si bien el efecto final obtenido sobre la extravasación es el mismo tras la administración de agonistas m y d, el mecanismo de acción implicado en ello es distinto según el fármaco empleado. Mientras que morfina requiere de terminaciones simpáticas periféricas, receptores opioides d, H2 y H3 activados, fentanilo precisa interaccionar con los receptores opioides principalmente expresados en las terminaciones sensoriales nociceptivas, así como que los receptores H2 y H3 estén activados. No obstante, el bloqueo del H3 lleva a aumentar la formación de exudado plasmático hasta el doble de los valores basales. Los receptores d no requieren la acitvación del sistema histaminérgico para inducir su efecto antiexudativo, si bien, en situaciones en las se ha disminuído la población de fibras nociceptivas o simpáticas los porcentajes de inhibición varían. La participación del sistema inmune en una inflamación aguda periférica en cuanto a la modulación de la extravasación de plasma es irrelevante. / The objective in the treatment of inflammatory processes, is not only achieve a good analgesia, but also control another aspects derivated of this process, like edema, plasma extravasation and cells transmigration towards the injured tissue. To date the opioid peripheral analgesia mechanisms are well known, but not the antiinflammatory effects induced by these drugs. It does not known the influence of OES (opioid endogenous system: receptors (OR) and ligands) over the different mediators release during inflammatory response from: sensorial fibers, sympathetic postganglionar nerve terminals, inmune cells, vascular endothelium and mast cells. By this reason we have sudied in depth the role of opioids in the inflammatory response.The expression, distribution, characterization and function of OR in the nociceptive response is well documented, not only in mammalian central (CNS) but also in peripheral tissues, inmune and mast cells. Contrary, their possible antiinflammatory funcion is not as well as known. Our hipotesis establish that the opioid modulation of edema and plasma extravasation during acute inflammatory response it's due to the activation of peripheral opioid receptors and the relationships established among other endogenous systems, all the implicated in the inflammation. The results show that edema and plasma extravasation are modulated by different mechanisms, with a very important participation of enkephalins, like endogenous opioids, in the plasma extravasation modulation. The systemic administration of m and d opioids induce a biphasic dose-related inhibition of plasma extravasation. The effects of peripheral agonists/antagonists demostrate the participation of peripheral structures in the modulation of this inflammatory variable. The administration of m and d opioid agonists induce the same effect on the extravasation, although the implicated mechanism is different, according the drug used. While mophine requires sympathetic peripheral fibers, d-opioid, H2 and H3 activated receptors, fentanyl needs its interaction with opioid receptors expressed in the nociceptive fibers principally, and H2 and H3 receptors must be activated, also. However, the blockade of H3 receptor induces an increase on plasma exudated, twice basal value. d-receptors do not need the activation of histaminergic system for inducing their antiexudative effect, still when have been decreased nociceptive and simpathetic fibres we can see a variation on the inhibition percentages. The participation of the inmune system in the plasma extravasation modulation during an acute peripheral inflamation is irrelevant.

Els cossos d’inclusió bacterians (CIs) són dipòsits proteics que apareixen normalment durant el procés de producció de proteïna recombinant. Històricament, aquests agregats han estat classificats com a sub-productes de rebuig i, per tant, descartats. No obstant, aquesta percepció ha canviat al llarg de les dues darreres dècades. Nombrosos estudis han proporcionat evidències que demostren que aquestes partícules són, de fet, estructures supramoleculars formades per contactes estereoespecífics proteïna-proteïna, morfològicament i fisicoquímicament estables, fàcils de purificar i que mostren un alt nivell de plasticitat pel que fa a activitat biològica, mida i propietats fisicoquímiques. En el present treball s’ha explorat la possibilitat d’aprofitar les propietats úniques dels CIs per desenvolupar noves aplicacions biomèdiques. En aquest sentit, ens hem centrat en l’estudi de la idoneïtat dels CIs com a nanomaterial particulat per tal de generar nanotopografies capaces de controlar la resposta de cèl·lules animals. La modificació a nivell nanomètric de superfícies per tal d’estimular una resposta cel·lular específica resulta molt prometedora pels camps de l’enginyeria tissular i la medicina regenerativa en general. En aquest treball es presenten evidències de que els CIs es poden dipositar sobre superfícies de cultiu, obtenint nanotopografies modificades amb efecte biològic. Al cultivar cèl·lules de mamífer sobre aquestes, s’aprecia un elevada capacitat d’adhesió cel·lular. A més a més, s’ha observat que el CIs són capaços d’estimular la proliferació cel·lular mitjançant una cascada de senyalització basada en la mecanotransducció. Tant l’adhesió com la proliferació cel·lulars són factors crucials per la colonització de la superfície d’implants. S’ha demostrat també que les topografies formades per CIs són capaces de dirigir cèl·lules mare mesenquimals (MSCs) indiferenciades cap a osteoblasts. És important esmentar que l’adhesió, la proliferació i la diferenciació cel·lular mediades per CIs poden ser modulades per la correcta elecció del fons genètic de la soca utilitzada per a produir els CIs, obtenint d’aquesta manera agregats fisicoquímica i morfològicament diferents. Finalment els CIs han demostrat ser capaços d’alliberar quantitats significatives de la proteïna que els forma, en una versió activa. Aquest fet ha propiciat el seu estudi com plataforma d’entrega de fàrmacs proteics, des de nanoestructures de la superfície del substrat, cap als cultius diana. Aquesta darrera aplicació seria particularment interessant en tractaments a llarg termini, ja que el CIs proporcionarien un alliberament de la proteïna sostingut. A més, aquesta capacitat d’entrega afegiria un nivell extra de complexitat i control a les aplicacions prèviament esmentades ja que combinaria l’efecte mecànic de les topografies basades en CIs amb l’activitat biològica de la proteïna formadora de l’agregat. / Bacterial Inclusion Bodies (IBs) are protein deposits usually observed in recombinant bacteria during protein production processes. These aggregates have been historically regarded as waste by-products and therefore discarded. However, in the last two decades this perception has changed. Numerous studies have provided evidence that these particles are in fact supramolecular structures formed by stereospecific cross-molecular protein-protein interactions, morphologically and mechanically stable, easy to purify and highly tunable in terms of biological activity, size and physicochemical properties,. In the present work it has been explored to exploit appealing IB properties for biomedical applications. In this regard, we have focused on the suitability of IBs as particulate protein nanomaterial to produce engineered nanotopographies able to modulate mammalian cell responses. Nanomodification of scaffolds to stimulate a specific cell response is a promising field for tissue engineering and regenerative medicine. In this regard, we have provided evidence that bacterial IBs can be effectively deposited onto cell culture surfaces generating altered nanotopographies. These IB-based topographies, when used as cell culture substrate, exhibited higher capability for cell adhesion in four distinct cell lines. Moreover, IBs were shown to be able of actively stimulating cell proliferation through mechanotransductive events, being these two activities crucial for cell colonization of implant materials. On the other hand, it has been also proved how IB-based topographies are able to direct mesenchymal stem cells (MSCs) to osteogenesis. Noteworthy, cell adhesion, cell proliferation and cell differentiation can be controlled by the proper choice of Escherichia coli producing strain genetic background, rendering physicochemically and morphologically distinct IBs. Finally, IBs have been shown capable of releasing significant amounts of their forming protein, prompting their use as a delivery platform of therapeutic protein drugs, from nanostructured surfaces to cell cultures. This last application would be particularly appealing for long term treatments, since IBs provide a sustained release of their active component. Moreover, this delivery capacity adds an extra level of complexity and control to the previous mentioned IB applications, through the combination of the mechanical effect of the IB-based topographies with the biological activity of the IB-forming protein

Des de fa un parell de dècades s’ha establert una relació causa efecte entre l’estat inflamatori crònic de baixa intensitat que es presenta en obesitat i l’aparició de resistència a insulina i Diabetis Mellitus tipus 2 associades a aquesta patologia. Aquest estat inflamatori es caracteritza per la sobreproducció de citocines proinflamatòries com el TNF-α(factor de necrosi tumoral-α) o la interleucina 6 (IL-6), que són produïdes en gran mesura pel teixit adipós. Els Receptors Activats per proliferadors Peroxisòmics (PPAR) s'han proposat com a possibles dianes terapèutiques per al tractament i la prevenció del procés inflamatori i de la resistència a la insulina. D’aquests receptors nuclears el subtipus PPARβ/δ juga un paper important en la prevenció del procés inflamatori, ja que diversos estudis han demostrat que pot evitar la producció de IL-6 induïda per lipopolisacárid en el teixit adipós, i a més pot inhibir l’activació del factor de transcripció proinflamatori NF-κB. Per això, els objectiu d’aquesta tesi doctoral han estat, d'una banda, avaluar els efectes de l’obesitat i la inflamació sobre PPARβ/δ, i d’altra banda, conèixer si l’activació d’aquest receptor nuclear per GW501516 és capaç de prevenir la resistència a la insulina induïda per la via IL-6/STAT3/SOCS3 i els mecanismes implicats en adipòcits. Els resultats que es van obtenir a partir de mostres de teixit adipós humà indiquen que en presència d’obesitat hi ha un increment de citocines proinflamatòries (IL-6 i TNF-α) i de NF-κB, ambdós factors afavoreixen el procés inflamatori. Aquesta situació s’acompanyà d'una disminució de l’activitat de PPARβ/δ, la qual es va veure reflectida en la disminució dels gens diana d'aquest. Però l'activació de PPARβ/δ i la inhibició de NF-κB en estudis in vitro amb cèl•lules adiposes SGBS van ser capaços de revertir aquest efecte (Serrano-Marc L, BBA of Lipids, 2012). D'altra banda, estudis en ratolins i en cèl•lules 3T3-L1 van demostrar que l’activació de PPARβ/δ per GW501516 podria evitar l’aparició de resistència a la insulina inhibint l’activació de la via IL-6/STAT3/SOCS3 mitjançant dos mecanismes. L’activació del receptor nuclear va impedir la fosforilació en el residu de Tyr705 de STAT3 (Signal Transductor and Activator of transcription 3, un factor de transcripció) i d’aquesta manera va inhibir la unió de Hsp90 amb aquest (necessària per a queSTAT3 s’activi). D’altra banda, l’activació per GW501516 va impedir la fosforilació de la ERK1 / 2 (Extracellular Receptor Kinase 1/2) i d’aquesta manera es va evitar la fosforilació en el residu de Ser727 de STAT3, necessària per a la seva activació transcripcional. La inhibició del factor de transcripció STAT3 va implicar una disminució en els seus gens diana, entre ells SOCS3 (Supressor of Citokine Signaling 3), que és el responsable de la degradació d'IRS-1 (Insulin Receptro Substrate-1), proteïna essencial per donar resposta a la insulina (Serrano-Marco, L, Diabetis, 2011). / It has been established a causal link between the chronic inflammatory state of low intensity that occurs in obesity and the onset of insulin resistance and type 2 diabetes. This inflammatory condition is characterized by the overproduction of proinflammatory citokines such TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α) or interleukin 6 (IL-6), which are largely produced by the adipose tissue. The Peroxisomic Proliferator Activated Receptors (PPAR) have been proposed as potential therapeutic targets for the treatment and prevention of inflammation and insulin resistance. Of these nuclear receptors the subtype PPARβ/δ plays an important role in preventing the inflammatory process. Therefore, the objective of this work is, one hand, to evaluate the effects of inflammation in obesity and in PPARβ/δ; and secondly, to determine whether the activation of PPARβ/δ with GW501516 in adipocytes is capable of preventing insulin resistance induced through the IL-6/STAT3/SOCS3 pathway, and also the mechanisms involved. The results obtained from human adipose tissue samples show that in the presence of obesity there is an increase of proinflammatory cytokines (IL-6 and TNF-α) and of NF-κB. This was accompanied by a decrease in the PPARβ/δ activity. But the activation of PPARβ/δ and the inhibition of NF-κB in in vitro studies with SGBS adipose cells were able to reverse these effects (Serrano-Marco L, BBA of Lipids, 2012). Furthermore, studies in mice and in 3T3-L1 cells demonstrated that activation of PPARβ/δ by GW501516 could prevent the development of insulin resistance by inhibiting the activation of the IL-6/STAT3/SOCS3 pathway (Serrano-Marco L, Diabetes, 2011). Taking all these data together the final conclusion of this work is: PPARβ/δ is involved in the regulation of the chronic inflammatory state that links obesity and insulin resistance. Therefore, the activation of this nuclear receptor could prevent IL6 induced insulin resistance.

El text dels capítols 3, 5, 6 i 7 ha estat retirat seguint instruccions de l’autora de la tesi, en existir participació d’empreses, existir conveni de confidencialitat o existeix la possibilitat de generar patents / El texto delos capítulos 3,5, 6 y 7 ha sido retirado siguiendo instrucciones de la autora, al existir participación de empresas, convenio de confidencialidad o la posibilidad de generar patentes / The text of chapters 3, 5, 6 and 7 has been withdrawn on the instructions of the author, as there is participation of undertakings, confidentiality agreement or the ability to generate patent / Sphingolipids are essential biomolecules for the physiological cell function. In addition to its structural role in cell membranes, these lipids have also crucial functions in signal transduction and cell regulation. As a consequence of the important biological roles of sphingolipids, the synthesis of their analogs and the development of chemical inhibitors of sphingolipid enzymes are the object of current interest. Furthermore, it has been reported that slight modifications on the natural C1 (phyto)sphingosine scaffold or variations in its chain lengths can potentially alter the role and bioactivity of sphingolipid analogs. On the other hand, cyclitols are an important group of compounds due to their remarkable biological activities as well as their synthetic usefulness in the synthesis of other natural compounds or pharmaceuticals. Specially, the development of carbohydrate mimetics prompted primarily by their properties as glycosidase inhibitors, has led to a wide variety of novel structures by themselves or when considering them as key synthetic precursors of more complex molecules such as glycosphingolipids. For the above‐mentioned reasons, we developed a synthetic methodology towards sphingolipid analogs based on the regioselective ring‐opening reactions of N‐acylaziridines with different nucleophiles such as thiols or beta‐glycosil thiols, amines, phosphate derivatives or phosphorothioate derivatives. This approach is a short and flexible route for the synthesis of a variety of (phyto)sphingolipid analogs from aziridine derivatives and this method leads to molecules with different groups bonded to the C‐1 position of the sphingoid backbone from common intermediate aziridines by changing the nucleophile in the ring‐opening reaction step. Moreover, the diversity of compounds obtained is extended by introducing different N‐acyl groups at the nitrogen aziridine. Once, the desired sphingolipid analogs were obtained, a representative selection of them was tested in enzyme assays to identify inhibitors of mammalian sphingolipid metabolism enzymes, such as sphingomyelin synthase (SMS) and glucosylceramide synthase (GCS). Some of the tested analogs were potent inhibitors of GCS and none of them inhibited SMS at concentrations relevant for activity. In general, the inhibitory activity was higher for phytosphingosine analogs than their corresponding sphingosine analogs and the presence of the double bond between C4 and C5 of the sphingosine backbone in analogs was important for their bioactivity, since the dihydroceramide analogs were less active. In addition, a collection of (phyto)sphingolipid analogs were tested in an assay to identify inhibitors against yeast inositol phosphorylceramide synthase (IPCS). Generally, the inhibitory activities were lower than the inhibitions against GCS. However, one analog depicted selectivity against baker’s yeast IPCS since no inhibition of mammalian SMS and GCS was observed. For that reason, this analog showed potential properties as antifungal agent. Some (phyto)sphingolipid analogs were also tested as antigens for CD1d‐restricted iNKT cells and some of them were active, although this activity was lower when comparing with the endogenous glycolipid beta‐glucosylceramide. In particular, the most active compound was a nonglycosidic phytoceramide analog, but some glycosphingolipid analogs were also active in the activation of iNKT cells. However, these compounds were considered weak antigens. Finally, in order to obtain glycolipid analogs a synthetic methodology to obtain enantio‐ and diastereomerically pure galacto‐configured aziridines based on olefin aziridination reactions was examined. This consists in the use of nitrene precursors and a galactose related cyclohexene. The results obtained with this method showed potential for the preparation of the aziridine compounds. / Los esfingolípidos (SL) son biomoléculas esenciales para las funciones fisiológicas de las células. El metabolismo anómalo o la expresión de SL específicos o glicoesfingolípidos (GSL) es el origen de diferentes enfermedades como las esfingolipidosis, causadas por la presencia de mutaciones en las enzimas que intervienen en la biosíntesis de SL o GSL. Debido a la importancia biológica de los SL, el desarrollo de inhibidores químicos de las enzimas que intervienen en el metabolismo de los SL de mamíferos y hongos, es un tema de gran interés científico. Por otro lado, cabe remarcar que los ciclitoles son un tipo de compuestos muy interesantes debido a su remarcable actividad biológica y a su utilidad como precursores sintéticos de moléculas más complejas como los GSL. Teniendo en cuenta las consideraciones comentadas anteriormente, se ha desarrollado una nueva metodología sintética para la obtención de análogos de SLs basada en las reacciones de apertura de Nacilaziridinas con diferentes nucleófilos como tioles, beta‐glicosil tioles, aminas, fosfatos y fosforotioatos. Esta aproximación es una ruta corta y flexible para la obtención de análogos lipídicos con diversidad estructural. Una selección representativa de los compuestos sintetizados se ensayó frente a la inhibición de enzimas del metabolismo de los mamíferos tales como la esfingomielin sintasa (SMS) y la glucosilceramida sintasa (GCS), y enzimas del metabolismo de los hongos como la inositol fosforilceramida sintasa (IPCS). Algunos de estos análogos resultaron ser inhibidores potentes de la GCS pero ninguno de ellos fue inhibidor de la SMS. Mientras que la inhibición frente a la IPCS en levaduras fue más baja en comparación con la inhibición de la GCS. A pesar de ello, uno de los análogos ensayados mostró selectividad frente a la IPCS ya que no se observó inhibición de la SMS y la GCS de mamíferos, mostrando así propiedades interesantes como agente antifúngico. De manera adicional, algunos análogos de (fito)esfingolípidos fueron ensayados como antígenos de células iNKT restringidas por la proteína CD1d y resultaron activos. Curiosamente, el compuesto más activo resultó ser un análogo de fitoceramida no glicosídico, aunque otros GSL también resultaron activos. Por otro lado, se desarrolló una metodología sintética para obtener aziridinas con configuración galacto (análogos de galactosa) enantiomericamente y diastereomericamente puras para obtener análogos de glicolípidos.

El estudio de la diversidad biológica es esencial para su adecuada conservación. En la naturaleza podemos encontrar la fuente de productos de variada índole, como en el caso del desarrollo de fármacos, ámbito en el cual los productos naturales tienen un papel fundamental. En ocasiones los principios activos de origen natural son el tratamiento de elección para ciertas enfermedades. Un claro ejemplo de ello es la galantamina, un alcaloide biosintetizado exclusivamente por plantas de la familia Amaryllidaceae con la capacidad de inhibir la enzima acetilcolinesterasa, que se comercializa para el tratamiento paliativo de la enfermedad de Alzheimer. Las plantas de la familia Amaryllidaceae (subfam. Amaryllidoideae) se encuentran ampliamente distribuidas en Sudáfrica, la región andina, el área Mediterránea y el Cáucaso. Muchas especies de esta familia constituyen endemismos y son muy vulnerables. Los principales marcadores químicos son sus alcaloides exclusivos, cuyo estudio resulta de gran interés debido a que presentan un amplio rango de actividades biológicas como anticolinesterásicos, antiparasitarios, antitumorales, antifúngicos, etc. El objetivo principal del presente trabajo ha sido la bioprospección de especies de la familia Amaryllidaceae del área mediterránea e iberoamericana, analizando sus alcaloides, con el fin último de aprovechar estos recursos para la obtención de productos farmacológicamente activos. La metodología ha incluido la combinación de numerosas técnicas espectroscópicas y cromatográficas, entre las que se destacan RMN y GC-MS. Los resultados están reflejados en cuatro artículos científicos que se pueden agrupar en tres secciones: 1- Aislamiento y caracterización de alcaloides de Narcissus serotinus L., una especie del área Mediterránea a partir de la cual se logró la identificación y elucidación estructural de ocho alcaloides nuevos: narseronina, 1-O-(3´-acetoxibutanoil)licorina, 3-O-metilnarcisidina, 1-O-acetil-3-O-metilnarcisidina, 1-O-acetil-3-O-metil-6-oxonarcisidina, 2-metoxipratosina, 11-hidroxigalantina y 2-O-metilclivonina, además de identificar otros compuestos conocidos mediante GC-MS. La caracterización de narseronina permitió la reconsideración de una estructura incorrecta publicada previamente por otro grupo de investigación. Todos los alcaloides detectados pertenecen a las series licorina y homolicorina. 2- Estudio de los narcisos pertenecientes a la sección Ganymedes, el cual consistió en la caracterización del contenido de alcaloides de la especie N. triandrus L., así como la realización de un análisis por GC-MS del perfil de alcaloides de 18 poblaciones silvestres recolectadas en la península ibérica, abarcando todos los taxones de la sección. En todos los casos se identificaron componentes de tipo mesembrano, estructuras características del género Sceletium de Sudáfrica e inusuales en la familia Amaryllidaceae. Además, se reporta la elucidación estructural de 3 nuevos compuestos: 2-oxomesembrenona, 7,7a-dehidromesembrenona y 2-oxoepimesembranol. 3- Análisis de amarillidáceas argentinas como fuente de compuestos bioactivos, en el que se determina por primera vez el contenido de alcaloides de cuatro especies silvestres recolectadas en la región andina: Habranthus jamesonii, Phycella herbertiana, Rhodophiala mendocina y Zephyranthes filifolia. Además, se ha ensayado la actividad biológica de los extractos de dichas plantas como inhibidores de la enzima acetilcolinesterasa. Este trabajo en su conjunto demuestra una vez más el gran potencial de las especies de la familia Amaryllidaceae (subfam. Amaryllidoideae) como fuente de productos bioactivos y alcaloides con estructuras novedosas, confirmando la importancia de promover la continua caracterización de especies que aún no han sido exploradas. / The study of biodiversity is essential for conservation. Nature provides a variety of useful resources, for instance, natural products still play a major role in drug development. Plants belonging to the Amaryllidaceae family (subfam. Amaryllidoideae) are characterized by the presence of an exclusive group of alkaloids showing a wide range of biological activities. The aim of the present work has been to bioprospect among the diverse plant species of the family Amaryllidaceae found in the Mediterranean and Iberoamerican areas by analyzing their alkaloids, with the ultimate goal of using this information to obtain pharmacologically active compounds. In general, the methodology comprised a combination of spectroscopic and chromatographic techniques, mainly NMR and GC-MS. The results have been exposed in four scientific papers and can be divided in three main sections: 1- Isolation and characterization of alkaloids from Narcissus serotinus L., a Mediterranean species from which 8 new compounds have been identified: narseronine, 1-O-(3´-acetoxybutanoyl)lycorine, 3-O-methylnarcissidine, 1-O-acetyl-3-O-methylnarcissidine, 1-O-acetyl-3-O-methyl-6-oxonarcissidine, 2-methoxypratosine, 11-hydroxygalanthine and 2-O-methylclivonine. Additionally, other known alkaloids were recognized by GC-MS. 2- Study of daffodils belonging to the section Ganymedes, including the characterization of the alkaloid content of N. triandrus L., as well as a GC-MS analysis of the alkaloid profile of 18 wild populations from the Iberian Peninsula, comprising all the taxa of the section. The results revealed the presence of mesembrane alkaloids, typical compounds of the genus Sceletium and unusual within the Amaryllidaceae family. 3- Analysis of Argentinian Amaryllidaceae as a source of bioactive compounds. The alkaloid content of four wild species, Habranthus jamesonii, Phycella herbertiana, Rhodophiala mendocina and Zephyranthes filifolia, is reported for the first time, together with evaluation of the biological activity of their extracts as inhibitors of the acetylcholinesterase enzyme. This study as a whole demonstrates once again the great potential of plant species of the Amaryllidaceae family (subfam. Amaryllidoideae) as a source of bioactive compounds and alkaloids with novel structures, confirming the importance of promoting the continuous characterization of unexplored species.

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